专利名称：用诱导培养基链球菌制备磷酸甘油氧化酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产氧化酶的方法，特别是一种用诱导培养基生产磷酸甘油氧化酶的方法。
背景技术：
血清中甘油三酯的含量被确认为是高血脂和心脏病的临床诊断中一个重要指标。磷酸甘油氧化酶法测定甘油三酯含量，具有高度特异性、微量、简便、快速和实现仪器自动化测定等优点，而曾被中华医学会检验分会推荐作为临床实验室测定血清甘油三酯的常规方法[1，2]。磷酸甘油氧化酶(L-a-Glycerophosphate Oxidase，GPO，EC 1.1.3.21)，又名甘油磷酸氧化酶，是甘油三酯试剂盒测定反应中最后一个酶，要求它具有更高的专一性、酶活性和比活性。目前国内对此酶的研究和开发报道极少。1997年中国科学院微生物研究所冯咏梅等报道了磷酸甘油氧化酶的菌种选育及发酵条件的研究，此后未见相关方面的研究报道。也无商品酶制剂出售。
发明内容
本发明的目的是提供一种将利用分离得到的链球菌Streptococcus SP.在菌体培养过程中找到菌种培养的最佳条件，并利用此培养生产过程得到可显著提高产酶量和酶的稳定性的甘油磷酸氧化酶的方法。
本发明是一种用诱导培养基生产磷酸甘油氧化酶的方法，将利用分离得到的链球菌置于含有甘油的诱导培养基中培养，经分离纯化得到甘油磷酸氧化酶，其特征在于一、链球菌株的培养基组成重量百分比斜面诱导培养基酵母提取物0.5-2.5，蛋白胨1.0-2.0，葡萄糖0.05-0.5，磷酸氢二钾0.2-0.8，甘油0.1-0.5，琼脂1.5-3.0，硫酸镁4，氯化锰1，氯化钠20，pH6.8的混合盐溶液0.1-0.4毫升；种子培养基酵母提取物0.5-2.5，蛋白胨1.0-2.0，葡萄糖0.1-0.8，磷酸氢二钾0.2-0.8，甘油0.1-0.5，硫酸镁4，氯化锰1，氯化钠20，pH6.8的混合盐溶液0.1-0.4毫升；发酵培养基酵母提取物0.5-2.5，蛋白胨1.0-2.0，磷酸氢二钾0.5-2.0，甘油0.1-0.5，硫酸镁4，氯化锰1，氯化钠20，pH6.8的混合盐溶液0.1-0.4毫升；二、菌株的培养条件菌株在25-32℃斜面培养基上培养18-28小时后，接入种子培养基，25-32℃振荡，200转/分钟，培养18-24小时，将种子液按5-10％比例接入发酵培养基中，25-32℃，200转/分钟，旋转摇床上培养18-28小时；三、将上述条件下培养的菌液按照以下条件进行分离纯化聚乙二醇-硫酸铵双水相体系萃取在4℃，将发酵液10,000转/分钟，离心10分钟，收集菌体，用20毫摩尔pH7.5三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液洗涤菌体3次，按1克菌体加入4毫升pH7.5三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的比例悬浮菌体，在低温，50kHz，600W超声波破碎，破碎3次，每次破碎3秒，间隙2秒，5分钟/次，持续15分钟，破碎液于4℃下，12,000转/分钟，离心5分钟，收集破碎液上清，测定蛋白质含量。然后进行双水相体系萃取。双水相组成在16.5％聚乙二醇2000，13.2％(NH4)2SO4，pH7.5，磷酸甘油氧化酶在上相的收率为90％，分配系数为1.0，纯化倍数为7倍；二乙基氨基乙基-琼脂糖凝胶FF柱层析用pH750.0毫摩尔三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液充分平衡柱，上样，用同样缓冲液洗杂蛋白，然后以0～0.5摩尔NaCl，pH750毫摩尔三羟基甲基氨基甲烷-盐酸进行直线梯度洗脱，分步收集，通过检测，收集酶活性峰部分；黄素腺嘌呤二核苷酸-琼脂糖凝胶亲合柱层析层析柱床体积5.0毫升，用3毫摩尔α-巯基乙醇的pH750.0毫摩尔硼酸缓冲液充分平衡，样品上柱后，用含上述平衡缓冲液充分洗脱杂蛋白，然后用含黄素腺嘌呤二核苷酸的pH750.0毫摩尔硼酸缓冲液洗脱，收集酶活性峰部分。
本发明通过大量科学试验，在实践中不断总结、提高，给出了培养基配方、温度、酸碱度、采酶时间等关键工艺技术，本方法具有产酶量高、酶的稳定性好、酶的提取和分离纯化过程简化等优点。
具体实施例方式实施例1、一、制作培养基(重量百分比)斜面诱导培养基(％)酵母提取物2.5，蛋白胨2.0，葡萄糖0.5，磷酸氢二钾0.8，甘油0.5，琼脂3.0，硫酸镁4，氯化锰1，氯化钠20，pH6.8的混合盐溶液0.4毫升；种子培养基(％)酵母提取物2.5，蛋白胨2.0，葡萄糖0.8，磷酸氢二钾0.8，甘油0.5，硫酸镁4，氯化锰1，氯化钠20，pH6.8的混合盐溶液0.4毫升；发酵培养基(％)酵母提取物2.5，蛋白胨2.0，磷酸氢二钾2.0，甘油0.5，硫酸镁4，氯化锰1，氯化钠20，pH6.8的混合盐溶液0.4毫升；二、培养菌株将菌株置于32℃斜面培养基上培养28小时后，接入种子培养基，32℃，200转/分钟，振荡培养24小时。将种子液按10％比例接入发酵培养基中，32℃，200转/分钟，旋转摇床上培养28小时。
三、菌体破碎将发酵液按照5000转/分钟，离心10分钟，收集菌体，用生理盐水洗涤两次。称取菌体湿重，并按重量/体积＝1∶4的比例悬浮在50毫摩尔pH8.5硼酸-硼砂缓冲液中，冰浴条件下超声波50kHz，600W破碎3次，每次破碎5秒，间隙3秒，持续30分钟，破碎液于4℃下离心12000转/分钟，离心15分钟，弃沉淀，得到粗级抽提液。
四、将上述条件下培养的菌液按照以下条件进行分离纯化聚乙二醇-硫酸铵双水相体系萃取按1克菌体加5毫升pH8.5 50.0毫摩尔三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，加适量溶菌酶悬浮菌体，超声波破碎3分钟，2～4℃。破碎液经12,000转/分钟，离心10分钟，收集上清，测定蛋白质含量。然后进行双水相体系萃取。
二乙基氨基乙基-琼脂糖凝胶FF柱层析柱规格2.6cm×7.0cm，用pH7 50.0毫摩尔三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液充分平衡。上样流速1.5毫升/分钟，上样毕，用同样缓冲液流速4.0毫升/分钟洗杂蛋白。然后以0～0.5摩尔NaCl，pH7 50毫摩尔三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液进行直线梯度洗脱，流速2.0毫升/分钟。通过检测，收集酶活性峰部分。
黄素腺嘌呤二核苷酸-琼脂糖凝胶亲和层析层析柱床体积5.0毫升，用3毫摩尔α-巯基乙醇的pH7 50.0毫摩尔硼酸缓冲液充分平衡。样品上柱后，用含上述平衡缓冲液充分洗脱杂蛋白。然后用含黄素腺嘌呤二核苷酸的pH7 50.0毫摩尔硼酸缓冲液洗脱，流速10.0毫升/小时，收集酶活性峰部分。
实施例2一、制作培养基(％)斜面诱导培养基酵母提取物0.5，蛋白胨1.0，葡萄糖0.05，磷酸氢二钾0.2，甘油0.1，琼脂1.5，硫酸镁4，氯化锰1，氯化钠20，pH6.8的混合盐溶液0.1毫升；种子培养基酵母提取物0.5，蛋白胨1.0，葡萄糖0.1，磷酸氢二钾0.2，甘油0.1，硫酸镁4，氯化锰1，氯化钠20，pH6.8的混合盐溶液0.1毫升；发酵培养基酵母提取物0.5，蛋白胨1.0，磷酸氢二钾0.5，甘油0.1，硫酸镁4，氯化锰1，氯化钠20，pH6.8的混合盐溶液0.1毫升；二、培养菌株菌株在25℃斜面培养基上培养18小时后，接入种子培养基，25℃，200转/分钟，振荡培养18小时。将种子液按10％比例接入发酵培养基中，25℃，200转/分钟旋转摇床上培养18小时。
三、将上述条件下培养的菌液按照以下条件进行分离纯化分离纯化与实施例1相同。
实施例3一、制作培养基(％)斜面诱导培养基酵母提取物1.0，蛋白胨1.5，葡萄糖0.25，磷酸氢二钾0.5，甘油0.12，琼脂2.0，硫酸镁4，氯化锰1，氯化钠20，pH6.8的混合盐溶液0.2毫升；种子培养基酵母提取物0.5，蛋白胨1.0，葡萄糖0.5，磷酸氢二钾0.5，甘油0.1，硫酸镁4，氯化锰1，氯化钠20，pH6.8的混合盐溶液0.2毫升；发酵培养基酵母提取物0.5，蛋白胨1.0，磷酸氢二钾2.0，甘油0.1，硫酸镁4，氯化锰1，氯化钠20，pH6.8的混合盐溶液0.2毫升；二、培养菌株菌株在30℃斜面培养基上培养22小时后，接入种子培养基，30℃200转/分钟，培养20小时。将种子液按10％比例接入发酵培养基中，30℃，200转/分钟，旋转摇床上培养22小时。
三、将上述条件下培养的菌液按照以下条件进行分离纯化分离纯化与实施例1相同。
实施例4一、制作培养基(％)斜面诱导培养基酵母提取物0.5，蛋白胨2.0，葡萄糖0.3，磷酸氢二钾0.4，甘油0.5，琼脂2.0，硫酸镁4，氯化锰1，氯化钠20，pH6.8的混合盐溶液0.3毫升；种子培养基酵母提取物2.0，蛋白胨2.0，葡萄糖0.3，磷酸氢二钾0.6，甘油0.5，硫酸镁4，氯化锰1，氯化钠20，pH6.8的混合盐溶液0.2毫升；发酵培养基酵母提取物2.3，蛋白胨1.4，磷酸氢二钾1.0，甘油0.4，硫酸镁4，氯化锰1，氯化钠20，pH6.8的混合盐溶液0.4毫升；二、培养菌株菌株在30℃斜面培养基上培养18小时后，接入种子培养基，30℃，200转/分钟，振荡培养24小时。将种子液按5-10％比例接入发酵培养基中，30℃，200转/分钟，旋转摇床上培养24小时。
三、将上述条件下培养的菌液按照以下条件进行分离纯化分离纯化与实施例1相同。
按照本发明方法制备的磷酸甘油氧化酶经检测，结果如下比活18.0-20.0国际单位/毫克纯化倍数＞200.0回收率 ＞22％
高压液相色谱显示 纯度大于98％还原/非还原条件下，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳单一蛋白着色带。
权利要求
1.用诱导培养基链球菌制备磷酸甘油氧化酶的方法，将利用分离得到的链球菌置于含有甘油的诱导培养基中培养，经分离纯化得到甘油磷酸氧化酶，其特征在于一、链球菌株的培养基组成重量百分比斜面诱导培养基酵母提取物0.5-2.5，蛋白胨1.0-2.0，葡萄糖0.05-0.5，磷酸氢二钾0.2-0.8，甘油0.1-0.5，琼脂1.5-3.0，硫酸镁4，氯化锰1，氯化钠20，pH6.8的混合盐溶液0.1-0.4毫升；种子培养基酵母提取物0.5-2.5，蛋白胨1.0-2.0，葡萄糖0.1-0.8，磷酸氢二钾0.2-0.8，甘油0.1-0.5，硫酸镁4，氯化锰1，氯化钠20，pH6.8的混合盐溶液0.1-0.4毫升；发酵培养基酵母提取物0.5-2.5，蛋白胨1.0-2.0，磷酸氢二钾0.5-2.0，甘油0.1-0.5，硫酸镁4，氯化锰1，氯化钠20，pH6.8的混合盐溶液0.1-0.4毫升；二、菌株的培养条件菌株在25-32℃斜面培养基上培养18-28小时后，接入种子培养基，25-32℃振荡，200转/分钟，培养18-24小时，将种子液按5-10％比例接入发酵培养基中，25-32℃，200转/分钟，旋转摇床上培养18-28小时；三、将上述条件下培养的菌液按照以下条件进行分离纯化聚乙二醇-硫酸铵双水相体系萃取在4℃，将发酵液10,000转/分钟，离心10分钟，收集菌体，用20毫摩尔pH7.5三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液洗涤菌体3次，按1克菌体加入4毫升pH7.5三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的比例悬浮菌体，在低温，50kHz，600W超声波破碎，破碎3次，每次破碎3秒，间隙2秒，5分钟/次，持续15分钟，破碎液于4℃下，12,000转/分钟，离心5分钟，收集破碎液上清，测定蛋白质含量。然后进行双水相体系萃取。双水相组成在16.5％聚乙二醇2000，13.2％(NH4)2SO4，pH7.5，磷酸甘油氧化酶在上相的收率为90％，分配系数为1.0，纯化倍数为7倍；二乙基氨基乙基-琼脂糖凝胶FF柱层析用pH7 50.0毫摩尔三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液充分平衡柱，上样，用同样缓冲液洗杂蛋白，然后以0～0.5摩尔NaCl，pH7 50毫摩尔三羟基甲基氨基甲烷-盐酸进行直线梯度洗脱，分步收集，通过检测，收集酶活性峰部分；黄素腺嘌呤二核苷酸-琼脂糖凝胶亲合柱层析层析柱床体积5.0毫升，用3毫摩尔α-巯基乙醇的pH7 50.0毫摩尔硼酸缓冲液充分平衡，样品上柱后，用含上述平衡缓冲液充分洗脱杂蛋白，然后用含黄素腺嘌呤二核苷酸的pH7 50.0毫摩尔硼酸缓冲液洗脱，收集酶活性峰部分。
全文摘要
本发明是用诱导培养基链球菌制备磷酸甘油氧化酶的方法。培养基组分及培养条件斜面诱导培养基由酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖、磷酸氢二钾、甘油、琼脂、硫酸镁、氯化锰、氯化钠、pH6.8的混合盐溶液构成；种子培养基由酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖、磷酸氢二钾、甘油、硫酸镁、氯化锰、氯化钠、pH6.8的混合盐溶液构成；发酵培养基由酵母提取物、蛋白胨、磷酸氢二钾、甘油、硫酸镁、氯化锰、氯化钠、pH6.8的混合盐溶液构成。菌株经斜面培养，种子培养，旋转摇床发酵培养，再进行放大培养后收集菌体，采用聚乙二醇－硫酸铵双水相萃取和两步层析纯化即得到磷酸甘油氧化酶。
文档编号C12R1/46GK101070529SQ200710049088
公开日2007年11月14日 申请日期2007年5月14日 优先权日2007年5月14日
发明者王腾, 孟延发 申请人:王腾, 孟延发