专利名称：一种d-3-磷酸甘油酸脱氢酶及其编码基因及构建方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，尤其是一种D-3-磷酸甘油酸脱氢酶及其编码基因及构建方法。
背景技术：
PGDH(D-3-phosphoglycerate-dehydrogenase, PGDH)，即 D-3-磷酸甘油酸脱氢酶 [EC1. 1. 1.95]，该酶是L-丝氨酸合成的关键酶，将3-磷酸甘油酸转化为磷酸羟基丙酮酸， 是L-丝氨酸合成第一步。目前生物方法生产丝氨酸主要有前体法和直接发酵法。前体法主要采用丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)将甘氨酸转化为L-丝氨酸；该法制备L-丝氨酸具有收率高、生产周期短等优点，但如何从酶反应液中分离提取L-丝氨酸是一个难题；直接发酵法即是利用糖质碳源利用工程菌直接发酵，达到积累丝氨酸的目的，该法可以大幅降低丝氨酸的生产成本。但是直接利用糖质碳源发酵L-丝氨酸存在着瓶颈L_丝氨酸对D-3-磷酸甘油酸脱氢酶存在反馈抑制，即在L-丝氨酸浓度较高时会使D-3-磷酸甘油酸脱氢酶结构改变，导致降低酶活，这就限制了 L-丝氨酸的合成量。因此，如何在保证酶活的前提下解除该酶的反馈抑制就显得意义重大。Peters-Wendisch 等 O002，Appl. Microbiol. Biotechnol. 60 :437-441)描述了谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) P⑶H的C-末端缺失，实现了 L-丝氨酸反馈抑制的消除，但同时导致了部分酶活损失。专利申请CN200410063527. 5描述了在大肠杆菌P⑶H的第349位甘氨酸或第372 位苏氨酸的取代，所得的PGDH变体降低了对L-丝氨酸的敏感，取得了较好的效果，但并未完全解除L-丝氨酸对P⑶H的反馈抑制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种D-3-磷酸甘油酸脱氢酶及其编码基因及构建方法， 本脱氢酶其与大肠杆菌野生型PGDH相比，不受L-丝氨酸反馈抑制，且酶活相当。应用大肠杆菌系统，对表达PGDH的基因进行克隆、序列分析以及定点突变，然后利用基因重组技术构建含有突变基因的重组表达载体，将重组表达载体转入相应的宿主菌株进行表达，进而获得该D-3-磷酸甘油酸脱氢酶。本发明的目的是通过以下技术方案实现的一种D-3-磷酸甘油酸脱氢酶，氨基酸序列见序列1。而且，其L-丝氨酸的抑制常数Ki > 250mM。一种D-3-磷酸甘油酸脱氢酶的编码基因，其特征在于基因序列见序列2。一种构建D-3-磷酸甘油酸脱氢酶的方法，其构建方法包括以下几个步骤(1)基因扩增根据Genbank中报道的基因序列，设计引物，从大肠杆菌K12MG1655 菌株中克隆得到D-3-磷酸甘油酸脱氢酶表达基因serA，将该基因连接到克隆载体pUC19后，对目的基因的序列进行分析和比对；(2)基因的定点突变以所述步骤1中的重组克隆载体为模板，利用重叠PCR技术，对基因的第344位和346位密码子进行定点突变；(3)重组表达载体构建将所获得的突变基因muserA与表达载体pET28a(+)进行连接，进行双酶切验证，将验证正确的表达载体转化入E. coli BL21 (DE3)，表达突变后的 D-3-磷酸甘油酸脱氢酶。本发明的优点和积极效果如下本发明以大肠杆菌为基础，利用基因工程技术对D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(PGDH) 表达基因进行定点突变，获得了一种PGDH变体，该变体解除了 L-丝氨酸对其的反馈抑制， 且酶活与野生P⑶H相当，这就保证了即使在L-丝氨酸浓度较高的条件下时，P⑶H仍然具有活性，使L-丝氨酸的合成能够继续，为工业化大量生产L-丝氨酸提供了一个有力的工具。
图1为本发明serA基因扩增结果及pUC19-serA双酶切鉴定结果其中M :DNA Marker ；1 :serA基因PCR产物；2 重组克隆载体酶切结果。图2为本发明突变基因下段及上段扩增结果其中M =DNAMarker ；1 下段基因； 2 上段基因。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的， 不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。一种D-3-磷酸甘油酸脱氢酶的定点突变方法如下1、克隆serA基因以大肠杆菌MG1655菌株的总DNA为模板，设计如下引物用于克隆D_3_磷酸甘油酸脱氢酶表达基因serA 上游引物serA-F 5 SacI酶切位点)。下游引物serA-R:5 为MlI酶切位点)。扩增体系(50μ L)(MH2OIOXbufferdNTP(2. 5mmol/L)上游引物serA-F下游引物serA-RDNA 模板Pyrobest 高保真酶扩增程序95"C 5min,
，-AGC GAG CTC ATG GCAAAG GTATCG CTG GAG-3，(下划线为 ，-ACG CGT CGA CTT AGT ACA GCA GAC GGG CGC-3，(下划线
34. 5μ L, 5. 0μ L, 5. 0μ L, 2. 0μ L, 2. 0μ L, 1. 0μ L, 0· 5 μ L0
1个循环；
94"C 45s，61°C 45s，72°C 80s, 30 个循环；72"C IOmin,1 个循环。扩增得到的DNA片段纯化后和克隆载体PUC19分别用限制酶McI和MlI进行双酶切，然后电泳、切胶回收酶切后的克隆载体和PCR产物。双酶切条件为37°C，4h，体系如下 (50 μ L)SacI2 μ L,Sail2μ L,IOXBuffer T5 μ L,BSA5 μ L，pUC19 或 serA 基因 20 μ L,无菌水16 μ L0纯化后的载体pUC19和serA基因双酶切片段利用Takara试剂盒(Takara Ligation Kit ver2. 0)进行连接，连接条件为37°C，16h，体系如下(IOyL)Solution I 5 μ L,pUC191 μ L,serA 基因4μ L,连接混合物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，相应的转化株以氨苄霉素筛选。目的基因扩增结果和重组克隆载体pUC19-SerA双酶切鉴定结果见图1。2、serA基因的定点突变利用重叠PCR进行serA基因的密码子344和346的定点突变。使用步骤1所述的载体pUC19-serA作为模板。(1)以上游引物 serA-F 和上段突变引物 serA-muR :5，-CAC GCC CGG ACG GGC TTCGGC GAT GTG CAT CA-3，进行一次PCR，扩增突变基因上段序列。扩增体系(50μ L)ddH2034. 5 μ L，IOXbuffer5. 0 μ L,dNTP (2. 5mmol/L)5. 0 μ L,上游引物serA-F2. 0 μ L,上段突变引物 serA-muR 2. 0 μ L,pUC19-serA1. 0μ L,Pyrobest 高保真酶0· 5 μ L。扩增程序95°C 5min,1 个循环；94°C 45s, 55°C 45s, 72°C 30s, 30 个循环；72°C IOmin,1 个循环。(2)以下段突变引物 serA-muF :5，-TGATGC ACATCG CCGAAG CCC GTC CGG GCGTG-3’和下游引物serA-R 进行一次PCR，扩增突变基因下段序列。扩增体系(50μ L)ddH2034. 5 μ L,
IOXbuffer5. 0μ L,
dNTP(2. 5mmol/L)5. 0μ L,
上弓I物serA-muF2. 0μ L,
下引物serA-R2. 0μ L,
pUC19-serA1. 0μ L,
Pyrobest高保真酶0· 5 μ L0
扩增程序
95°C 5min,1个循环；
94°C 45s, 50°C 45s, 72°C 60s,30个循环；
72°C IOmin,1个循环。
对两种PCR产物分别进行琼脂I套凝胶纯化得到两段DNA片段，突变基因上段约
11Λ，突变基因下段约250bp见图2。然后以这两段DNA片段互为模板，使用上游引物serA-F 和下游引物serA-R按照步骤1中所述方法进行PCR，产物进行琼脂糖凝胶纯化，得到的DNA 片段即为serA突变基因，经过测序确认后，如步骤1中所述将serA的突变基因连接入表达载体pET28a (+)，生成的载体命名为pET28a (+) -muserA。转化大肠杆菌BL21 (DE3)中，相应的转化株以卡那霉素筛选。3、确定P⑶H活性及抑制剂常数Ki。为确定P⑶H酶活性及L-丝氨酸对其活性的影响，在IOOmL体积的含有100mg/L的氨苄青霉素的LB培养基(10g/L的胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L的NaCl)中，接种2mL 过夜培养的的pET28a (+) -muserA/BL21 (DE3)菌液，并在30°C，200r/min下摇床培养。当菌体浓度达到OD6tltlnm约为0. 8时，向培养液中加入终浓度为1. Ommol/L的异丙基-β -硫代半乳糖苷(IPTG)诱导基因表达，继续培养池。然后离心收集细胞、洗涤再悬浮于2mL缓冲液 (IOOmM磷酸钾，pH7. 0 ；IOmM MgCl2 ；ImM 二硫苏糖醇)中。细胞使用超声破碎仪进行破碎， 20000g离心以使粗提取物澄清，使用McKitrick和Pizer试验法(1980，J. Bacteriol. 141 235- 测定PGDH活性。活性见表1。抑制常数Ki表示酶活性为在无抑制剂下测定的活性的50%时的抑制浓度。PGDH变体具有与野生型PGDH酶相同的酶活，而且抗抑制能力极大提高。只有当L-丝氨酸浓度很高时(> 250mM)，酶活性才受到部分抑制。因此本发明的 P⑶H变体解除了 L-丝氨酸的反馈抑制。表1:P⑶H酶活及Ki
权利要求
1.一种D-3-磷酸甘油酸脱氢酶，其特征在于氨基酸序列见序列1。
2.根据权利要求1所述的D-3-磷酸甘油酸脱氢酶，其特征在于其L-丝氨酸的抑制常数 Ki > 250mM。
3.—种如权利要求1所述的D-3-磷酸甘油酸脱氢酶的编码基因，其特征在于基因序列见序列2。
4.一种构建如权利要求1所述的D-3-磷酸甘油酸脱氢酶的方法，其特征在于其构建方法包括以下几个步骤(1)基因扩增根据Genbank中报道的基因序列，设计引物，从大肠杆菌K12MG1655菌株中克隆得到D-3-磷酸甘油酸脱氢酶表达基因serA，将该基因连接到克隆载体pUC19后， 对目的基因的序列进行分析和比对；(2)基因的定点突变以所述步骤1中的重组克隆载体为模板，利用重叠PCR技术，对基因的第344位和346位密码子进行定点突变；(3)重组表达载体构建将所获得的突变基因muserA与表达载体pET28a⑴进行连接，进行双酶切验证，将验证正确的表达载体转化入E. coli BL21(DE3)，表达突变后的 D-3-磷酸甘油酸脱氢酶。
全文摘要
本发明涉及一种D-3-磷酸甘油酸脱氢酶，其氨基酸序列见序列1，其L-丝氨酸的抑制常数Ki＞250mM，以及一种D-3-磷酸甘油酸脱氢酶的编码基因，基因序列见序列2。本发明提供的PGDH的氨基酸序列与大肠杆菌野生型PGDH的氨基酸序列(序列3)的不同之处在于第344位氨基酸不是组氨酸而是丙氨酸且第346位氨基酸不是天冬酰胺而是丙氨酸，突变产生的PGDH不受L-丝氨酸的抑制，且本发明的PGDH变体的酶活性与野生型相比未发生改变。
文档编号C12N15/70GK102433312SQ20111038913
公开日2012年5月2日 申请日期2011年11月30日 优先权日2011年11月30日
发明者佟新伟, 刘逸寒, 李玉, 路福平, 陈谷奎 申请人:天津科技大学