专利名称：来自 C a n d i d a A l bi c a n s的甘油－3－磷酸磷酸酶和甘油－3－磷酸脱氢酶 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有甘油-3-磷酸(glycerol-3-phosphate)脱氢酶活性的多肽，具有甘油-3-磷酸磷酸酶的活性的多肽，编码所述多肽的多核苷酸，包含所述多核苷酸的载体和宿主细胞，以及使用所述宿主细胞生产甘油的方法。
背景技术：
[2]将甘油用作各种工业产品诸如化妆品、液体肥皂、食品、药、和润滑剂的中间体，并将其用作发酵工业的材料。例如，通过甘油的发酵生产1，3-丙二醇。
可以通过发酵、化学合成，或脂解生产甘油。至于通过微生物发酵生产甘油，已知作为甘油生产微生物的酵母诸如酿酒酵母(S.cerevisiae)、C.magnoliae、P.farinose、和C.glycerinogenes，细菌诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，和藻类诸如D.tertiolecta。
已知可以将通过操作已知甘油生物合成途径开发的重组微生物用作生产甘油的微生物。通常，在ATP存在的情况下，将碳底物诸如葡萄糖通过已糖激酶转变成葡萄糖-6-磷酸。通过葡萄糖-磷酸异构酶将葡萄糖-6-磷酸转变成果糖-6-磷酸，然后通过6-果糖磷酸激酶将其转变成果糖-1，6-二磷酸。通过醛缩酶将果糖-1，6-二磷酸转变成磷酸二羟丙酮(DHAP)。最终，通过NADH-依赖型甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)将DHAP转变成甘油-3-磷酸(G3P)，然后通过甘油-3-磷酸磷酸酶将其去磷酸化为甘油(Agarwal(1990)，Adv.Biochem.Engrg.41114)。
此外，已经建议了从DHAP生产甘油的备选途径(Wang et al.，1994 J.Bact.1767091-7095)。按照甘油生产的备选途径，通过特异性或非特异性磷酸酶将DHAP去磷酸化为二羟丙酮，然后通过二羟丙酮还原酶将其还原为甘油。在原核生物和Schizosaccharomyces pombe中发现二羟丙酮还原酶。已经建议了从DHAP中生产甘油的另一备选途径(Redkar，ExperimentalMycology，19241，1995)。按照该生产甘油的备选途径，通过丙糖-3-磷酸异构酶将DHAP异构化为甘油醛-3-磷酸，所述丙糖-3-磷酸异构酶是常见糖酵解酶。将甘油醛-3-磷酸去磷酸化为甘油醛，然后通过醇脱氢酶或NADPH-依赖型甘油脱氢酶将其还原。
在参与已知甘油生物合成途径的基因中，已知来自酿酒酵母的DARl和GPD1是编码将DHAP转变成G3P的G3PDH的基因。已知来自酿酒酵母的GPP2是编码将G3P转变成甘油的甘油-3-磷酸磷酸酶的基因。
此外，已知使用重组宿主细胞生产甘油的方法，所述重组宿主细胞通过将涉及甘油合成的外源基因引入依赖于天然甘油合成途径的宿主细胞中而获得。例如，美国专利号6,358,716公开了从重组微生物中生产甘油的方法，其包括(i)用表达盒转化合适的宿主细胞，所述表达盒包括(a)编码NADH依赖型甘油-3-磷酸脱氢酶或NADPH-依赖型甘油-3-磷酸脱氢酶的基因；和(b)编码甘油-3-磷酸磷酸酶(EC 3.1.3.21)的基因；(ii)在存在至少一个碳源的情况下，培养(i)的转化的宿主细胞，由此生产甘油，所述碳源选自由单糖、寡糖、多糖和单碳底物组成的组中；和(iii)回收(ii)中生产的甘油。
附图简述[8]
图1举例说明了甘油-3-磷酸脱氢酶活性测量的结果。
图2举例说明了甘油-3-磷酸磷酸酶活性测量的结果。
图3举例说明了包含多核苷酸的载体的构建方案，其中将编码甘油-3-磷酸脱氢酶的多核苷酸和编码甘油-3-磷酸磷酸酶的多核苷酸可操作地与合适的调节序列进行连接。
最佳方式[11]本发明将在下文中通过实施例更具体地进行描述。然而，随后的实施例仅为举例说明而提供因此本发明不受限于它们，或被它们所限制。
实施例1新基因的选择[13]在该实施例中，使用由美国的国家生物技术信息中心(NationalCenter of Biotechnology Information)(NCBI)(www.ncbi.nlm.nih.gov)提供的BLAST程序进行GPD1(NCBI X76859，SGDGPD1/YDL022W)和GPP2(SGDHOR2/YER062C)的同源性检索从而选择具有显著同源性但未知功能的基因，所述GPD1是催化将磷酸二羟丙酮(DHAP)转变成甘油3-磷酸的来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)的基因，所述GPP2是催化将G3P转变成甘油的来自酿酒酵母的甘油3-磷酸磷酸酶的基因。选定的基因是来自Candida albicans.的GPD2(SEQ ID NO3，CA0824)和RHR2(SEQ ID NO4，CA5788)。
实施例2Candida albicans的GPD2和RHR2基因的亚克隆[15]Candida albicans(KCTC7270)来自韩国生物科学和生物技术研究中心的韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures，KCTC)并且从该菌株中提取了它的基因组DNA。使用基因组DNA作为模板和一对具有SEQ ID NOS5和6的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物通过PCR扩增GPD2。另外，使用基因组DNA作为模板和一对具有SEQ ID NOS7和8的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物通过PCR扩增RHR2。
使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，U.S.A.)将GPD2和RHR2的各自扩增产物克隆到pCR 2.1载体中从而分别构建pCR2.1-TOPO-GPD2和pCR2.1-TOPO-RHR2。
实施例3将GPD2基因克隆到表达载体中[18]1.GPD2基因的扩增[19]使用在实施例2中构建的pCR2.1-TOPO-GPD2作为模板和一对具有SEQ ID NOS9和10的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物通过PCR扩增GPD2基因。所述具有SEQ ID NOS9和10的核苷酸序列的引物包含NheI和XhoI的限制酶切位点。
使用通过将Accur Power PCR Premix(Bioneer，Korea)和10ng的模板以及100pmol的每个引物(SEQ ID NOS9和10)混和在一起制备的20μlPCR溶液进行PCR。PCR条件如下于94℃变性30秒，于53℃杂交30秒，并于72℃聚合1分钟30秒，30个循环。
通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增的PCR产物。结果，发现扩增了1,129bp的DNA片段。分离和纯化后，使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，U.S.A.)将所述DNA片段克隆到pCR2.1载体上。
2.将GPD2基因克隆到pSE380表达载体中[23]用NheI和XhoI将上述部分1的包含扩增的PCR产物的pCR2.1载体进行消化从而生产GPD2基因，然后进行分离和纯化。同时，用NheI和XhoI对pSE380表达载体(Invitrogen，U.S.A.)进行消化，然后用CIP(牛小肠磷酸酶)进行处理。
将1μl T4DNA连接酶和1μl连接酶缓冲液加入以前制备的100ngGPD2基因和10ng的pSE380载体限制片段中，并将蒸馏水加入其中以达到10μl的总体积并于16℃温育6小时。反应终止后，用得到的载体产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α细胞，然后从转化的大肠杆菌DH5α细胞中分离和纯化包含GPD2基因的pSE380载体。
实施例4测量GPD2蛋白的酶活性[26]将在实施例3中获得的转化的大肠杆菌DH5α细胞接种到包含氨苄青霉素和IPTG各3μl的3ml的LB培养基中并于37℃培养16小时。将200μl的R-缓冲液(0.1M Tris-maleate，1ml DTT，pH6.5)和溶菌酶(1mg/ml)加入培养物中并进行悬浮。然后，将混悬液混合以25μl的氯仿并置于冰上约5分钟以获得无细胞提取物。
接下来，将1ml的蛋白质测定溶液(Bio-Rad)的5×稀释物加入无细胞提取物的10×稀释物中并温育5分钟以测量595nm的OD值。通过将测量的OD值应用到BSA(牛血清白蛋白)标准曲线上来计算无细胞提取物的总蛋白浓度。
无细胞提取物的酶促活性测量如下首先，将100μl的无细胞提取物，1μl的0.2M NADH，和1μl的0.2M磷酸二羟丙酮(DHAP)加入100μl的200mM Tris/HCl(pH7.5)和5μl的1M DTT中，然后将蒸馏水加入其中以得到1ml的总体积。将反应溶液于30℃温育4分钟，并于340nm测量OD值。
结果，至于用pSE380载体转化的对照大肠杆菌细胞，起始的OD340值是0.270并且温育4分钟后的OD340值是0.274。另一方面，至于包含GPD2的无细胞提取物，起始的OD340值是0.287并且温育4分钟后的OD340值是0.311。该结果显示对照和测试样品之间的OD值的显著不同。因此，可见，测试样品具有酶促活性(见表1和图1)。
表1
实施例5将RHR2基因克隆到表达载体中[32]1.RHR2基因的扩增[33]使用在实施例2中构建的pCR2.1-TOPO-RHR2作为模板和一对具有SEQ ID NOS11和12的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物通过PCR扩增RHR2基因。所述具有SEQ ID NOS11和12的核苷酸序列的引物包含NheI和XhoI的限制酶切位点。
使用通过将Accur Power PCR Premix(Bioneer，Korea)和10ng的模板以及100pmol的每个引物(SEQ ID NOS11和12)混和在一起制备的20μlPCR溶液进行PCR。PCR条件如下于94℃变性30秒，于50℃杂交30秒，并于72℃聚合1分钟30秒，30个循环。
通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增的PCR产物。结果，发现扩增了778bp的DNA片段。分离和纯化后，使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，U.S.A.)将所述DNA片段克隆到pCR2.1载体中。
2.将RHR2基因克隆到pSE380表达载体上[37]用NheI和XhoI降上述部分1的包含扩增的PCR产物的pCR2.1载体进行消化从而生产RHR2基因，然后进行分离和纯化。同时，用NheI和XhoI对pSE380表达载体(Invitrogen，U.S.A.)进行消化，然后用CIP进行处理。
将1μl T4DNA连接酶和1μl连接酶缓冲液加入以前制备的100ng的RHR2基因和10ng的pSE380载体限制片段中，并将蒸馏水加入其中以达到10μl的总体积并于16℃温育6小时。反应终止后，用得到的载体产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α细胞，然后从转化的大肠杆菌DH5α细胞中分离和纯化包含RHR2基因的pSE380载体。
实施例6测量RHR2蛋白的酶活性[40]将在实施例5中获得的转化的大肠杆菌DH5α细胞接种到3ml的包含氨苄青霉素和IPTG各3μl的LB培养基中并于37℃培养16小时。将200μl的R-缓冲液(0.1M Tris-maleate，1ml DTT，pH6.5)和溶菌酶(1mg/ml)加入培养物中并进行悬浮。然后，将混悬液混合以25μl的氯仿并置于冰上约5分钟以获得无细胞提取物。
接下来，将1ml的蛋白质测定溶液(Bio-Rad)的5×稀释物加入无细胞提取物的10×稀释物中并温育5分钟以测量595nm的OD值。通过将测量的OD值应用到BSA标准曲线上来计算无细胞提取物的总蛋白质浓度。
无细胞提取物的酶促活性测量如下首先，将100μl的1MTricine/HCl(pH7.0)，2.5μl的2M MgCl2，和10μl的1M DL-甘油-3-磷酸加入100μl的无细胞提取物中，然后将蒸馏水加入其中以得到1ml的总体积。将反应溶液于37℃温育4分钟，并按照Ames方法分析无机磷酸盐的浓度。
结果，至于用pSE380载体转化的对照大肠杆菌细胞，起始的OD820值是0.420并且温育4分钟后的OD820值是0.412。另一方面，至于包含RHR2的无细胞提取物，起始的OD820值是1.628并且温育4分钟后的OD820值是1.691。该结果显示对照和测试样品之间的OD值的显著不同。因此，可见，测试样品具有酶促活性(见表2和图2)。
表2
实施例7制备包含可操作地连接的GPD2和RHR2基因的多核苷酸和包含该多核苷酸的载体和微生物[46]在该实施例中，制备了包含多核苷酸的载体和包含所述载体的重组微生物，所述多核苷酸包括GPD2和RHR2基因，，其中GPD2和RHR2基因的每个与trc启动子和终止子可操作地连接。图3举例说明了多核苷酸和包含该多核苷酸的载体的制备方案。
1.包含GPD2的pSE380载体片段的制备[48]用NdeI对在实施例3中构建的包含GPD2基因的pSE380载体进行消化并用CIP进行处理。通过琼脂糖凝胶电泳分离和纯化包含GPD2的pSE380载体片段。
2.制备包含RBS(核糖体结合位点)和RHR2的多核苷酸使用通过将Accur Power HL-PCR Premix(Bioneer，Korea)与作为模板的在实施例5中构建的包含RHR2基因的pSE380载体与100pmole的每种引物(SEQ ID NOS13和14)混和在一起制备的20μl PCR溶液进行PCR，所述引物包含NdeI限制性酶切位点。PCR条件如下于94℃变性30秒，于50℃杂交30秒，并于72℃聚合1分钟30秒，30个循环。
通过琼脂糖凝胶电泳分离和纯化扩增的PCR产物，然后使用TOPOTA克隆试剂盒(Invitrogen，U.S.A.)将其克隆到pCR2.1载体中。
接下来，用NdeI限制酶消化pCR2.1载体以生产包括trc启动子，RHR2基因，和终止子的多核苷酸，然后通过琼脂糖凝胶电泳(见图3)对其进行分离和纯化。
3.构建包含多核苷酸的载体，所述多核苷酸包含可操作连接的GPD2和RHR2，并对大肠杆菌进行转化[54]将1μl T4 DNA连接酶和1μl连接酶缓冲液加入在部分1和2中制备的DNA片段中并将蒸馏水加入其中以得到10μl的总体积。将反应溶液于16℃温育6小时。用得到的载体产物转化大肠杆菌DH5α细胞。然后，从转化的大肠杆菌DH5α细胞中抽提载体并用限制酶进行处理以证实重组事件的发生。从转化的大肠杆菌DH5α细胞中获得的载体包含GPD2和RHR2基因，并被称为pCJR-017，在所述GPD2和RHR2基因中，每个都包括trc启动子和终止子。将转化的大肠杆菌DH5α细胞称为大肠杆菌DH5α(pCJP-017)并于2003年5月9日保藏在韩国微生物保藏中心(Korean CultureCenter of Microorganisms)(KCCM)(登记号KCCM-10494)。
实施例8从大肠杆菌DH5α(pCJP-017)中生产甘油[56]该实施例证实了实施例7的大肠杆菌DH5α(pCJP-017)可以在葡萄糖培养基中生产甘油。
首先，将大肠杆菌DH5α(pCJP-017)接种在3ml的包含3μl氨苄青霉素的LB培养基中并于37℃培养16小时。将1ml的培养物加入50ml的生产甘油的培养基中并于37℃在200rpm下离心48小时。
生产甘油的培养基(pH6.7)是在1L蒸馏水中8g KH2PO4、2g Na2HP4、0.75g(NH4)2SO4、8g的(NH4)2HPO4，6.6g的柠檬酸、2.05g的MgSO4、40mgCaCl2、40mg FeSO4和微量元素贮备液的无菌培养基。所述微量贮备液是在1L蒸馏水中2g MnSO4.H2O、0.8g CoCl2.6H2O、0.4g ZnSO4.7H2O、0.4gNa2MoO4.2H2O、0.2g CuCl2.2H2O、0.1g H3BO3和10ml的HCl(37％)的无菌溶液。除了20g/L的葡萄糖，将维生素B1、抗生素和IPTG添加到生产甘油的培养基中。
使用HPLC组件类型(Waters 510泵，Waters 717自动取样器，Waters400 RI 检测器，SP 4290积分仪)分析甘油和葡萄糖。
结果，尽管在用pSE380载体转化的对照大肠杆菌细胞中没有观察到甘油的生产，在测试细胞中观察到了4.328g/l的甘油。
发明方式[61]本发明提供具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的多肽，具有甘油-3-磷酸磷酸酶活性的多肽，和编码这些多肽的基因。
本发明还提供一种多核苷酸和包含该多核苷酸的载体，所述多核苷酸包括与合适调节序列可操作地连接的并编码具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的多肽的多核苷酸和与合适调节序列可操作地连接的并编码具有甘油-3-磷酸磷酸酶活性的多肽的多核苷酸。
本发明还提供包含载体的宿主细胞以及通过培养宿主细胞生产甘油的方法。
按照本发明的一个方面，提供了具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的并与SEQ ID NO1的氨基酸序列具有80％或更多同源性的多肽。优选地，所述多肽具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性并与SEQ ID NO1的氨基酸序列具有90％或更多的同源性。更优选地，所述多肽具有SEQ ID NO1的氨基酸序列。
按照本发明的另一个方面，提供了编码SEQ ID NO1的氨基酸序列的多核苷酸。优选地，所述多核苷酸具有SEQ ID NO3的核苷酸序列。
按照本发明的另一个方面，提供了具有甘油-3-磷酸磷酸酶活性的并与SEQ ID NO2的氨基酸序列具有80％或更多同源性的多肽。优选地，所述多肽具有甘油-3-磷酸磷酸酶活性并与SEQ ID NO2的氨基酸序列具有90％或更多的同源性。更优选地，所述多肽具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
按照本发明的另一个方面，提供了编码SEQ ID NO2的氨基酸序列的多核苷酸。优选地，所述多核苷酸具有SEQ ID NO4的核苷酸序列。
按照本发明的另一个方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸包括编码SEQ ID NO1的氨基酸序列的第一个多核苷酸和编码SEQ ID NO2的氨基酸序列的第二个多核苷酸，所述第一个多核苷酸和所述第二个多核苷酸与合适调节序列可操作连接。
按照本发明的另一个方面，提供了一种载体，所述载体包含一种多核苷酸，所述多核苷酸包括第一个多核苷酸和第二个多核苷酸，所述第一个多核苷酸和第二个多核苷酸与合适调节序列可操作连接。优选地，所述载体是pCJP-017。
用于本文时，术语‘载体’表示可携带细胞代谢非必需基因的染色体外的元件，通常是双链环状DNA。染色体外元件可以是自主复制的序列，基因组插入序列，噬菌体或核苷酸序列，线状或环状，单-或双链DNA或RNA。载体通常包含合适的转录或翻译调节序列，选择标记，或自主复制或染色体插入的活性序列(competent sequence)。合适的载体包括调节转录起始的基因的5′-区域和控制转录终止的DNA片段的3′-区域。术语‘合适的调节序列’指调节上述多核苷酸转录和翻译的序列。调节序列的实例包括核糖体结合位点(RBS)、启动子和终止子。用于本文时，所述启动子不特别受限，如果其是驱动基因转录起始的序列。例如，所述启动子可以是CYC1，HIS3，GAL1，GAL10，ADH1，PGK，PHO5，GAPDH，ADC1，TRP1，URA3，LEU2，ENO，TPI(对于在Saccharomyces中的表达是有效的)，lac，trp，λPL，λPR，T7，tac，或trc(对于在大肠杆菌中的表达是有效的)。终止子区域可以是来自优选的宿主细胞的各种基因并可以任选地被省略。
按照本发明的另一个方面，提供了包含一种多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸包括编码SEQ ID NO1的氨基酸序列的第一个多核苷酸和编码SEQ ID NO2的氨基酸序列的第二个多核苷酸，所述第一个多核苷酸和第二个多核苷酸与合适的调节序列可操作地连接。宿主细胞可以是埃希氏菌属(Escherichia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Ehterobacter)、梭菌属(Clostridium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、气杆菌属(Aerobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、曲霉属(Aspergillus)、酵母菌(Saccharomyces)、裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces)或Zygosaccharomyces的细胞。优选地，所述宿主细胞可以是埃希氏菌属细菌的细胞，并且更优选地是大肠杆菌的细胞。
按照本发明的另一个方面，提供了一种生产甘油的方法，所述方法包括在合适的培养基中培养包含一种多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸包括编码SEQ ID NO1的氨基酸序列的第一个多核苷酸和编码SEQ ID NO2的氨基酸序列的第二个多核苷酸，所述第一个多核苷酸和第二个多核苷酸与合适的调节序列可操作地连接；并从培养物中回收甘油。
培养基中包括可以在宿主细胞中被代谢的‘碳底物’或‘碳源’。所述碳底物或碳源可以选自由单糖、寡糖、多糖、单碳底物及其混合物组成的组中。
工业应用性[74]可以将本发明的多肽和编码多肽的多核苷酸有效用在重组甘油生物合成途径中。
可以将包括GPD2和RHR2的多核苷酸，所述GPD2和RHR2与合适调节序列可操作地连接，包含本发明的多核苷酸的载体和宿主细胞用在有效生产甘油的方法中。按照本方法，可以高产量生产甘油。
涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT细则13bis)
Form PCT/RO/134(1998年7月)
序列表<110>CJ株式会社<120>来自Candida Albicans的甘油-3-磷酸磷酸酶和甘油-3-磷酸脱氢酶，编码它们的基因，包含该基因的载体和宿主细胞，和使用该宿主细胞生产甘油的方法<130>CJ000530<160>14<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>371<212>PRT<213>Candida albicans<400>1Met Thr Thr Ser Pro Tyr Pro Ile Glu Thr Pro Phe Lys Val Cys Ile1 5 10 15Val Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Ala Val Ala Lys Leu Val Ala Glu20 25 30Asn Cys Ala Glu Lys Pro Asn Ile Phe Gln Arg Asp Val Lys Met Trp35 40 45Val Phe Glu Glu Glu Ile Glu Gly Arg Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn50 55 60Thr Glu His Glu Asn Val Lys Tyr Leu Pro Glu Ile Lys Leu Pro Thr65 70 75 80Asn Leu Val Ala Asn Pro Asp Ile Val Asp Thr Val Gln Asp Ala Asp85 90 95Leu Ile Val Phe Asn Ile Pro His Gln Phe Leu Gly Arg Ile Val Lys100 105 110Gln Ile Glu Gly Lys Val Lys Pro Thr Ala Arg Ala Ile Ser Cys Leu115 120 125Lys Gly Leu Asp Val Ser Pro Glu Gly Cys Lys Leu Leu Ser Thr Ser130 135 140Ile Thr Asp Thr Leu Lys Ile Tyr Cys Gly Val Leu Ser Gly Ala Asn145 150 155 160Ile Ala Asn Glu Val Ala Lys Gly Asn Trp Ser Glu Thr Ser Ile Ala165 170 175Tyr Thr Val Pro Glu Asp Phe Arg Gly Ala Gly Lys Asp Ile Asp Pro180 185 190Phe Ile Leu Lys Glu Ala Phe His Arg Pro Tyr Phe His Val Arg Val195 200 205Ile Glu Asp Val Val Gly Ala Ser Ile Ala Gly Ala Leu Lys Asn Val210 215 220Ile Ala Cys Ser Val Gly Phe Val Glu Gly Ala Gly Trp Gly Asp Asn225 230 235 240Ala Lys Ala Ala Ile Met Arg Ile Gly Ile Lys Glu Thr Ile Arg Phe245 250 255Ala Ser Tyr Trp Glu Leu Phe Lys Ile Lys Ala Leu Ser Pro Pro Asn260 265 270Pro Lys Thr Phe Thr Glu Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr275 280 285Thr Cys Ser Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Arg Tyr Met Ile Lys290 295 300
Asn Asn Val Asp Ala Phe Glu Ala Glu Lys Ile Val Leu Lys Gly Gln305 310 315 320Ser Ser Gln Gly Ile Leu Thr Ala Lys Glu Val His Glu Leu Leu Thr325 330 335Asn Phe Asn Leu Gln Asp Glu Phe Pro Leu Leu Glu Ala Thr Tyr Lys340 345 350Val Ile Tyr Glu Asn Gly Ser Val Asp Asp Phe Pro Gln Leu Leu Glu355 360 365Gly Asp Gln370<210>2<211>254<212>PRT<213>Candida albicans<400>2Met Thr Lys Thr Gln Gln Pro Ala Val Phe Tyr Val His Ala Ala Leu1 5 10 15Phe Asp Cys Asp Gly Thr Leu Val Asn Ser Thr Gly Ala Ile Ser Glu20 25 30Phe Trp Arg Asp Phe Gly Lys Thr Arg Pro His Val Asp Pro Glu Glu35 40 45Ile Ile Arg Thr Ser His Gly Cys Arg Thr Phe Asp Val Ile Ala Lys50 55 60Trp Ser Pro Glu Asp Ala Ile Glu Glu Gln Val Thr Ala Trp Glu Gly65 70 75 80Ala Ile Pro Asp Thr Phe Gly His His Ala Lys Pro Ile Pro Gly Ser85 90 95Val Glu Leu Val Lys Ser Phe Asp Lys Leu Ser Lys Glu Ala Thr Glu100 105 110Asn Gly Lys Gln Arg Trp Ala Val Val Thr Ser Gly Thr Leu Pro Leu115 120 125Ala Thr Lys Trp Leu Lys Leu Leu Ser Ile Glu Arg Pro Asp Cys Phe130 135 140Ile Thr Ala Glu Lys Val Thr Lys Gly Lys Pro His Pro Gln Gly Tyr145 150 155 160Gln Ala Ala Arg Asp Thr Leu Gly Tyr His Asp Ala His Tyr Lys Val165 170 175Val Val Phe Glu Asp Ala Pro Ala Gly Ile Thr Ala Gly Lys Gly Ala180 185 190Gly Ala Met Val Val Gly Ile Cys Ser Thr Tyr Asp Pro Glu Lys Val195 200 205Arg Lys Ser Gly Ala Asn Ile Val Val Lys Asp Leu Ser Ser Phe Arg210 215 220Ile Asp Ser Tyr Ash Lys Glu Thr Asp Glu Phe Lys Val Val Val Asp225 230 235 240Asp Tyr Phe Tyr Ala Asp Glu Gln Phe Leu Gln Glu Ser Ala245 250<210>3<211>1116<212>DNA
<213>Candida albicans<400>3atgactactt ccccatatcc aattgaaact ccatttaaag tttgtattgt cggttccggt 60aactggggta ctgcagttgc aaaattagtt gctgaaaact gtgctgaaaa accaaatatt 120ttccaaagag acgttaaaat gtgggttttc gaagaagaaa ttgaaggtag aaaattgaca 180gaaataatta acaccgaaca tgaaaatgtt aaatacttgc cagaaattaa attgccaact 240aacttggttg ccaacccaga cattgttgac actgttcaag atgccgactt gattgttttc 300aatattccac atcaattctt gggtagaatt gtcaaacaaa tcgaaggtaa agtgaaacca 360actgctagag ccatttcatg tttgaaaggt ttggatgtga gtccagaagg ttgcaaattg 420ttgtcaacct ctatcactga tactttgaag atttactgtg gtgtcttatc tggtgctaat 480attgccaacg aagttgccaa aggtaactgg tcagaaactt ccattgccta cactgttcca 540gaagatttca gaggtgccgg taaagatatt gatccattta ttttgaaaga agctttccac 600agaccatact tccatgtcag agttattgaa gatgttgttg gtgcctctat tgctggtgcc 660ttaaagaatg tcattgcctg ttctgttggt ttcgttgaag gtgctggctg gggtgacaat 720gctaaagctg ctattatgag aatcggtatc aaagaaacca tccgttttgc ttcttactgg 780gaattgttca agatcaaggc tttgtctcca ccaaacccaa aaactttcac cgaagaaagt 840gctggtgttg ctgatttgat cactacttgc tcaggtggta gaaatgttaa agtcgccaga 900tacatgatta aaaacaatgt cgatgcattt gaagctgaaa aaattgtttt gaaaggacaa 960agttctcaag gtatcttgac tgccaaagaa gttcacgaat tgttaacaaa tttcaacctt1020caagacgaat tcccattact cgaagccacc tataaagtta tctacgagaa tggtagtgtt1080gacgatttcc cacaattatt agaaggtgat caataa 1116<210>4<211>765<212>DNA<213>Candida albicans<400>4atgacaaaga ctcaacaacc agctgttttt tacgttcacg ccgctttatt tgactgtgat 60ggtactttgg ttaactccac tggtgctatt tctgaattct ggagagattt cggaaaaact120agacctcatg ttgatccaga agaaattatc agaacttccc atggttgccg tacatttgat180gtcattgcca aatggtcacc ag4agatgca attgaagaac aagtcactgc atgggaaggt240gctattcctg acacttttgg ccaccacgcc aagccaattc caggttccgt tgaattggta300aaatcattcg ataaactttc taaagaagct actgaaaatg gtaaacaaag atgggctgtt360gtcacttctg gtactttgcc attagccacc aaatggttga aattattgtc tattgaaagg420ccagactgtt ttataaccgc tgaaaaagtg actaaaggta aaccacatcc acaaggttac480caagctgcta gagatacttt gggataccat gacgcccact acaaagttgt tgtgtttgaa540gacgctccag ctggtataac cgcaggtaaa ggtgctggcg ccatggttgt cggtatttgc600tcaacttacg atcctgaaaa agttagaaaa tcaggtgcta acattgttgt caaagattta660tccagcttta gaatcgactc atacaacaag gaaactgacg aattcaaggt tgttgttgat720gattatttct acgctgatga gcaattttta caagaatctg cttaa765
<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于从Candida albicans扩增GPD2的正向引物<400>5cccatcttgt tccacaattt tact 24<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于从Candida albicans扩增GPD2的反向引物<400>6tgtacaaaac agtgatatca ctgc 24<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于从Candida albicans扩增RHR2的正向引物<400>7ccaatgattt ccacattcgt aaaa 24<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于从Candida albicans扩增RHR2的反向引物<400>8tagcggacca ttttacacac aatt 24<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于从pCR2.1-GPD2载体扩增GPD2的正向引物<400>9gctagcaatg actacttccc cata 24<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于从pCR2.1-GPD2载体扩增GPD2的反向引物<400>10
ctcgagaccc atttattgat cacc 24<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于从pCR2.1-RHR2扩增RHR2的正向引物<400>11gctagcaatg acaaagactc aaca 24<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于从pCR2.1-RHR2扩增RHR2的反向引物<400>12ctcgagttaa gcagattctt gtaa 24<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>包含NdeI位点的正向引物<400>13catatgttgc gccgacatca taac 24<210>14<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>包含NdeI位点的反向引物<400>14catatgtgtc tcatgagcgg atac 2权利要求
1.一种多肽，其具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性并与如SEQ ID NO1表示的氨基酸序列具有80％或更多的同源性。
2.一种编码如SEQ ID NO1表示的氨基酸序列的多核苷酸。
3.一种多肽，其具有甘油-3-磷酸磷酸酶活性并与如SEQ ID NO2表示的氨基酸序列具有80％或更多的同源性。
4.一种编码如SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多核苷酸。
5.一种包含一种多核苷酸的载体，所述多核苷酸包含编码如SEQ ID NO1表示的氨基酸序列的第一个多核苷酸和编码如SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的第二个多核苷酸，所述第一个多核苷酸和第二个多核苷酸与合适的调节序列可操作地连接。
6.权利要求5的载体，其是pCJP-017。
7.一种包含一种多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸包含编码如SEQ IDNO1表示的氨基酸序列的第一个多核苷酸和编码如SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的第二个多核苷酸，所述第一个多核苷酸和第二个多核苷酸与合适的调节序列可操作地连接。
8.权利要求7的宿主细胞，其是大肠杆菌。
9.权利要求8的宿主细胞，其是大肠杆菌DH5α(pCJP-017)(登记号KCCM-10494)。
10.一种生产甘油的方法，所述方法包括在合适的培养基中培养权利要求7的宿主细胞；和从培养物中回收甘油。
全文摘要
本发明提供一种具有甘油－3－磷酸脱氢酶活性并与如SEQ ID NO1表示的氨基酸序列具有80％或更多同源性的多肽和一种具有甘油－3－磷酸磷酸酶活性并与如SEQ ID NO2表示的氨基酸序列具有80％或更多同源性的多肽。本发明还提供一种生产甘油的方法，所述方法包括培养用包含多核苷酸的载体转化的宿主细胞，所述多核苷酸包括编码如SEQ ID NO1表示的氨基酸序列的第一个多核苷酸和编码如SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的第二个多核苷酸，所述第一个多核苷酸和第二个多核苷酸与合适的调节序列可操作地连接；从培养物中回收甘油。
文档编号C12N9/02GK1798835SQ200480015572
公开日2006年7月5日 申请日期2004年5月28日 优先权日2003年6月3日
发明者朴英薰, 赵光命, 严惠媛 申请人:Cj株式会社