专利名称：用产朊圆酵母菌在诱导培养基中生产尿酸酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产尿酸酶的方法，特别是一种用产朊圆酵母菌在诱导培养基中生产尿酸酶的方法。
背景技术：
尿酸酶(Urate Oxidase，Uricase；E.C1.7.3.3)，又名尿酸氧化酶，是生物体内嘌呤代谢途径中的一种酶，它以氧作为受体，将尿酸中的嘌呤环打开从而氧化生成尿囊素，二氧化碳和过氧化氢。大多数生物体在嘌呤代谢中都产生尿酸，许多微生物能够直接将尿酸分解而排除体外，而鸟类、爬行类和包括人类的灵长类动物缺乏尿酸酶，以尿酸作为最终产物排出。该酶因其高特异性和灵敏度被广泛地应用，可用作药物帮助减少有毒尿酸的积累，尤其在医学上用于测定尿酸浓度，作为诊断和治疗痛风症等疾病的重要指标。
目前，国内对于尿酸酶的研究较少，日本TOYOBO等国外公司已经在生产同类产品。
发明内容
鉴于尿酸酶广泛的应用前景有必对其进行深入研究。本发明的目的是探索一种能够使尿酸酶的分离纯化效率、纯度、比活都大大提高、在产品活性和纯化工艺上均优于国内外现有工艺的生产尿酸酶的方法。
本发明提供的用产朊圆酵母菌在诱导培养基中生产尿酸酶的方法实现了上述目的。本发明将产朊圆酵母菌置于培养基种生长，并在生长过程中收集产生的尿酸酶，其特征在于一、菌株采用产朊圆酵母2.281；二、培养基组分及各组分的重量百分比斜面培养基(％)牛肉膏0.1-0.5，蛋白胨0.5-2.0，氯化钠0.2-0.8，琼脂1.5-3.0种子培养基(％)牛肉膏0.1-0.5，蛋白胨0.5-2.0，氯化钠0.2-0.8
液体发酵培养基(％)蔗糖1.5-4.0，酵母膏0.2-2.0，蛋白胨0.5-2.0，氯化钾0.05-0.1，尿酸0.05-0.07三、培养条件菌株在25-30℃斜面培养基上培养24-30小时，接入种子培养基，25-30℃，200转/分钟，振荡24-36小时活化，随后于三角瓶中培养，将种子液按10％比例接入液体发酵培养基中，每瓶含100毫升培养液，27-30℃，200转/分钟，培养18-24小时，收集发酵培养液，经4,000转/分钟，离心5分钟，收集菌体；四、菌体破碎将发酵液按照5000转/分钟，离心10分钟，收集菌体，用生理盐水洗涤两次，称取菌体湿重，并按重量/体积＝1∶4的比例悬浮在50摩尔pH8.5硼酸-硼砂缓冲液中，冰浴条件下超声波50kHz，600W，破碎3次，每次破碎5秒，间隙3秒，持续30分钟，破碎液于4℃下离心12000转/分钟，离心15分钟，弃沉淀，得到粗级抽提液；六、分离纯化①聚乙二醇-硫酸铵双水相体系萃取体系组成25％(m/m)聚乙二醇1000，9％(m/m)(NH4)2SO4，2％(m/m)NaCl，pH7.5，尿酸酶在上相的收率为93％，分配系数为1.22，纯化为15倍；②二乙基氨基乙基-纤维素-52层析柱规格5.0cm×7.0cm，用pH8.5 20.0摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液充分平衡，上样流速1.5毫升/分钟，上样毕，用同样缓冲液流速4.0毫升/分钟洗杂蛋白，然后以0～0.3摩尔NaCl pH8.520毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸进行直线梯度洗脱，流速2.0毫升/分钟，检测，收集酶活性峰部分；③黄嘌呤-琼脂糖亲和层析层析柱床体积1.0ml，用含0.5毫摩尔乙二胺四乙酸，2毫摩尔α-巯基乙醇，pH8.5 50.0摩尔硼酸缓冲液充分平衡，样品上柱后，用含0.05摩尔NaCl的上述平衡缓冲液充分洗脱杂蛋白，然后用含0.5毫摩尔尿酸pH8.5 50.0毫摩尔硼酸缓冲液洗脱，流速10.0毫升/小时，收集酶活性峰部分，即得本发明所说的尿酸酶。
采用本方法所获得的尿酸酶的技术常数如下比活＞18.0国际单位/毫克纯化倍数＞409.0回收率 ＞19.2％还原/非还原十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳单一蛋白着色带高压液相色谱显示纯度大于98％高压液相和葡聚糖凝胶G200层析1.27×105Da还原条件十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 3.3×104DapI 6.8～7.5最适pH 8.5pH稳定范围 7.0～12.0最适温度37.0℃最适pH和温度条件下 Km值＝3.34×10-5mol/L本技术主要在于利用分离得到的产朊圆酵母菌，促使菌体在含有尿酸的诱导培养基中生长，并在此过程中产生尿酸酶。在菌体培养过程中采用高维系统分析法找出影响培养的主要因素，找到菌种培养的最佳条件(如培养基配方、温度、酸碱度、采酶时间等)并通过调节关键因素，在较短时间内获得最优化结果。较之其它优化方法，此技术具有效率高、优化后的条件可靠而稳定等优点。应用该技术所得到的尿酸酶利用本方法所获得的尿酸酶纯品与日本TOYOBO等国外公司同类产品相比，在分子量、亚基组成、底物亲和性、最适反应温度和最适反应pH、温度和pH稳定性等方面具有相似的性质，但等电点有较大差异，反应出不同来源的尿酸酶在种属上的差异。本发明利用这些差异及与黄嘌呤具有与尿酸相同的结构这一性质，使尿酸酶特异地与介质结合，使尿酸酶的分离纯化效率和纯度都大为提高，一步纯化倍数提高到16倍，与来源于豆科植物和真菌夏孢子的尿酸酶具有相同的特异活性，结构上也高度保守。通过本方法纯化的尿酸酶比活达到18U/mg，在产品活性和纯化工艺上均优于国内外现有工艺，因此具有很好的应用价值。
具体实施例方式
实施例1一、菌株的培养(重量百分比)斜面培养基(％)牛肉膏0.5，蛋白胨2.0，氯化钠0.8，琼脂3.0。
种子培养基(％)牛肉膏0.5，蛋白胨2.0，氯化钠0.8。
液体发酵培养基(％)蔗糖4.0，酵母膏2.0，蛋白胨2.0，氯化钾0.1，尿酸0.07。
菌株在30℃斜面培养基上培养30小时，接入种子培养基，30℃，200转/分钟，振荡培养36小时。将种子液按10％比例接入液体发酵培养基中，30℃，200转/分，培养24小时。
二、菌体破碎将发酵液按照5000转/分钟，离心10分钟，收集菌体，用生理盐水洗涤两次。称取菌体湿重，并按重量/体积＝1∶4的比例悬浮在50毫摩尔pH8.5硼酸-硼砂缓冲液中，冰浴条件下超声波50kHz，600W破碎3次，每次破碎5秒，间隙3秒，持续30分钟，破碎液于4℃下离心12000转/分钟，离心15分钟，弃沉淀，得到粗级抽提液。
三、尿酸酶的分离纯化①聚乙二醇-硫酸铵双水相体系萃取双水相组成25％(m/m)聚乙二醇1000，9％(m/m)(NH4)2SO4，2％(m/m)NaCl，pH7.5，尿酸酶在上相。
②二乙基氨基乙基-纤维素-52层析柱规格5.0cm×7.0cm，用pH8.5 20.0毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液充分平衡，上样流速1.5毫升/分钟，上样毕，用同样缓冲液流速4.0毫升/分钟洗杂蛋白，然后以0～0.3摩尔NaCl，pH8.5 20毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液进行直线梯度洗脱，流速2.0毫升/分钟，通过检测，收集酶活性峰部分；③黄嘌呤-琼脂糖亲和层析层析柱床体积1.0ml，用含0.5毫摩尔乙二胺四乙酸，2毫摩尔α-巯基乙醇的pH8.5 50.0毫摩尔硼酸缓冲液充分平衡。样品上柱后，用含0.05毫摩尔NaCl的上述平衡缓冲液充分洗脱杂蛋白。然后用含0.5毫摩尔尿酸pH8.5 50.0毫摩尔硼酸缓冲液洗脱，流速10.0毫升/小时。收集酶活性峰部分，即得本发明所说的尿酸酶。
实施例2斜面培养基(％)牛肉膏0.1，蛋白胨0.5，氯化钠0.2，琼脂1.5。
种子培养基(％)牛肉膏0.1，蛋白胨0.5，氯化钠0.2。
液体发酵培养基(％)蔗糖1.5，酵母膏0.2，蛋白胨0.5，氯化钾0.05，尿酸0.05。
菌株在25℃斜面培养基上培养24小时后，接入种子培养基，25℃，200转/分钟，振荡培养18小时。将种子液按10％比例接入发酵培养基中，30℃，200转/分钟，培养18小时。
其它过程同实施例1。
实施例3斜面培养基(％)牛肉膏0.3，蛋白胨1.2，氯化钠0.4，琼脂2.5。
种子培养基(％)牛肉膏0.3，蛋白胨1.0，氯化钠0.5。
液体发酵培养基(％)蔗糖3.0，酵母膏1.2，蛋白胨1.0，氯化钾0.07，尿酸0.06。
菌株在28℃斜面培养基上培养20小时后，接入种子培养基，28℃，200转/分钟，培养20小时。将种子液按10％比例接入发酵培养基中，28℃，200转/分钟，培养20小时。
其它过程同实施例1。
实施例4斜面培养基(％)牛肉膏0.4，蛋白胨1.5，氯化钠0.4，琼脂2.5。
种子培养基(％)牛肉膏0.5，蛋白胨0.5，氯化钠0.2。
液体发酵培养基(％)蔗糖2.0，酵母膏1.5，蛋白胨2.0，氯化钾0.08，尿酸0.07。
菌株在29℃斜面培养基上培养23小时后，接入种子培养基，29℃，200转/分钟，培养23小时。将种子液按10％比例接入发酵培养基中，29℃，转/分钟，培养23小时。
其它过程同实施例1。
权利要求
1.用产朊圆酵母菌在诱导培养基中生产尿酸酶的方法，利用产朊圆酵母菌在培养基种生长，并在生长过程中收集产生的尿酸酶，其特征在于一、菌株采用产朊圆酵母2.281；二、培养基组分及各组分的重量百分比斜面培养基牛肉膏0.1-0.5，蛋白胨0.5-2.0，氯化钠0.2-0.8，琼脂1.5-3.0种子培养基牛肉膏0.1-0.5，蛋白胨0.5-2.0，氯化钠0.2-0.8液体发酵培养基蔗糖1.5-4.0，酵母膏0.2-2.0，蛋白胨0.5-2.0，氯化钾0.05-0.1，尿酸0.05-0.07三、培养条件菌株在25-30℃斜面培养基上培养24-30小时，接入种子培养基，25-30℃，200转/分钟，振荡24-36小时活化，随后于三角瓶中培养，将种子液按10％比例接入液体发酵培养基中，每瓶含100毫升培养液，27-30℃，200转/分钟，培养18-24小时，收集发酵培养液，经4,000转/分钟，离心5分钟，收集菌体；四、菌体破碎将发酵液按照5000转/分钟，离心10分钟，收集菌体，用生理盐水洗涤两次，称取菌体湿重，并按重量/体积＝1∶4的比例悬浮在50摩尔pH8.5硼酸-硼砂缓冲液中，冰浴条件下超声波50kHz，600W，破碎3次，每次破碎5秒，间隙3秒，持续30分钟，破碎液于4℃下离心12000转/分钟，离心15分钟，弃沉淀，得到粗级抽提液；五、分离纯化①聚乙二醇-硫酸铵双水相体系萃取体系组成25％m/m聚乙二醇1000，9％m/m(NH4)2SO4，2％m/mNaCl，pH7.5，尿酸酶在上相的收率为93％，分配系数为1.22，纯化为15倍；②二乙基氨基乙基-纤维素-52层析柱规格5.0cm×7.0cm，用pH8.5 20.0摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液充分平衡，上样流速1.5毫升/分钟，上样毕，用同样缓冲液流速4.0毫升/分钟洗杂蛋白，然后以0～0.3摩尔NaClpH8.520毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸进行直线梯度洗脱，流速2.0毫升/分钟，检测，收集酶活性峰部分；③黄嘌呤-琼脂糖亲和层析层析柱床体积1.0ml，用含0.5毫摩尔乙二胺四乙酸，2毫摩尔α-巯基乙醇，pH8.5 50.0摩尔硼酸缓冲液充分平衡，样品上柱后，用含0.05摩尔NaCl的上述平衡缓冲液充分洗脱杂蛋白，然后用含0.5毫摩尔尿酸pH8.5 50.0毫摩尔硼酸缓冲液洗脱，流速10.0毫升/小时，收集酶活性峰部分，即得本发明所说的尿酸酶。
全文摘要
本发明是用产朊圆酵母菌在诱导培养基中生产尿酸酶的方法。培养基各组分的重量百分比及条件斜面培养基(％)牛肉膏0.1－0.5，蛋白胨0.5－2.0，氯化钠0.2－0.8，琼脂1.5－3.0；种子培养基牛肉膏0.1－0.5，蛋白胨0.5－2.0，氯化钠0.2－0.8；液体发酵培养基(％)蔗糖1.5－4.0，酵母膏0.2－2.0，蛋白胨0.5－2.0，氯化钾0.05－0.1，尿酸0.05－0.07。菌株经斜面培养，种子培养，液体发酵培养，收集菌体，采用聚乙二醇－硫酸铵双水相萃取和两步层析纯化即得到磷酸甘油氧化酶。
文档编号C12N9/02GK101070522SQ200710049089
公开日2007年11月14日 申请日期2007年5月14日 优先权日2007年5月14日
发明者孟延发, 王腾 申请人:孟延发, 王腾