专利名称：：一种植物三磷酸甘油醛脱氢酶基因及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于转基因植物领域，更具体涉及一种植物三磷酸甘油醛脱氢酶基因，同时还涉及一种植物三磷酸甘油醛脱氢酶基因的制备方法，还涉及植物三磷酸甘油醛脱氢酶基因在水稻抗逆中的应用。
背景技术：
：三石舞酸—甘油IIJKS1BI(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase；GAPDH)是糖酵解途径中必不可少的关键酶之一，它催化D-甘油醛-3-磷酸(G-3P)可逆的氧化和磷酸化，生成1，3-二磷酸甘油酸(DPGA)，是维持生命活动最基本的酶之一，广泛存在与各种生物细胞中。最近的相关研究表明，真核及原核生物的3-磷酸甘油醛脱氢酶除了在糖酵解中起重要作用外，它在膜溶解、微管集束、磷酸转移酶活性、DNA修复、细胞凋亡、核RNA输出、及其在细胞周期中都发挥着重要的作用。另外，GAPDH基因还具有较强的抵御环境胁迫的能力，尤其在高温、高盐、低温等胁迫条件下，利用酵母表达技术已经证明该基因具有抗盐、碱和高温胁迫的功能，是一种重要的抗逆境胁迫基因。该酶在植物中的研究不如在哺乳动物中的深入，但研究已经陆续证明，3-磷酸甘油醛脱氢酶在植物中同样具有许多未被发现的功能，目前已经报道该酶在厌氧、热激、伤害以及能量供应中可能发挥着重要作用。目前已从众多植物中克隆出了3—磷酸甘油醛脱氢酶基因，而单子叶禾本科植物中，大麦、玉米、谷子、水稻的胞质3—磷酸甘油醛脱氢酶基因也先后被克隆出来，在植物中的研究表明，缺氧和热激都可以诱导GAPDH基因的表达，早先在烟草愈伤培养时，培养基中高浓度的蔗糖也能使GapC类基因的表达量也有上升。植物自身的应激反应在减小机械损伤、昆虫和病原体侵袭方面起着重要的作用，GAPDH基因在这些伤害反应中也有较高水平的表达。最近，以拟南芥原生质体和酵母为材料的研究证明了GAPDH基因参与了H202调控的细胞凋亡，在H2O2处理条件下，拟南芥GAPDH基因的表达上调，并且可以抑制由热激导致的H2O2含量的提高和细胞死亡，本发明中分离出一个水稻中新的GAPDH家族成员，该基因抑制表达转基因植株在水稻幼苗时期表现为耐盐，为水稻抗逆品系的筛选和获得提供了一种新的方法。
发明内容本发明的目的是在于提供了一种植物三磷酸甘油醛脱氢酶基因，所获得的转基因植株遗传稳定，本实验室的过量表达载体PUbiO为高效的组成型的表达载体，可获得目的基因高表达量的转基因植株；另外本实验室所用的转化材料中花11相对其他品种在水稻转化的应用中也有很高的转化效率。本发明的另一个目的是在于提供了一种植物三磷酸甘油醛脱氢酶基因的制备方法，该方法获得的水稻三磷酸甘油醛脱氢酶基因的全长cDNA序列，而非全长的基因组序列，因为真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列，因此由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆要简单得多；另外，本方法获得的该基因处于单子叶植物的强效启动子-泛素启动子的调控之下，使得该基因可组成型的表达，不受外界环境因素的干扰，且遗传稳定。一种能过量表达该3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的植株，该转基因植株表现为耐盐。本发明的再一个目的是在于提供了一种植物三磷酸甘油醛脱氢酶基因在水稻抗逆中的应用，该酶在糖酵解途径中催化D-甘油醛-3-磷酸(G-3P)可逆的氧化和磷酸化，生成1，3-二磷酸甘油酸(DPGA)，是维持生命活动最基本的酶之一，同时，近期的研究还表明该基因参与了植物的胁迫应答，由于糖分子也是一种重要的信号分子，所以对该基因的研究，将对申请人理解由营养物质、生物激素和一些化学分子组成的复杂的植物信号途径以及它们所调控的植物生长发育和逆境应答有十分重要的意义。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方法—种植物三磷酸甘油醛脱氢酶基因的制备方法，该方法包括以下步骤A、利用PCR技术，以水稻两周幼苗的总cDNA(提取两周水稻幼苗的RNA，并以此RNA为模板，经反转录获得双链的水稻总cDNA)为模板，并根据NCBI数据库(http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的基因的cDNA序列(其序列为SEQIDNO:3所示的核苷酸序列)，设计一对包含了该基因全长ORF(开放阅读框)的特异引物，以B-Taq(TC)YOBA公司)为DNA聚合酶PCR扩增(940C3min，94°C30s,55°C30s,72°Clmin,30cycles,72°CIOmin)；产物电泳并切胶回收(安比奥公司胶回收试剂盒)，从而获得包含该水稻三磷酸甘油醛脱氢酶基因的全长开放阅读框的cDNA序列(1200bp)，其序列为SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。B、将A步获得的基因片段连接到商业中间载体PBS-TII(TIANGEN公司)中(载体图谱如图1)，测序验证，获得碱基序列完全正确的该水稻三磷酸甘油醛脱氢酶基因片段，一种分离植物三磷酸甘油醛脱氢酶基因，其序列为SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。C、将B步验证获得的正确的基因片断连接到改造获得的载体PUbiO(王莹博士毕业论文水稻胚胎发生过程中的基因表达分析，2004年)中，pUbiO载体是在载体pAHC17(ALANH.CHRISTENSENandPETERH.QUAIL.Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch,1996,5:213_218)禾口pCAMBIA1301(http://www.patentlens.net/daisy/bios/585.html)的基础上改造而来的，载体pAHC17含有改造过的玉米泛素启动子及NOS尾巴，而载体pCAMBIA1300(http://www.patentlens.net/daisy/bios/585.html)系列是目前植物转甚因中使用较多的植物表达载体之一。一种载体PUbiO的构建步骤是首先将载体PAHC17的NOS尾巴之前引入四个多克隆位点-BamHI,KpnI.SacI.SmalI。随后将改造过的pAHC17利用双酶切得到包含玉米泛素启动子及NOS尾巴的片段，同时用相同的双酶切处理pCAMBIA1301，并与上述的片段进行连接，从而得到含有玉米泛素启动子和NOS尾巴的可用于水稻过量表达的载体，如图2所示，使得水稻三磷酸甘油醛脱氢酶基因置于玉米泛素启动子和NOS尾巴之间，形成可转化或表达的载体；D、将制备的含有目的基因的过量表达载体pUbiO转入农杆菌EHA105(来自中国典型培养物保藏中心，)，导入成熟胚诱导的水稻愈伤组织中，并经过再分化最终获得过量表达该基因的水稻转基因植株。本发明中涉及的此水稻三磷酸甘油醛脱氢酶基因参与水稻幼苗期的盐胁迫反应途径。对该脱氢酶的蛋白分析(http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/)表明，它含有三磷酸甘油醛脱氢酶的保守的结构域(如图6)，对其他物种，如玉米、拟南芥，的研究表明，植物三磷酸甘油醛脱氢酶基因参与了一系列胁迫应答反应，因此，申请入对这一水稻的三磷酸甘油醛脱氢酶基因在各种胁迫条件下的基因表达进行的分析，野生型中花11在正常的MS培养基上生长一周后，分别置于42°C、200mM盐、20%PEG中，并在0、1、2、4、8、12、24小时后取样，提取RNA，反转录获得cDNA后进行半定量PCR分析，结果表明，该基因在高盐、干旱、热激条件下的表达量均出现上调(如图7)，同时，申请人还对该水稻基因的过量表达转基因植株进行了耐盐分析，将转基因过量表达植株的T2代种子和野生型的中花11水稻种子剥壳，无菌处理，将种子接种在MS培养基上，28°C，16hr光/Shr暗，生长一周后统计转基因植株和野生型的株高，选择与野生型植株长势一致的过量表达转基因植株，以野生型为对照，再进行消毒处理后，接种到含有200mMNaCl的MS培养基中，28°C，16hr光/8hr暗，培养两周后统计株高，结果显示，野生型的水稻在高盐培养基上生长两周后的株高平均为4.71厘米，而两个过量表达株系的平均株高则分别达到了6.10厘米和5.77厘米，相对野生型为高，表明该3-磷酸甘油醛脱氢酶基因过量表达转化植株在高盐浓度的培养基上，相对野生型，该基因的过量表达转基因植株在高盐胁迫下生长两周后的植株高度明显比野生型要高，证明过量表达该基因提高了水稻抗逆性。一种植物三磷酸甘油醛脱氢酶基因在水稻抗逆中的应用，其应用过程是在本发明中，该丝氨酸-色氨酸蛋白激酶基因序列在NCBI数据库中基因序列号为0s02g0601300，该基因序列为SEQIDNO:3所示序列。通过两种引物GAPF(CGGGATCCCGTTTGCACTCCTCTCGATCTC)和GAI3R(CGGGATCCTCTGCAGGCCTCCATGAGGAG)，其核酸序列分别为SEQIDNO1和SEQIDNO:2，以已得到的水稻cDNA文库作为模板，通过PCR方式合成并获得了一段1200bp长度的包含了该激酶基因全长开放阅读框的片断。将该片断连接到商业中间过渡载体PBS-TII中其插入片断经过核酸测序鉴定正确，然后通过限制性内切酶BamHI酶切获得该片段，并将其连入同样用BamHI处理过的过量表达载体pUbiO中，获得正向的插入。将含有目的片断的载体转染农杆菌EHA105，培养农杆菌于YM培养基中，并将成熟胚诱导的水稻愈伤组织在菌液中浸泡，最后在加潮霉素的选择培养基中筛选阳性克隆。在本发明的一个具体实施例中，愈伤组织选自水稻，通过选择培养基最后筛选得到3-磷酸甘油醛脱氢酶基因过量表达的转基因植株，该植株在幼苗时期表现为耐盐特性。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果本发明提供了一个水稻三磷酸甘油醛脱氢酶基因的制备方法以及该基因在水稻中的应用，利用农杆菌介导的水稻愈伤遗传转化技术获得了该基因的水稻过量表达转基因植株，发明中的水稻愈伤是由种胚诱导而成，所获得的转基因植株遗传稳定，本实验室的过量表达载体PUbiO为高效的组成型的表达载体，可获得目的基因高表达量的转基因植株；另外本实验室所用的转化材料中花11相对其他品种在水稻转化的应用中也有很高的转化效率。本发明中过量表达了一个植物生长发育中的一个关键酶基因三磷酸甘油醛脱氢酶基因，并发现该基因的过量表达转基因植株表现为耐盐，发现了该基因在植物抗逆反面新的功能。本方法获得的该基因处于单子叶植物的强效启动子-泛素启动子的调控之下，使得该基因可组成型的表达，不受外界环境因素的干扰，且遗传稳定。一种能过量表达该3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的植株，该转基因植株表现为耐盐。图1为一种植物表达载体示意图中间载体PBS-TII图2为一种植物表达载体示意图过量表达载体pUbiOHygromycin为潮霉素抗性，promoter为泛素启动子，NOS尾巴为转录终止子。图3为一种转化植株基因组PCR鉴定结果其中1为对照野生型植株，2-10为转基因植株，结果显示1_5#转基因植株均有插入。图4为一种转化植株半定量PCR分析鉴定结果其中7为对照野生型植株，1-6为转基因植株，结果显示1、2、3转基因植株目的片断表达量有上调。图5为一种转基因植株耐盐表型统计分析横坐标为株系类型，从左至右依次为野生型、过量表达株系3、过量表达株系2，纵坐标为在高盐培养基上生长两周后的株高统计，结果显示在高盐培养基上生长两周后过量表达株系相对野生型株高较高。图6为一种植物蛋白结构域分析其中Gp_dh_Csuperfamily为三磷酸甘油醛脱氢酶的C-端结构域，Gp_dh_Nsuperfamily为三磷酸甘油醛脱氢酶的N-端的NAD结合结构域，GAPDH-I为三磷酸甘油醛脱氢酶I的保守结构域。图7为一种基因在胁迫条件下的表达量半定量PCR分析其中由左至右为基因在高温、高盐和干旱条件下的表达量的变化，上标为处理厚的时间，中间为基因的表达，下面为内标的表达，结果表明，该基因在这些胁迫条件下的表达有所上调。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如陈正华主编，高等教育出版社，1986，木本植物组织培养及其应用；(德国)赖纳特(REINERT，J.)，(英)约曼(YEOMAN，Μ.M.)著；尤瑞麟，王模善译，北京大学出版社，1988，植物细胞和组织培养实验手册；以及(德)巴尔茨(W.BARZ)等主编；夏镇澳等译，科学出版社，1983，植物组织培养及其在生物技术上的应用等书中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1一种植物三磷酸甘油醛脱氢酶基因的制备方法，其步骤是A利用PCR技术，以水稻两周幼苗总cDNA(提取两周水稻幼苗的RNA，并以此RNA为模板，经反转录获得双链的水稻总cDNA)为模板，并根据NCBI数据库提供的基因的cDNA序列(SEQIDNO3)设计一对包含了该基因全长ORF的特异引物，其核酸序列分别为SEQIDNO:1禾口SEQIDNO:2，以B-Taq(TOYOBA公司)为DNA聚合酶PCR扩增(94°C3min,94°C30s,55°C30s,72°Clmin,30cycles,72°CIOmin)；产物电泳并切胶回收(安比奥公司胶回收试剂盒)，从而获得该水稻三磷酸甘油醛脱氢酶基因cDNA序列(1200bp)；其序列为SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。B将A步获得的基因片段连接到商业中间载体PBS-TII(TIANGEN公司)中，测序验证，获得碱基序列完全正确的该水稻三磷酸甘油醛脱氢酶基因的片段，一种分离植物三磷酸甘油醛脱氢酶基因，其序列为SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。C将B步验证获得的正确的基因片断通过限制性内切酶BamHI酶切，获得的片段连接到同样用BamHI酶切的本实验室改造获得的载体pUbiO中，pUbiO载体是在载体PAHC17和pCAMBIA1301的基础上改造而来的，载体pAHC17含有改造过的玉米泛素启动子及NOS尾巴，而载体pCAMBIA1300系列是目前植物转基因中使用较多的植物表达载体之一。一种载体PUbiO其构建过程是首先将载体PAHC17的NOS尾巴之前引入四个多克隆位点-BamHI、KpnI、SacI.SmalI。随后将改造过的pAHC17利用双酶切得到包含玉米泛素启动子及NOS尾巴的片段，同时用相同的双酶切处理pCAMBIA1301，并与上述的片段进行连接，从而得到含有玉米泛素启动子和NOS尾巴的可用于水稻过量表达的载体，如图2所示，使得水稻三磷酸甘油醛脱氢酶基因置于玉米泛素启动子和NOS尾巴之间，形成可转化或表达的载体；D将制备的载体转入农杆菌EHA105(来自中国典型培养物保藏中心)，导入成熟胚诱导的水稻愈伤组织中，并经过再分化最终获得过量表达该基因的水稻转基因植株。实施例2该3-磷酸甘油醛脱氢酶基因过量表达植株的转化与筛选水稻农杆菌的转化成熟的水稻种子去壳，所用品系为粳稻中花11(来自中国农业科学院作物科学研究所)。超净台上无菌水洗3次，在70%(体积比)乙醇润洗，后消毒5分钟，无菌水清洗种子3次，5%(质量体积比)次氯酸钠消毒种子45分钟。无菌水清洗种子5-6次，将种子倒入灭菌滤纸上吸干，吹干后将种子接种在N6培养基(参照《植物细胞和组织培养实验手册》)中，28°C，暗培养4周。观察诱导的愈伤，把淡黄色、致密的胚性愈伤与小盾牌分离后，转入新的N6培养基中，继代培养2周。选择致密、相对干燥的胚性愈伤转移至预培养培养基(N6培养基大量微量减半，并添加200uM的AS(乙酰丁香酮))上，28°C下暗培养2_4天。同时挑取农杆菌EHA105(来自中国典型培养物保藏中心)阳性克隆，将适量农杆菌涂布接种在含有相应抗生素的YM固体培养基上，28°C下暗培养36小时。收集农杆菌重悬于1/2N6+AS培养基，使细菌悬液的0D600达到0.8-1.0。将经过前培养的愈伤转入其中浸泡约15-25分钟。将菌液倒出，把愈伤在无菌纸上，保证菌液洗干，再转入共培养基上于20°C暗培养3天。将共培养的愈伤用无菌水清洗3次，再加入含有头孢霉素(500mg/L)的N6液体培养基清洗，重复2-3次。将干燥的愈伤转入含有头孢霉素(250mg/L)和潮霉素(50mg/L)的N6培养基，28°C，暗培养两周，再转入新的选择培养基培养两周。将最后一次筛选的愈伤培养组织转入含有潮霉素(50mg/L)的预分化培养基中，28°C，暗培养一周。选出长势良好的淡黄色愈伤，移入含有潮霉素(50mg/L)的MS培养基中，光培养1520天，可以看到有绿芽长出，15天换一次培养基。当绿芽的长度达到2厘米左右时，移入1/2MS生根培养基中。等长出根系后，将再生植株转入培养钵中培养。移栽后的幼苗放在温室培养成成苗。实施例3该3-磷酸甘油醛脱氢酶基因过量表达转化植株的核酸分析1、用于PCR的转化植株总DNA的提取采用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取转基因植株的总DNA，首先，取长约2厘米的幼嫩水稻叶片，放于研钵中，加入1.5XCTAB提取液(CTAB15g，IMTris·Cl，pH8.0，75ml，0.5MEDTA30ml,NaCl61.4g加水定容至1000ml)溶液300μ1，研磨至浆状，再加入300μ1的1.5XCTAB提取液，转移至1.5ml离心管中。65°C温浴至少30分钟。冷却至室温(20-25°C以下相同)，加入600μ1体积比为241的氯仿异戊醇(体积比241)，颠倒混勻后，12000rpm,室温离心5分钟。吸取上清，加入等体积的异丙醇室温沉淀10分钟。4°C，12000rpm，离心10分钟。弃上清，70%(体积比)乙醇洗涤沉淀一次。干燥沉淀后，力口入50ul双蒸水或TE(10mmol/lTris-Cl，Immol/IEDTA)溶液溶解。2、转化植株的基因组PCR鉴定PCR反应体系为DNA模板Ι.ΟμΙ10XBuffer(含Mg2+)3.0μ12mMdNTP0.6μ1IOmM的上游引物0.6μ1IOmM的下游引物0.6μ1Taq酶(2.5U)0.3μ1加ddH20至30μ1PCR扩增条件为-MV，3分钟；940C30秒，55°C30秒，72°C1分钟；35个循环数；720C10分钟。结果如图3所示。实施例4该3-磷酸甘油醛脱氢酶基因过量表达转化植株的半定量PCR分析1、转化植株mRNA的提取将水稻幼叶用剪刀剪下迅速称量后(50mg)置于液氮中，研磨成粉末状后加ImlRNA提取液(Trizol)，室温放置5分钟；加入0.2ml氯仿(氯仿Trizol=1:5)，猛烈摇动15秒，室温放置约2分钟，4°C，12000rpm离心15分钟；取上层无色上清，加入0.5ml异丙醇(异丙醇Trizol=12)，室温放置10分钟后4°C，12000rpm离心15分钟；加75%(体积比)乙醇Iml洗涤沉淀一次，用枪吹打沉淀使其悬浮，4°C，7500rpm离心5分钟；吸去上面液体，空气中干燥5分钟或超净台上吹干；溶沉淀于DEPC水中。2、通过RT-PCR反转录得到水稻cDNA文库。3、PCR反应用上述反应得到的cDNA产物作模板，进行PCR反应，体系如下PCR反应体系为cDNA模板Ι.ΟμΙ10XBuffer(含Mg2+)3.0μ12mMdNTP0.6μ1IOmM的上游引物0.6μ1IOmM的下游引物0.6μ1Taq酶(2.5U)0.3μ1力口ddH20至30μ1PCR扩增条件为94°C，3分钟；94°C30秒，55°C30秒，72°C1分钟；30个循环数;720C10分钟；4°C保存。结果如图4所示实施例5—种植物三磷酸甘油醛脱氢酶基因在水稻抗逆中的应用。将转基因过量表达植株的T2代种子和野生型的中花11水稻种子剥壳，无菌处理超净工作台上操作，步骤如下首先用无菌水清洗种子三次，洗去表面的种子表面的灰尘，然后再用70%(体积比)乙醇中消毒5分钟，无菌水清洗种子3次，5%(质量体积比)次氯酸钠消毒种子45分钟。无菌水清洗种子5-6次后，将种子接种在MS培养基上，280C，16hr光/8hr暗，生长一周后统计转基因植株和野生型的株高，选择与野生型植株长势一致的过量表达转基因植株，以野生型为对照，再进行消毒处理后，接种到含有200mMNaCl的MS培养基中，28°C，16hr光/Shr暗，培养两周后统计株高，结果显示，野生型的水稻在高盐培养基上生长两周后的株高平均为4.71厘米，而两个过量表达株系的平均株高则分别达到了6.10厘米和5.77厘米，结果显示，该3-磷酸甘油醛脱氢酶基因过量表达转化植株在高盐浓度的培养基上，与野生型比较，株高较高，如图5所示。权利要求一种分离的三磷酸甘油醛脱氢酶基因，其序列为SEQIDNO4所示核苷酸序列。2.权利要求1所述一种植物三磷酸甘油醛脱氢酶基因的制备方法，该方法包括以下步骤A、利用PCR技术，以水稻两周幼苗总cDNA为模板，并根据NCBI数据库提供的基因的cDNA序列设计一对包含了该基因全长0RF的特异引物，以B-Taq为DNA聚合酶PCR扩增，94°C3min，94°C30s，55°C30s，72°Clmin,30cycles,72°ClOmin，产物电泳并切胶回收，获得包含该水稻三磷酸甘油醛脱氢酶基因的全长开放阅读框的cDNA序列；B、将(A)步骤获得的基因片段连接到中间载体PBS-TII中，测序验证，获得碱基序列完全正确的水稻三磷酸甘油醛脱氢酶基因的全长片段；C、将(B)步验证获得的正确的基因片断连接到改造获得的载体pUbiO中，使水稻三磷酸甘油醛脱氢酶基因置于玉米泛素启动子和N0S尾巴之间，形成转化或表达的载体；D、将制备获得的含有目的基因的过量表达载体pUbiO转入农杆菌EHA105，导入成熟胚诱导的水稻愈伤组织中，并经过再分化终获得过量表达该基因的水稻转基因植株。3.权利要求1中所示的一种三磷酸甘油醛脱氢酶基因在水稻抗逆中的应用。全文摘要本发明公开了一种植物三磷酸甘油醛脱氢酶基因及制备方法和应用，步骤A、以水稻两周幼苗总cDNA为模板，设计一对特异引物，以B-Taq为DNA聚合酶PCR扩增，获得水稻三磷酸甘油醛脱氢酶基因；B、将(A)步骤获得的基因片段连接到中间载体中，并测序验证；C、将(B)步验证获得的基因片断连接到载体中，使水稻三磷酸甘油醛脱氢酶基因置于玉米泛素启动子和NOS尾巴之间，形成转化；D、将制备获得的含有目的基因的过量表达载体pUbiO转入农杆菌EHA105，导入水稻愈伤组织中，获得水稻转基因植株。该基因在水稻中的应用。获得的该基因处于单子叶植物的强效启动子-泛素启动子的调控之下，该基因表达，不受外界环境因素的干扰，且遗传稳定。文档编号A01H5/00GK101831448SQ20101013628公开日2010年9月15日申请日期2010年3月26日优先权日2010年3月26日发明者吕应堂,张秀红,饶晓兰申请人:武汉大学