产甘油假丝酵母NAD⁺依赖-甘油3-磷酸脱氢酶基因及其克隆的制作方法

专利名称：产甘油假丝酵母NAD⁺依赖-甘油3-磷酸脱氢酶基因及其克隆的制作方法
产甘油假丝酵母NAD+依赖-甘油3-磷酸脱氢酶基因及其克隆技术领域产甘油假丝酵母NAD+依赖-甘油3-磷酸脱氢酶基因及其克隆，涉及微生物 学，基因工程和分子生物学等领域，特别涉及一种耐高渗产甘油假丝酵母中甘 油合成途径的关键酶编码基因NAD+依赖-甘油3-磷酸脱氢酶基因及其克隆。
背景技术：
当细胞处于高渗透压环境中时，为了保持胞内的水分和小分子物质向环境 中外泄，就需要通过自身合成一些生物相容性物质来提高胞内的渗透压来平衡 胞内和胞外的压力差，从而起到保护和防御细胞的作用。对于酵母细胞而言， 在渗透压胁迫作用时产生的生物相容性物质主要是甘油，还有少量的其他多元 醇。NAD+依赖性3-磷酸甘油脱氢酶是酿酒酵母细胞以葡萄糖为碳源合成甘油过 程的限速酶，编码该酶的基因存在两个异构形式:G^D7和GPD2，前者受渗透 压诱导表达，而后者在厌氧环境中起着平衡氧化还原力的作用。G尸D7基因的表 达水平是受到促有丝分裂源蛋白激酶(MAPK)介导的高渗压甘油应答途径 (HOG)调控的。但是对于没有经过人工诱变或分子改造的酿酒酵母，其甘油 合成能力有限，通常为每升发酵液中含有几克到十几克甘油。产甘油假丝酵母(C朋cfe/ag/ycm'"oge朋W WL2002-5-59，是从自然界中分离 出来的一种优良的能够耐高渗压的甘油生产菌株，它能在25X葡萄糖或5XNaCl 的高渗透压培养基上正常生长繁殖，在实验室规模发酵中，甘油产量可达到 12%，即使在工业化规模中，甘油产量也可达到10%，这是用酿酒酵母甘油代谢 理论难以解释的。目前，该酵母已经应用于甘油发酵的工业化生产，然而与酿 酒酵母相比，其相关的分子知识和遗传背景非常缺乏。该产甘油假丝酵母 (Ca"&<iag/jcen'"oge"&^ WL2002-5-59巳在中国专利CN1070235C中公开，公告 日2001年8月29日。产甘油假丝酵母(C. g/yceW"oge"^) WL2002-5-59甘油合成的关键酶基因 NAD、甘油3-磷酸脱氢酶基因克隆有以下几点重要作用1、 为从分子水平上深入研究Caws^fag/少cen'woge"a5高产甘油的代谢机制奠 定了基础。2、 为试图通过分子改造进一步提高OzW油g^^"o^"^的发酵特性提供 了可能性。3、 为研究不同酵母属种的高渗压信号转导途径之间的差异提供了材料。4、 为微生物和真核生物的抗逆性改良研究特别是抗高渗透压研究提供了更加丰富的优良候选基因。 发明内容甘油3-磷酸脱氢酶是假丝酵母(C朋^fog/少cer/wogew^) WL2002-5-59高产 甘油中的限速酶，本发明的目的在于提供一种新的产甘油假丝酵母甘油3-磷酸 脱氢酶基因及其编码序列。在本发明中，术语"甘油3-磷酸脱氢酶"、"胞浆NAD+-依赖的甘油3-磷 酸脱氢酶"、"3-磷酸甘油脱氢酶"或/和"GPD"可互换使用，都指具有产甘 油假丝酵母甘油3-磷酸脱氢酶氨基酸序列(SEQIDN0.2)蛋白或多肽。甘油3-磷酸脱氢酶脱氢酶催化的反应如下sn-Glycerol 3-phosphate+NAD+ _ Glycerol 3-phosphate+NADH一方面，本发明提供一种包含编码甘油3-磷酸脱氢酶基因的DNA片段。 更具体的说，本发明提供包含调控序列，如启动子和终止子，以及甘油3-磷酸脱氢酶基因的开放阅读框的DNA分子。本发明提供编码Om^/a g/ycm'woge"" WL2002-5-59的甘油3-磷酸脱氢酶 基因的DNA片段。所述DNA是指含有侧翼5、-和3'-非翻译区中的短片段之间 的开放阅读框的DNA或包含有调控序列如在C^2^Wa g/ycer&oge"" WL2002-5-59表达甘油3-磷酸脱氢酶基因所必需的启动子和终止子的基因组 DNA。相应地，本发明涉及含有选自下述组的核酸分子的多核苷酸a) 编码SEQIDNO.2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，b) 与编码含有SEQ ID N0.2的氨基酸序列的多肽至少70%同源性的氨基酸 序列的多肽的多核苷酸，c) 与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，d) 与a)中经过一个或多个碱基的取代、缺失或添加的有义突变。 在本发明的另一方面，提供了一种编码的多肽，所述多肽具有与SEQ IDNO.2所示氨基酸序列至少70y。同源性的序列或其片段。更佳的，所述多肽是含 有SEQ ID N0.2所示氨基酸序列的多肽。 本发明的技术方案一种产甘油假丝酵母(g/ycen'w ge"" ) WL2002-5-59中分离的多核 苷酸，其核苷酸序列为SEQIDNO.l。如上所述的多核苷酸的2082bj>~3249bp的核苷酸序列，编码基因产甘油假 丝酵母NAD+依赖-甘油3-磷酸脱氢酶，其氨基酸序列为SEQ ID N0.2。其2082bp—3249bp的核苷酸序列，经过一个或多个碱基的取代、缺失、置 换、倒位或添加的有义突变。所述的多核苷酸含有SEQ IDNO.l中自起始密码子ATG上游向前的 l-2081bp核苷酸序列。所述产甘油假丝酵母NAD+依赖-甘油3-磷酸脱氢酶基因的克隆(1) 简并引物PCR扩增产甘油假丝酵母WL2002-5-59的甘油3-磷酸脱氢 酶基因片段以GeneBank公布的其他物种的甘油3-磷酸脱氢酶的基因序列为基础，通过 序列比对分析，设计简并引物CD-U: 5'-TBRTBGGITCHGGYAAITGGG-3'， CD-R: 5'-RGCVAIVAYRTTYTTYARIGC-3';通过PCR技术，以WL2002-5-59基因组DNA为模板，以CD-U， CD-R为 引物扩增获得0.63kb的核苷酸片段，经过TA克隆，测序；(2) 反向引物PCR扩增WL2002-5-59的甘油3-磷酸脱氢酶基因的全长序列根据简并引物PCR获得的DNA序列结果，设计一对反向引物 Cgl-F: 5'-C CTTATTTCCGTGTTCGTGTTATTAGTG-3'， Cgl-R: 5'-CGCCTTCAATCAATTC TTCATAGAC-3';提取WL2002-5-59基因组DNA，分别用万"wH I 、户W I 、 1酶切后用 酚、氯仿纯化，再用T4DNA连接酶进行自身连接环化，用乙醇沉淀后作模板进 行PCR扩增分别获得6.7kb 、 2.5kb、 2.3kb的DNA片段，经TA克隆挑选阳性 转化子，序列测定拼接后获得全长的产甘油假丝酵母NAD+依赖-甘油3-磷酸脱氢 酶编码基因及其侧翼调控序列。本发明的有益效果本发明采用简并引物PCR和反向PCR法从产甘油假丝 酵母WL2002-5-59的染色体基因组中克隆出甘油合成的限速酶基因产甘油假 丝酵母NAD+依赖-甘油3-磷酸脱氢酶基因(CgG尸Z))及其侧翼的调控序列。该 基因全长4900bp，在2082bp处具有起始密码子ATG， 3246bp处具有终止密码 子TAA。该序列无内含子，具有1167bp完整的开放阅读框，编码388个氨基酸。 所述基因的氨基酸序列与酿酒酵母(5Wcc/zaram;;cas ce^v^'ae)基因G尸D1同源 性高达60%，与安格斯毕赤酵母(尸/cWaa"g^to)基因同源性高达70%。 该基因的克隆扩大了微生物抗渗透压胁迫研究的基因资源，也为产甘油假丝酵 母高产甘油的分子机理研究奠定了基础。CgG户Z)基因的克隆为运用基因工程技 术改善微生物及其它高等真核生物的抗逆性改良研究提供了更加丰富的优良候 选基因。


图1、简并引物PCR扩增甘油3-磷酸脱氢酶基因0.63kb片段。Lane 1 DNA Marker: DL2000; Lane 2 and Lane 3简并引物PCR产物。图2、反向PCR扩增甘油3-磷酸脱氢酶基因及其侧翼序列。
Lane 1, DNA Marker: JDNA/揚dlII; Lane 2,以BamH I酶切基因组DNA的反向PCR产物； Lane 3,以尸W I酶切基因组DNA的反向PCR产物； Lane 4，以1酶切基因组DNA的反向PCR产物； Lane 5 ， DNA Marker: DL2000 。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明。实施例1:简并引物PCR扩增Ca"&A g/少cehwoge"" WL2002-5-59的甘油 3-磷酸脱氢酶基因片段1. 简并引物的设计搜索GeneBank公布的相关酵母和其他真核生物的甘油3-磷酸脱氢酶基因 的序列，通过氨基酸序列的比对分析，找到两个保守区域对应的氨基酸序列为 VVGSGNWGT和GALKNVVA，根据这两个保守区域设计一对简并引物CD-U: 5'-TBRTBGGITCHGGYAAITGGG-3'，CD-R: 5'画RGCVAIVAYRTTYTTY認GC-3'。其中I指次黄嘌呤碱基；R指A或G; Y指C或T; H指A、 C或T; V指A、 C或G; B指C、 G或T。2. C朋^ia g(ycenVwge"es WL2002-5-59基因组DNA的提取 产甘油假丝酵母WL2002-5-59染色体DNA制备按参考文献[酵母遗传学技术手册]进行。将提取的DNA用DU640核酸蛋白分析仪进行测定，根据A260/A28() 的比值判断所提取的DNA纯度，利用260nm下的OD值计算所提取的DNA浓 度，同时，通过琼脂糖凝胶电泳判定模板的质量。3. PCR扩增反应体系50 ML，包含5 10x Hot Start TaqTM Buffer (Mg2+ plus,大连宝生 物公司)，化L 2.5mM DNTPs， l^L l.OOmM简并引物CD-U和CD-R, IjiL C. g/_ycm'wogewas WL2002-5-59基因组DNA作为模板，加入1.25 U Hot Start Taq，(大连宝生物公司)，最后用水补足体积50 nL。 PCR扩增条件95°C变性 4分钟，随后94'C 50秒、56°C 90s、 72°C 2分钟进行32个循环，最后以 72。C延伸15钟。电泳检测PCR产物，获得片段长度约为0.63kb的核酸分子， 胶回收后按pGEM-T-Easy (Promega)试剂盒操作说明进行TA克隆，测序结果获 得一个631 bp的序列。将该序列及其编码蛋白质序列用Blast程序在GeneBank (http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与 安格斯毕赤酵母的甘油3-磷酸脱氢酶基因有较高的同源性，证实了简并引物的
正确性。实施例2:反向引物PCR扩增甘油3-磷酸脱氢酶基因的全长序列1、 反向PCR引物的设计根据简并引物PCR扩增获得的序列结果，设计一对反向PCR引物 CgI画R: 5'画CGCCTTCAATCAATTCTTCATAGAC-3'用于PCR扩增。2、 PCR模板的制备按上述方法提取C. g(ycen'wogew^ WL2002-5-59的基因组DNA，分别用限 制酶万"mH I ,户W I和1各酶切5jig基因组DNA，琼脂糖电泳检査酶切效果。 用l: 1的酚和氯仿等体积抽提酶切产物，然后用2.5倍体积的无水乙醇沉淀， 最后溶于50)iL超纯水中。在200pL连接体系中，加入O.l昭酶切后的DNA ， 20pL的连接缓冲液和10UT4DNA连接酶，用水补足体积，16匸过夜。连接 产物用无水乙醇沉淀后，溶于25(iL无菌超纯水中，用于下一步反向PCR扩增。3、 反向PCR扩增反向PCR扩增体系50 ^L: 50 ng自环化的基因组DNA作为模板，5 pL 10xLA TaqTM Buffer (大连宝生物公司)，8|iL 2.5mM的DNTPs,上下游引物各 lpL和1.25 ULATaqW(大连宝生物公司)，用无菌水补足体积50 ^。 PCR扩增 条件如下95°C变性4分钟，随后94°C 50秒、60°C 3分钟、68°C 3.5 分钟进行35个循环，最后以72 i:延伸IO分钟。电泳检测扩增产物，用B謹H I酶切后自环化的基因组DNA作为模板获得6.7kb的DNA片段，用i3" I酶 切后自环化的基因组DNA作为模板获得2.5kb的DNA片段，用1酶切后自 环化的基因组DNA作为模板获得2.3kb的DNA片段，分别胶回收6.7kb、 2.5kb 和2.3kb后，按pGEM-T-Easy (Promega)试剂盒操作说明进行TA克隆，通过蓝 白鉴定挑取阳性克隆测序。测序结果经拼接后获得全长的C. g/少cen'"oge"^甘油 3-磷酸脱氢酶基因序列和侧翼序列。实施例3: C. gfycen'MogMM甘油3-磷酸脱氢酶基因序列信息和同源性分析本发明产甘油假丝酵母甘油3-磷酸脱氢酶基因的核苷酸序列全长4900bp， 详细序列见SEQIDNO.l，其中开放阅读框于2082-3246位核苷酸，编码388个 氨基酸，并且内部编码框内不含有内含子。将产甘油假丝酵母甘油3-磷酸脱氢酶基因序列及其编码蛋白用BSLAT程序translations+PDB+SwissProt +PIR数据库进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果 发现在氨基酸水平上，它与安格斯毕赤酵母的甘油3-磷酸脱氢酶基因有70%的 同源性，与酿酒酵母的甘油3-磷酸脱氢酶基因有60%的同源性。由此可见，产
甘油假丝酵母甘油3-磷酸脱氢酶基因与其它酵母的甘油3-磷酸脱氢酶基因在蛋 白质水平上存在较高的同源性，属于同一家族蛋白。实施例4:产甘油假丝酵母甘油3-磷酸脱氢酶蛋白的结构和功能将产甘油假丝酵母甘油3-磷酸脱氢酶蛋白的氨基酸在blocks数据库 (http:/www.blocks.fhcrc.org)中检索结构域，发现在该氨基酸序列中存在甘油 3-磷酸脱氢酶蛋白功能模块，因此可以预见其具有甘油3-磷酸脱氢酶蛋白的相应 功能。用在线预测软件(http:/www.psortnibb.ac.jp)进行蛋白的亚细胞定位分析 发现，产甘油假丝酵母甘油3-磷酸脱氢酶蛋白是位于细胞的胞浆中，这进一步 验证了所克隆的基因是属于胞浆NAD+-依赖的甘油3-磷酸脱氢酶。SEQ ID NO.lCtgCagELgtCat ttaaaaaa caacaatgcc agtcccatct cacaggccac acactgtact ttagacgtga agattgcgcagtggtgggtc ggtgaagtgt 鄉ga犯ggc aaatg鄉gggatggttatc caccattatt ttcgccataa gccgcggtta cttttttttc catttccgga cagtctgtac tctccggagt 卿ggtagcg caggLgtcca/t tccgtaaaat atggtt犯ac tggcaatctc ggccacatgc 犯a^cttggc ttggcaaatt ttg犯ggcgt agtggcgttt ttggcaa鄉 gtttatttta tctcaaatac gattatctac cagaagacta gtacaattgc atgttaatattctacgtttt ccactacagt gtcg犯3犯c ggc卿caag aggaagtSLgt ctccaacaag aggatctgtt a"gcg鄉g3t agtgcagggt 3ttcta^g8g aagaaggtaa3C3gtg3gtggggatggtgt agaaactttg actattattaa>C8LgeLgSLCCggg卿ggctg cgcagcacac ctctttttct acaacaatag atgcacgttt ccaggtctcgttgaaaacct ggcgt犯tat 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275Gly Cys His Ala Ala 290Asp Leu lie Thr Thr 305Arg Tyr Met Ala Gin 320Lys Leu Leu Asn Gly 335Glu Val Tyr Glu Phe 350Pro Leu Phe Thr Thr 365lie Glu Lys Leu Pro 380Gly Asp Asn Ala Lys 265Thr lie Gin Phe Ala 280Thr Phe Thr His Glu 295Cys Ala Gly Gly Arg 310His Ser Val Ser Ala 325Gin Ser Cys Gin Gly 340Leu Ser Asn Met Gly 355Thr Tyr Arg lie lie 370Glu Cys Leu Glu Pro 385Ala Ala Val Met Arg 270Lys Thr Phe Phe Asp 285Ser Ala Gly Val Ala 300Asn Val Arg Val Gly 315Thr Glu Ala Glu Glu 330lie His Thr Thr Arg 345Arg Thr Asp Glu Phe 360Tyr Glu Asn Phe Pro 375Val Glu Asp 388
权利要求
1、一种产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)WL2002-5-59中分离的多核苷酸，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
2、 如权利要求1所述的多核苷酸的2082b^3249bp核苷酸序列，编码基 因产甘油假丝酵母NAD+依赖-甘油3-磷酸脱氢酶，其氨基酸序列为SEQ ID N0.2。
3、 根据权利要求l所述的一种分离的多核苷酸SEQIDNO.l，其特征是其 2082bp~3249bp核苷酸序列，经过一个或多个碱基的取代、缺失、置换、倒位 或添加的有义突变。
4、 根据权利要求l所述的一种分离的多核苷酸SEQIDNO.l，其特征是所 述的多核苷酸含有SEQ ID NO.l中自起始密码子ATG上游向前的l-2081bp核苷 酸序列。
5、 如权利要求2所述产甘油假丝酵母NAD+依赖-甘油3-磷酸脱氢酶基因的 克隆，其特征是(1) 简并引物PCR扩增产甘油假丝酵母WL2002-5-59的甘油3-磷酸脱氢 酶基因片段以GeneBank公布的其他物种的甘油3-磷酸脱氢酶的基因序列为基础，通过 序列比对分析，设计简并引物CD画U: 5 '网TBRTBGGITCHGGYAAITGGG國3 '， CD画R: 5 '-RGCVAIVAY R TTYTTYARIGC-3';通过PCR技术，以WL2002-5-59基因组DNA为模板，以CD-U， CD-R为 引物扩增获得0.63kb的核苷酸片段，经过TA克隆，测序；(2) 反向引物PCR扩增WL2002-5-59的甘油3-磷酸脱氢酶基因的全长序列根据简并引物PCR获得的DNA序列结果，设计一对反向引物 Cgl-F: 5'-C CTTATTTCCGTGTTCGTGTTATTAGTG-3'， CgI画R: 5'画CGCCTTCAATCAATTC TTCATAGAC-3';提取WL2002-5-59基因组DNA，分别用BawH I 、 A〉 I 、 &/I酶切后用 酚、氯仿纯化，再用T4DNA连接酶进行自身连接环化，用乙醇沉淀后作模板进 行PCR扩增分别获得6.7kb 、 2.5kb、 2.3kb的DNA片段，经TA克隆挑选阳性 转化子，序列测定拼接后获得全长的产甘油假丝酵母NAD+依赖-甘油3-磷酸脱氢 酶编码基因及其侧翼调控序列。
全文摘要
产甘油假丝酵母NAD⁺依赖-甘油3-磷酸脱氢酶基因及其克隆，属于微生物分子生物学领域。本发明涉及一种新的基因序列SEQID NO.1，采用简并引物PCR和反向PCR法从产甘油假丝酵母WL2002-5-59的基因组DNA中克隆出甘油合成的限速酶NAD⁺依赖-甘油3-磷酸脱氢酶基因及其侧翼的调控序列。该基因全长4900bp，在2082bp处具有起始密码子ATG，3246bp处具有终止密码子TAA。该序列无内含子，具有1167bp完整的开放阅读框，编码388个氨基酸。其与酿酒酵母GPD1基因同源性高达60％，与安格斯毕赤酵母GPD基因同源性高达70％。该基因的克隆扩大了微生物抗渗透压胁迫研究的基因资源，也为产甘油假丝酵母高产甘油的分子机理研究奠定了基础。
文档编号C12N15/53GK101157931SQ200710131859
公开日2008年4月9日 申请日期2007年9月6日 优先权日2007年9月6日
发明者方慧英, 微 沈, 王正祥, 诸葛健, 陈献忠, 饶志明 申请人:江南大学