专利名称：无荚膜的多杀巴斯德氏菌hyaE缺失型突变株的制作方法
技术领域：
本发明涉及无荚膜的多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)突变株以及包含所述突变株的疫苗。
发明的技术背景多杀巴斯德氏菌(P.multocida)与许多疾病有关，包括小牛和周岁幼畜的脑膜炎、羔羊淋巴腺炎、马和驴的败血症、牛败血性巴斯德氏菌病(出血性败血症，长须病)、猪巴斯德氏菌病、猪巴斯德氏菌败血症、肺炎和禽霍乱。
现有技术中需要能够用来提供有效对抗多杀巴斯德氏菌所致疾病的保护性免疫力的疫苗。
发明概述本发明的一个实施方式是提供一种分离的A血清型多杀巴斯德氏菌(P.multocida)，其包含hyaE基因的全部缺失或部分缺失。上述缺失使细菌的毒性减弱。
本发明的另外一个实施方式是提供一种能够诱导产生抗野生型多杀巴斯德氏菌的保护性免疫力的疫苗。所述疫苗包含含有hyaE基因全部缺失或部分缺失的A血清型多杀巴斯德氏菌，和药学上可接受的载体。所述缺失突变减弱了细菌的毒性。
本发明的其它实施方式是提供适用于哺乳动物(包括家畜、有蹄动物和宠物)或鸟类(尤其是家禽)的饲料，其中所述饲料包含含有hyaE基因全部缺失或部分缺失的A血清型多杀巴斯德氏菌。所述突变减弱了细菌的毒性。
本发明的另外一种实施方式是提供了一种诱导产生抗野生型多杀巴斯德氏菌的保护性免疫力的方法。将A血清型多杀巴斯德氏菌施用给动物受试者，如哺乳动物(包括家畜、有蹄动物和宠物)或者鸟类(包括家禽)。上述细菌包含hyaE基因的全部缺失或部分缺失，所述缺失减弱了细菌的毒性。所述细菌由此可以向动物受试者提供抗野生型多杀巴斯德氏菌的保护性免疫力。
因此，本发明提供了用于诱导产生抗多杀巴斯德氏菌所致疾病的保护性免疫力的工具和方法。
附图1描述了hyaE缺失突变株的构建过程。附图1A是预期缺失的示意图。附图1B是包含有缺失的hyaE插入片段的质粒。
发明详述可以将无荚的A血清型多杀巴斯德氏菌hyaE缺失突变株施用给哺乳动物(包括家畜、有蹄动物和宠物)和鸟类(包括家禽)，以提供抗野生型多杀巴斯德氏菌的保护性免疫力，如预防或降低家畜、有蹄动物和宠物所患疾病(如出现性败血症或肺炎)的严重程度，以及预防或降低鸟类(尤其是家禽)所患禽霍乱的严重程度。术语“无荚膜突变株”、“无荚膜细菌”和“突变细菌”在本说明书中可以互换使用。
无荚膜的A血清型多杀巴斯德氏菌hyaE缺失突变株通过对位于荚膜生物合成基因座内的hyaE基因进行诱变，可以产生出无荚膜的A血清型(如血清型A1、A3、A4)多杀巴斯德氏菌hyaE缺失突变株。在A血清型细菌内，位于荚膜生物合成基因座内的基因是公知的，并且已经进行了完整的测序。Chung等，FEMS Microbiol.Lett.166(2)，289-96，1998。A1血清型基因座包含位于1区的四个开放阅读框(ORFs)(hexA、hexB、hexC和hexD)、位于2区的五个ORFs(hyaA、hyaB、hyaC、hyaD和hyaE)，以及位于3区的两个ORFs(phyA和phyB)。
在某些实施方式中，所述突变细菌不包含任何抗生素抗性基因或外源DNA，这使它们在环境和生态学上更具吸引力。实施例1描述了一种产生缺失突变株的方法，但是还可以应用现有技术中已知的任何其它方法来产生缺失突变株。在实施例1中还公开了用于确认突变株具有无荚膜表型的简单测试方法。
带有任意的hyaE基因全部缺失或部分缺失的多杀巴斯德氏菌均包含在本发明范围内，只要这种缺失能够使细菌减毒即可。在其中一个实施方式中，缺失突变导致了hyaE蛋白第239-359位氨基酸的缺失(也就是在所编码的hyaE蛋白中不存在239-359位氨基酸)。在另外一个实施方式中，突变的hyaE开放阅读框包含SEQ ID NO7或SEQ ID NO8的序列。
如果在将易感靶物种暴露于所述突变细菌后，杀死半数易感靶物种所需的野生型多杀巴斯德氏菌的剂量提高(也就是LD50值提高)，和/或在将靶物种暴露于突变细菌后，与暴露于野生型细菌相比降低了病理损害(例如肺炎)，和/或在将靶物种暴露于突变细菌后，与暴露于野生型细菌相比降低了多杀巴斯德氏菌所存在的粘膜表面上的共生集落化，则上述突变细菌就是减毒的。
可以通过本领域已知的各种方法来评估毒性是否减弱。例如，对于败血性疾病来说(例如禽霍乱)，可以通过鼻内、静脉内、肌内或腹膜内途径，将易感物种暴露于野生型有机体下，然后比较野生型和突变型生物体之间导致疾病时所需的剂量。对于肺炎性疾病，人们可以通过鼻内、气管内或肺内途径使易感动物暴露于野生型生物体，然后比较分别暴露于突变型和野生型生物体的动物所表现出的临床症状和病理损害的严重程度。对于粘膜集群，可以通过口服、鼻内或扁桃体内途径使动物分别暴露于野生型生物体，然后比较在暴露之后以一定的间隔从鼻腔粘液或扁桃体冲洗标本中回收到的生物体的量。
疫苗制备包含突变细菌的疫苗可以单独施用，或者作为多价疫苗的一种组分而施用，也就是与其它疫苗组合施用。存在于疫苗配方中的突变细菌可以是活的或是死的；活的或死的细菌可以是冻干的，并且可选地是重构的，这在本领域中是已知的。疫苗可以方便地在试剂盒中提供，试剂盒中还可以包含合适的标记和将疫苗施用给动物受试者(例如家畜、有蹄动物、宠物)或鸟类(如家禽)的说明。
包含无荚膜突变株的疫苗还可以包含药学和兽医学上可接受的载体。这样的载体对于本领域技术人员来说是公知的，这样的载体包括但不限于大的代谢缓慢的高分子，如蛋白质、多糖、多聚乳酸、多聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚体和无活性的病毒颗粒。药学和兽医学上可接受的盐也可以用于疫苗，例如矿物盐如氢氯化物、氢溴化物、磷酸盐或硫酸盐，以及有机酸盐如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐或苯甲酸盐。疫苗中还可以包含液体，如水、盐水、甘油和乙醇，以及如湿润剂、乳化剂或pH缓冲试剂等物质。也可以将脂质体用作突变细菌的载体。参见美国专利5,422,120、WO95/13796、WO91/14445或EP524,968B1。
如果需要，也可以向疫苗中加入佐剂。有用的佐剂包括但不限于，表面活性剂(如十六胺、十八胺、溶血卵磷脂、二甲基二(十八烷基)溴化铵、N，N-二(十八烷基)-n’-N-双(2-羟基乙基-丙烷二胺)、甲氧基十六烷基甘油和聚丙二醇与环氧乙烷多羟基共聚物(pluronic polyol)；聚阴离子(如吡喃、硫酸葡聚糖、聚IC、聚丙烯酸、carbopol)，肽(例如胞壁酰基二肽、二甲基甘氨酸、吞噬细胞增强素(tuftsin))，油乳剂，明矾和它们的混合物。
治疗哺乳动物，尤其是家畜、有蹄动物和宠物“哺乳动物”包括单孔类动物(如鸭嘴兽)、有袋动物(如袋鼠)和胎盘哺乳动物，胎盘哺乳动物包括家畜(用于提供食物、奶或纤维的家养动物，如猪、羊、牛和马)，和宠物(如狗、猫)。“有蹄动物”包括但不限于，牛(牛科动物)、水牛、野牛、绵羊、猪、鹿、大象和牦牛。上述各类动物均包括成年动物和处于发育期的动物(如小牛、小猪、小羊等)。本发明的细菌可以施用给成年哺乳动物，或者可以施用给处于发育期的哺乳动物，优选家畜、有蹄动物或宠物。
给哺乳动物(如家畜、有蹄动物或宠物)施用本发明细菌的一种简便方法是口服施用(如掺入饲料或饮用水或饵料中)。将细菌掺入饲料中与饲料一起混合或者将细菌包裹到饲料的表面均是特别方便的。典型的，给予大型动物(如家畜/有蹄动物如牛)的剂量大约是106、5×106、107、5×107、108、5×108、109、5×109、或1010cfu；如果是将细菌包裹到饲料的表面，则剂量大约是108、5×108、109、5×109cfu。也可以给予大约106到大约108、大约2×106到大约3×108、大约2.4×106到大约2.6×108、大约104到大约106cfu或大约104到大约109cfu的剂量。可以针对小型家畜/有蹄动物调整剂量，如羊(例如大约104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108cfu)。类似的，针对宠物可以容易地推导出类似的给药方案。
尽管由于便于投递而优选口服施用途径，但是也可以使用其它的接种途径。这样的途径包括但不限于，皮下、肌内、静脉内、皮内、鼻内、气管内等。可以将本发明的细菌植入耳内。也可以通过气雾剂、滴眼接种或划痕的形式施用细菌。
治疗鸟类“鸟类”包括野生鸟(如猎鸟)和家养鸟(如家禽或宠物)，同时包括成年鸟和处于发育期的鸟(如小鸟、小鸡、幼禽等)。“家离”或“家禽鸟类”包括保留、收获或饲养以得到肉或蛋的所有鸟类，包括鸡、火鸡、鸵鸟、斗鸡、乳鸽(squab)、珍珠鸡(guineafowl)、稚鸡、鹌鹑、鸭子、鹅和鸸鹋。
可以通过任何已知的或标准的技术给鸟类施用本发明的细菌，这样的技术包括经粘膜或肌内注射。在孵化场，可以使用如卵内接种、喷雾接种或皮下接种技术来施用细菌。在农场，可以使用如划痕、喷雾接种、滴眼接种、饮水接种、饲喂接种、翅翼接种、皮下接种和肌内接种技术来施用细菌。
有效剂量取决于鸟的大小。剂量的范围可以是例如从大约102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、109到5×109cfu，并可发生变化。
本说明书中所记载的所有专利和专利申请均全文引入本申请。上述描述在一般意义上阐述了本发明。参考下面的特定实施例，将会更加完整地理解本发明，但是提供这些实施例的目的仅是为了阐述本发明，不构成对本发明的限制。
实施例1无荚膜的hyaE缺失的多杀巴斯德氏菌突变株的产生通过对阻遏荚膜构建模块N-乙酰基-D-葡萄糖胺合成的hyaE基因的编码区域进行缺失，制备出1059(鸟，血清型A3)和1062(牛，血清型A3)菌株的多杀巴斯德氏菌突变体。通过PCR扩增得到1059和1062 hyaE基因的编码区(分别为SEQ ID NO5和6)，所使用的正向引物是5’-ATGAAAAAGGTTAATATCATTGG-3’(SEQ ID NO1)，反向引物是5’-TTAACCTTGCTTGAATCGTTTACC-3’(SEQ ID NO2)。所有的引物均是由IntegratedDNA Technologies，Inc.，Coralville，IA利用寡核苷酸合成仪(AppliedBiosystems Inc.)合成的。实施PCR反应使用的是GeneAmp LX PCR试剂盒(PEApplied Biosystems，Foster City，CA)，使用的仪器是Perkin Elmer GeneAmp9600热循环仪。反应条件是30个循环，每个循环包括95℃30秒，48℃45秒和72℃60秒。
由上述PCR反应所产生的两个hyaE片段均由各自的起始Met密码子开始，在各自的终止密码子处结束。将上述PCR片段连接到pCR2.1(InvitrogenInc.，LaJolla，CA)中，然后电穿孔到E.coli株系DH11S(LifeTechnologies，Rockville，MD)中，从而产生质粒pCR2.1hyaE1059和pCR2.1hyaE1062。通过碱性SDS方法分离上述两种质粒构建体，然后使用标准方法通过CsCl离心使之纯化。使用购买自PE Applied Biosystems公司的DyeTerminator Chemistry试剂盒，对上述两个hyaE基因的两条链进行测序。将样品在ABI Prism 377D NA测序仪上由Nucleic Acids Facility，Iowa StateUnivers ty，Ames，IA运行。
每一菌株的hyaE结构基因的长度为1869bp。由于序列差异(主要在编码区的3’末端序列存在)，因此分别为每一株系构建了独特的hyaE置换质粒，以用来构建两个多杀巴斯德氏菌突变株。使用缺失引物5’-AAAGATATCTTGGTTTACTTCAATAATTTC-3’(SEQ ID NO3)和5’-AAAGATATCACTGCATCTGTTCAATCAACGAGC-3’(SEQ ID NO4)，通过PCR获得了质粒pCR2.1hyaE1059和pCR2.1 hyaE1062中包含的各hyaE基因的精确缺失。缺失引物退火到克隆的基因上，两者之间的距离大约是300bp，但两个引物分别向外延伸，朝向质粒载体一方，而不是向内延伸。上述PCR反应扩增出完整的克隆载体和所插入基因的两个末端，而没有扩增大约300bp的“缺失片段”。扩增产物是线性的，两端为hyaE基因的两个末端片段，中间为质粒载体。引物在各自的5’末端分别包含EcoRV位点(GATATC)。因此线性扩增产物的末端同样包含EcoRV位点。参见附图1A和1B。
将所得到的PCR片段用EcoRV限制性内切酶进行酶切，以去除各自末端的特定序列。然后将上述片段进行连接，从而产生切除了715到1082位核苷酸的阅读框内缺失体。将具有8个碱基对的SmaI接头(5’-CCCCGGGG-3’)插入到多杀巴斯德氏菌1062的EcoRV缺失位点，以确保使所产生的突变具有无荚膜表型。没有将这种DNA插入到多杀巴斯德氏菌1059hyaE插入片段的缺失位点上。
1059和1062突变hyaE片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO7和8所示。在1059和1062中，hyaE蛋白的239到359位氨基酸被缺失。此外，在上述两个菌株中，原来位于360位的亮氨酸变为异亮氨酸。株系1062在缺失位点处添加了8个额外的氨基酸，这8个氨基酸(Pro Arg Gly Pro Gly Ala Pro Gly；SEQ ID NO9)恰位于位点360的上游。
将突变后的hyaE片段亚克隆到质粒pBCSK(Strategene Inc.)的多克隆位点内的EcoRI位点处，之后将Tn903卡那霉素抗性因子插入到邻近的BamHI位点，从而分别产生出pBCSKΔhyaEkanr1059和pBCSKΔhyaEkanr1062。置换质粒的构建过程如下，将利用BssH2产生的1059和1062ΔhyaEkanr片段与1.2kb的温敏性pBB192的1.2kb温度敏感性复制起点相连接，其中所述复制起点是由pBCSK(Stratagene，Inc.)的BssH2位点切出的。参见美国专利5,840,556。因为ColE1起点在多杀巴斯德氏菌中无活性，因此只有产生质粒p192oriΔhyaEkanr1059或p192oriΔhyaEkanr1062的连接产物才能够在宿主中复制。
通过电穿孔将置换质粒导入合适的多杀巴斯德氏菌株中。首先使细胞在Columbia肉汤培养基上生长，然后按照如下步骤准备用于电穿孔。在5000xg下离心15分钟，得到细胞团，然后在0℃用100ml 272mM的蔗糖溶液洗涤一次。将细胞团在冰浴中重悬浮(细菌沉淀272mM蔗糖溶液的比例是1∶3)。将感受态细菌(100μl)置于0.1cm的电穿孔杯(Bio-Rad)中与200ng质粒DNA混合，其中所述质粒DNA既可以是未甲基化的，也可以是在体外用HhaI进行了甲基化的。在加入DNA后，立即将细胞进行电穿孔(Gene pulser，Bio-Rad)，所使用的条件是18,000V/cm，800欧姆(ohm)和25mFd，时间常数为11到15msec。
向已经进行了电穿孔的细胞中加入Columbia肉汤培养基(1ml，0℃)，然后在25℃温育上述重悬浮物大约25分钟。使细胞在30℃恢复2小时，然后铺到含有50μg/ml卡那霉素的Columbia琼脂培养板上。在30℃温育24小时后观察到菌落。使转化细胞在包含卡那霉素的肉汤培养基中于30℃生长过夜。然后将细胞铺到含有50μg/ml卡那霉素的右旋糖淀粉琼脂培养板上，并在3℃使之生长24小时。
在不适宜质粒复制的温度下含有整合质粒的细胞能够在抗生素选择中存活，因为置换质粒的整合会引起无荚膜表型，因此可以鉴定出这些整合了质粒的细胞。区分生长在右旋糖淀粉琼脂培养板上的菌株1059和1062的有荚膜和无荚膜多杀巴斯德氏菌落是很容易的。两个株系的野生型有荚膜菌落均含有透明质酸，其是荚膜的主要组成成分，它使菌落看上去比较粘滑；当在斜向透射灯下观察时，这些菌落显示出类似珍珠的彩虹色。相比之下，无荚膜的单交换突变株不是粘滑的，也不具有彩虹色。
将单交换突变株转移到没有添加抗生素的5ml Columbia肉汤培养基中，并在30℃温育过夜，使质粒从染色体上分离下来。然后转移到不含抗生素的右旋糖-淀粉琼脂培养板上，在38℃培养12小时。鉴定双交换突变株的起始测试包括将表现为无荚膜的菌落细胞陈列影印铺板到右旋糖淀粉琼脂培养板上，其分别是含有抗生素的或不含有抗生素的，然后在38℃培养细胞。使用hyaE正向和反向引物对不能在抗生素培养板上生长的无荚膜菌落进行PCR分析。使用琼脂糖凝胶电泳比较上述PCR产物与野生型亲本的PCR产物之间的大小。
同时还对疑似多杀巴斯德氏1059和1062hyaE缺失突变株进行了测试，以确定它是否具有卡那霉素抗性基因。具有“纯粹“hyaE缺失的推定突变株不具备抗生素抗性序列。另外还使用圆盘扩散酶联分析(Kirby-Bauer test，Bauer等，Am.J.Clin.Path.45，493-96，1966)和墨汁染色分析(Indian ink stainingassay，Collins和Lyne，MICROBIOLOGICAL METHODS，Butterworths，Boston，Mass.，1976，110页)来进一步确认上述两个hyaE突变株具有无荚膜表型。
实施例2使用1059ΔhyaE多杀巴斯德氏菌菌株接种火鸡幼禽使用三周龄的宽-胸白色火鸡幼禽评估上述1059ΔhyaE多杀巴斯德氏菌菌株的减毒。每组四只幼禽，将悬浮在胰胨培养液中(0.1ml)的野生型或无荚膜突变株培养物指数生长期培养物的10倍系列稀释液对各组进行肌内注射。在攻击后对幼禽观察7天。
对于注射了野生型菌株的幼禽，其LD50值(也就是杀死半数幼禽所需的细菌量)小于103，而对于注射了hyaE突变株的幼禽，其LD50值超过107。
实施例3用1062ΔhyaE多杀巴斯德氏菌菌株接种小公牛(steer calves)将六只Holstein小公牛(体重大约是500磅)暴露于1062ΔhyaE多杀巴斯德氏无荚膜突变株。上述菌株是通过在颈部进行皮下注射(108cfu)或通过表面包裹饲料(109cfu)而施用的。
对上述暴露均没有观察到副作用。对于试验的剩余组，粘膜接种物在上颚扁桃腺部位发生定居(5周)。用毒性亲本株系进行气管内攻击试验(总剂量为1010cfu，共15ml)，在对照小公牛中产生了短暂的发热现象(1-2天)，但在攻击10天后，在对照或接种小公牛中观察到轻微的肺部炎性变化或没有变化。
序列表<110>Biotechnology Research Development CorporationThe United States of America，as Represented by the Department ofAgriculture<120>无荚膜的多杀巴斯德氏菌hyaE缺失突变株<130>000295.00018<150>US60/＿＿,＿＿(代理案卷号000295.00015)<151>2003-07-02<160>9<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>23<212>DNA<213>多杀巴斯德氏菌<400>1atgaaaaagg ttaatatcat tgg 23<210>2<211>24<212>DNA<213>多杀巴斯德氏菌<400>2ttaaccttgc ttgaatcgtt tacc 24<210>3<211>30<212>DNA<213>多杀巴斯德氏菌<400>3aaagatatc ttggtttactt caataatttc 30<210>4<211>33<212>DNA<213>多杀巴斯德氏菌<400>4aaagatatca ctgcatctgt tcaatcaacg agc33<210>5<211>1870<212>DNA
<213>多杀巴斯德氏菌<400>5tatgaaaaag gttattatca ttggacataa acagtctaac tatcaagatg ttgaaaaggt 60ttttcaatgt tatgggatga atcccccgct tccatcaaaa cgtgaaaaaa tgtcccccat 120cgaaattggc catgtgctta ataaagtatt accaagtctt gagcacacac ctaaaaatgt 180atctttactt tctaataaga aaagcaaaat aaaaaaaggg aattcagcca aaaataaatc 240tcataagcac gctaaaacga acacaataca aacgacttcg agcatctggg ataacttatc 300tctcgatttg atgctcgcga atatcgagca aaatttttgg ggatggtctg atcctaatgc 360aattcaaata ttagattatt gggctaacct tgacccaaac attcatttcg tctttgttta 420tgataagcca gaaaatttat tccaatatca tagcttagaa gaggctctca aattagataa 480acacaccgta caagaaaaat ttgaagagtg gcaaacctac aatgaaaaaa tcctaactta 540ctttaataaa tataaagatc gtagtgtatt actgaataca caacaactcc aaaatactaa 600aaaaacatca ctgtctgaaa tttataaaca tatttctgca cctgatgcat tagtcaaaaa 660actgaatgaa ccttctctaa ataaagagat ggaaattatt gaagtaaacc aagatttatc 720tcaccaagaa gaatgtccac tgtctaactt tattgttagc caaattataa aaaattctcc 780tactgttacg caggtatatg aagaattaca gtcgcatgct gatctgcctt atatttcaga 840acaaaaatta gtaaatgatg ccgattttgc tctccttgca tggaaagata tgattcaaaa 900acaagtcgat gcaaatcaat atcaacatga aaaagaatta gaacttagca caataaaaga 960acgtcaatta gaggtcacag agaaatatca attgacggaa caaaaactgt cagaaacaca1020aaaagaaatc gaacaaatta aagatgaaaa tagaaaagta aaatctgaaa aagcaaaact1080cactgcatct gttcaatcaa cgagcaaaat actttctgag aaagaaaaag agatttcttg1140cataaaaagt gaaaatacaa agattaaaga agaaaaaatt aaaattgatg aagcatacca1200cttaaccaag aaaaccttgt cggataaaga aaaagccctc aaaacgcatc aagatgaaat1260tgaagcgctc aagataattt ttaatgaaaa tatttccgta caagaagata tgcaagaaaa1320atttcaggaa accaataaaa gaaaacaaga acttgaacaa gagctaaaag ccatatcgga1380taagaaagca ttattagaaa cagaaaacag ccaaaaaacc caagtatctg agtctttaga1440aaatgaaaat aaagtgttat tagctcaact ccaactcatt caagaagaat tagaaaaact1500ttatattgac aatcaagtat taaaagctaa accacgcctt tacggtgcag ctgatcgcat1560aaaaaaccaa ttaacttatc gactaggtta caaaatacaa agacatggaa gaagtctatt1620tggtctcatt tttcttcctt tcatcttatt tttcacctat ctgggcttta aaagagagat1680gaaaaagtac gaatggaata ccctcccacc aattcacgag tatgaagacg cgcataaagc1740aaaccgcatt aaaagccatt tatcttataa attgggtgtc atctttttac aagaaatcaa1800aaatccgttt aagtggctta ctctccctta caaactgatt aaagaaggta aacgattcaa1860gcaaggttaa 1870<210>6<211>1870<212>DNA<213>多杀巴斯德氏菌<400>6tatgaaaaag gttattatca ttggacataa acagtctaac tatcaagatg ttgaaaaggt 60ttttcaatgt tatgggatga atcccccgct tccatcaaaa cgtgaaaaaa tgtcccccat120cgaaattggc catgtgctta ataaagtatt accaagcctt gagcacacac ctaaaaatgt180atctttactt tctaataaga aaagcaaaat aaaaaaaggg aattcagcca aaaataaatc240tcataagcac gctaaaacga acacaataca aacgacttcg agcatctggg ataacttatc300tctcgatttg atgctcgcga atatcgagcg aaatttttgg ggatggtctg atcctaatgc360aattcaaata ttagattatt gggctaacct cgacccaaac attcatttcg tctttgttta420tgataagcca gaaaatttat tccaatatca tagcttagaa gaggctctca aattagataa480acacaccgta caagaaaaat ttgaagagtg gcaaacctac aatgaaaaaa tcctaactta540ctttaataaa tataaagatc gtagtgtatt actgaataca caacaactcc aaaatactaa600
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<223>插入氨基酸<400>9Pro Arg Gly Pro Gly Ala Pro Gly1 权利要求
1.一种分离的A血清型多杀巴斯德氏细菌(P.multocide)，其包含hyaE基因的全部缺失或部分缺失，其中所述缺失减弱了该细菌的毒性。
2.权利要求1所述的细菌，其不含抗生素抗性基因。
3.权利要求1所述的细菌，其不含外源DNA。
4.权利要求1所述的细菌，其是A3血清型。
5.权利要求1所述的细菌，其是A1血清型。
6.权利要求1所述的细菌，其是A4血清型。
7.权利要求1所述的细菌，其中hyaE蛋白的239-359位氨基酸被缺失。
8.权利要求1所述的细菌，其包含SEQ ID NO7所示的核苷酸序列。
9.权利要求1所述的细菌，其包含SEQ ID NO8所示的核苷酸序列。
10.权利要求1所述的细菌，其是活的。
11.权利要求1所述的细菌，其是冻干的。
12.权利要求1所述的细菌，其是死亡的。
13.一种用于诱导针对野生型多杀巴斯德氏菌的保护性免疫力的疫苗，包含权利要求1所述的细菌；和药学上可接受的载体。
14.权利要求13所述的疫苗，其中所述细菌不含抗生素抗性基因。
15.权利要求13所述的疫苗，其中所述细菌不含外源DNA。
16.权利要求13所述的疫苗，其中所述细菌是A3血清型。
17.权利要求13所述的疫苗，其中所述细菌是A1血清型。
18.权利要求13所述的疫苗，其中所述细菌是A4血清型。
19.权利要求13的疫苗，其中hyaE蛋白的239-359位氨基酸被缺失。
20.权利要求13的疫苗，其中所述细菌包含SEQ ID NO7所示的核苷酸序列。
21.权利要求13所述的疫苗，其中所述细菌包含SEQ ID NO8所示的核苷酸序列。
22.权利要求13所述的疫苗，其中所述细菌是活的。
23.权利要求13所述的疫苗，其中所述细菌是冻干的。
24.权利要求13所述的疫苗，其中所述细菌是死亡的。
25.权利要求13所述的疫苗，其包装中带有将所述疫苗施用给有蹄动物，以提供针对野生型多杀巴斯德氏菌的保护性免疫力的施用说明书。
26.权利要求13所述的疫苗，其包装中带有将所述疫苗施用给鸟类，以提供针对野生型多杀巴斯德氏菌的保护性免疫力的施用说明书。
27.一种适用于有蹄动物、包含权利要求1所述细菌的饲料。
28.权利要求27所述的饲料，其中所述细菌不含抗生素抗性基因。
29.权利要求27所述的饲料，其中所述细菌不含外源DNA。
30.权利要求27所述的饲料，其中所述细菌是A3血清型。
31.权利要求27所述的饲料，其中所述细菌是A1血清型。
32.权利要求27所述的饲料，其中所述细菌是A4血清型。
33.权利要求27所述的饲料，其中hyaE蛋白的239-359位氨基酸被缺失。
34.权利要求27所述的饲料，其中所述细菌包含SEQ ID NO7所示的核苷酸序列。
35.权利要求27所述的饲料，其中所述细菌包含SEQ ID NO8所示的核苷酸序列。
36.权利要求27所述的饲料，其中所述细菌是活的。
37.权利要求27所述的饲料，其中所述细菌是冻干的。
38.权利要求27所述的饲料，其中所述细菌是死亡的。
39.权利要求27所述的饲料，其包装中带有将所述饲料施用给有蹄动物，以提供针对野生型多杀巴斯德氏菌的保护性免疫力的施用说明书。
40.一种适用于鸟类、包含权利要求1所述细菌的饲料。
41.权利要求40所述的饲料，其中所述细菌不含抗生素抗性基因。
42.权利要求40所述的饲料，其中所述细菌不含外源DNA。
43.权利要求40所述的饲料，其中所述细菌是A3血清型。
44.权利要求40所述的饲料，其中所述细菌是A1血清型。
45.权利要求40所述的饲料，其中所述细菌是A4血清型。
46.权利要求40所述的饲料，其中hyaE蛋白的239-359位氨基酸被缺失。
47.权利要求40所述的饲料，其中所述细菌包含SEQ ID NO7所示的核苷酸序列。
48.权利要求40所述的饲料，其中所述细菌包含SEQ ID NO8所示的核苷酸序列。
49.权利要求40所述的饲料，其中所述细菌是活的。
50.权利要求40所述的饲料，其中所述细菌是冻干的。
51.权利要求40所述的饲料，其中所述细菌是死亡的。
52.权利要求40所述的饲料，其包装中带有将所述饲料施用给鸟类，以提供针对野生型多杀巴斯德氏菌的保护性免疫力的施用说明书。
53.一种诱导针对野生型多杀巴斯德氏菌的保护性免疫力的方法，该方法包括如下步骤将权利要求1所述的细菌施用给有蹄动物或鸟类，由此由所述细菌为所述有蹄动物或鸟类提供针对野生型多杀巴斯德氏菌的保护性免疫力。
54.权利要求53所述的方法，其中所述细菌不含抗生素抗性基因。
55.权利要求53所述的方法，其中所述细菌不含外源DNA。
56.权利要求53所述的方法，其中所述细菌是A3血清型。
57.权利要求53所述的方法，其中所述细菌是A1血清型。
58.权利要求53所述的方法，其中所述细菌是A4血清型。
59.权利要求53所述的方法，其中hyaE蛋白的239-359位氨基酸被缺失。
60.权利要求53所述的方法，其中所述细菌包含SEQ ID NO7所示的核苷酸序列。
61.权利要求53所述的方法，其中所述细菌包含SEQ ID NO8所示的核苷酸序列。
62.权利要求53所述的方法，其中所述细菌是活的。
63.权利要求53所述的方法，其中所述细菌是冻干的。
64.权利要求53所述的方法，其中所述细菌是死亡的。
65.权利要求53所述的方法，其中将所述细菌施用给有蹄动物。
66.权利要求65所述的方法，其中所述有蹄动物是牛科动物。
67.权利要求53所述的方法，其中将所述细菌施用给鸟类。
68.权利要求53所述的方法，其中将所述细菌施用给鸟类，并且所述鸟类是家禽。
69.权利要求53所述的方法，其中将所述细菌施用给鸟类，并且所述鸟类选自如下的家禽鸡、火鸡、鸵鸟、斗鸡、乳鸽、珍珠鸡、稚鸡、鹌鹑、鸭子、鹅和鸸鹋。
70.权利要求53所述的方法，其中将所述细菌施用给鸟类，并且所述鸟类是鸡。
71.权利要求53所述的方法，其中将所述细菌施用给鸟类，并且所述鸟类是火鸡。
72.权利要求53所述的方法，其中经皮下给予所述细菌。
73.权利要求53所述的方法，其中经肌内给予所述细菌。
74.权利要求53所述的方法，其中经口服给予所述细菌。
75.权利要求53所述的方法，其中通过包裹到饲料表面而给予所述细菌。
76.权利要求53所述的方法，其中经鼻内给予所述细菌。
77.权利要求53所述的方法，其中所述细菌的施用剂量在大约104和大约109cfu之间。
78.权利要求53所述的方法，其中所述剂量在大约104和大约106cfu之间。
全文摘要
一种无荚膜的多杀巴斯德氏菌hyaE缺失型突变株，可以将其施用给哺乳动物，尤其是有蹄动物，或者鸟类，以提供对野生型多杀巴斯德氏菌(P.multocida)的保护性免疫，例如预防或降低哺乳动物尤其是家畜、有蹄动物和宠物出血性败血症或肺炎的严重程度，或者预防或降低鸟类尤其是家禽患有禽霍乱的严重程度。
文档编号C12N1/20GK1798574SQ200480015249
公开日2006年7月5日 申请日期2004年7月2日 优先权日2003年7月2日
发明者R·E·布里戈斯, F·M·塔图姆 申请人:生物技术研究与发展公司, (由农业部代表的)美利坚合众国