专利名称：一种反向杂交偶联延伸dna测序方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA测序方法，尤其是特别涉及一种DNA的杂交测序方法。
技术背景随着基因组研究的深入，从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以 及药物与生命体的相互作用将成为可能。虽然导致疾病发生的因素众多，但基因突变(单 核苷酸多态性、甲基化等)被广泛认为是一个重要的内在因素。在基础研究方面，基因突 变位点有助于基因组的精确定位，研究疾病基因的遗传规律，克隆致病基因；在应用方面， 直接寻找疾病的易感基因突变位点具有重要的价值。大多数复杂疾病，如癌症、糖尿病、 心血管疾病、抑郁症、哮喘等，受众多基因以及环境因子共同作用，通过对于大量某一特 定疾病的基因组样本中突变基因型进行大规模鉴定和检测，可以获得与该疾病相关基因型 的信息。更为重要的是，通过筛查药物敏感的基因突变位点，为今后实现个体化用药提供 依据。通过发现疾病易感性的基因突变位点，可以使人们及早地预防疾病，达到避免疾病 的发生的目的。因此，人类基因组草图刚刚绘制完成后，寻找人类基因组中基因突变位点立即成为人 类基因组计划的主要任务之一。目前有许多关于突变和单核苷酸多态性检测的方法，如DNA 测序、限制性酶切长度多态性、单链构象多态性、焦磷酸测序和等位基因特异的寡聚核苷 酸杂交等。这些技术虽在某种程度上能完成对突变或核苷酸多态性的检测，但均不能同时 对目标片段进行全方位的序列确定。能够全方位进行序列检测的方法，即全基因组序列测 定方法。然而全基因组序列测定费用太高，对第一个人类基因组序列测定的费用大约为10 亿美元，目前这一费用已经降低到大约2千万美元。因此，功能基因组的研究进展仍然受 限于DNA测序技术，大幅度降低DNA测序的成本将会大大推动生命科学和医学的研究，甚 至会带来革命性的变化。除了对现有的基于电泳的DNA测序技术进行改进外，当前正在发展的新型测序技术主 要集中在非电泳的手段上。从总体上来看，这类技术可以分成四大类第一类是合成测序， 在碱基加入到延伸的DNA链的过程中进行检测；第二类是杂交测序法，通过制备一组高密 度寡核苷酸微阵列芯片的杂交信号，进行目标基因的序列鉴定；第三类为分子影像技术， 一系列可以在单分子的水平上进行测序的技术；最后一类技术是诱导DNA分子蜿蜒通过非
常细微的小孔，在这个过程当中借助于电子学或者光学的方法对碱基进行读出，也称作纳 米孔测序。传统的杂交测序方法，是把一系列长度为K个碱基共4k条序列固定在芯片上，然后把 标记的待测DNA模板去杂交，通过检测杂交信号来确定该序列的杂交序列谱。如果要测定 长DNA序列，那么需要合成的探针需要量很大，成本倍数增加。更重要的是该方法有假阳 性高的缺点。发明内容技术问题本发明的目的是提供一种反向杂交偶联延伸DNA测序方法，能克服传统的 杂交测序方法假阳性高的缺陷，并解决现有方法探针合成量大、成本高昂的问题，实现高 通量，低成本，高灵敏度和快速测定短片段DNA序列。技术方案本发明采用一种反向杂交偶联延伸DNA测序方法，确定未知DNA模板的碱 基信息是通过DNA模板与多条探针平行杂交并延伸标记的碱基，通过检测是否有标记物延 伸，根据碱基互补原理确定未知DNA模板是否有对应的四个(或以上)连续碱基的信息。即 通过对DNA模板重复"杂交-延伸-检测"步骤来实现，即在传统杂交测序法中加入延伸一 步，能够解决假阳性及成本高的问题。本发明采用如下技术方案一种反向杂交偶联延伸DNA测序方法，其特征在于DNA序列确定是通过3'末端为已知 碱基的杂交引物平行地与待测DNA序列经过多次杂交、延伸、检测来实现，包括如下步骤步骤1) 3，末端为三个或三个以上己知碱基的杂交引物与固定的未知DNA模板在杂交液 中加热，然后冷却退火进行杂交；步骤2)用洗液洗净杂交液后，标记单体在聚合酶的催化下，在杂交引物的3'末端延伸 一个或多个碱基；通过芯片扫描仪读取延伸碱基的信息，确定未知DNA模板上的包含数个 碱基的序列；步骤3)用变性液将延伸碱基的杂交引物从未知DNA模板中洗脱，再将3'末端已知碱基 序列不同的杂交引物按步骤l)与未知DNA模板杂交并进行步骤2)，确定未知DNA模板上 的包含数个碱基的不同序列；用不同的杂交引物重复上述过程，直到完成DNA序列测定。所述的杂交引物是指能和且只能和所有DNA模板中的一段通用特定序列杂交的寡核酸 片段。在DNA模板制备过程中，通过连接或者在扩增过程中引入与特定的杂交引物互补的 一段通用序列，其中引入的该段通用序列应与模板中任何一段序列片段有区别，即模板中
只有该段通用序列能够与该特定的杂交引物实现杂交。本发明中的杂交引物，其3'末端的3个或3个以上碱基为已知碱基，优选3个至5个 碱基为已知碱基，最优选3'末端为3个已知碱基；5'端带有7个或7个以上碱基，优选7 至13个。在最优选的情况下，即3'末端为三个已知碱基，杂交引物序列特征可以5， (N)nXYZ 3'表示，其中为N为四种碱基T， A， G， C中不限定的任意一种，或者可用通用碱基I来代 替，n为7 13的整数；X， Y， Z均是选自T， A， G， C中的确定的一种碱基。如此，序列 XYZ有43=64种不同组合，即本发明所述的方法，最少可以在合成64种不同杂交引物的条 件下实现；且杂交引物的长度可以只包含10 16个碱基。所述的未知DNA模板，是指通过常规的PCR，滚环扩增、固相扩增以及桥式扩增等增加 基因组中感兴趣的目的序列量的方法扩增后的待测DNA序列或其序列片断。扩增可以是单 重的，即一次扩增一个目的片断，也可以是多重的，即一次扩增多个目的片断。未知DNA 模板通过化学或者物理方法可以固定在平面基片上，也可以固定在"96、 384孔板"或者各 种修饰的珠子等载体上，还可以同时固定多个DNA模板，也包括固定单个DNA模板。步骤l)为杂交步骤，可按现有技术的方法，把杂交引物溶解于在高温条件下(60T左 右)短时间加热，然后低温(4°C左右)退火完成杂交过程。歩骤2)为延伸步骤，当杂交引物与固定的未知DNA模板杂交后，通过在杂交引物上延 伸一个或多个标记单体(共A，G，C,T四种)，并通过芯片扫描仪检测延伸的碱基，可以确定 不同位置的待测点上未知DNA模板在该次延伸中的碱基信息。此时未知的DNA模板中某一 待测点(固定在基片上的单克隆模板DNA)上一小段DNA序列中包含数个碱基的序列已经确 定，即与标记单体所含的一个或多个碱基与杂交引物3'末端的3个或3个以上己知碱基组 成的序列形成碱基互补的DNA序列。标记单体的延伸采用已知的通用方法，即在缓冲液中，加入四种不同的标记单体，如 dATP(ddATP)、 dCTP(ddCTP)、 dGTP(ddGTP)和dUTP(ddUTP)，在聚合酶的作用下，在4 10°C 条件下延伸5 15分钟，使杂交引物的3'末端延伸带标记的碱基。所述的标记单体，是指碱基单体(A,G,C，T)上包含可以直接或者间接检测的基团或者 粒子，而且3'为双脱氧或被可切割基团所封闭。可检测的基团或者粒子，即标记物，如修 饰荧光基团，生物素和量子点，或者不修饰的单体在反应中产生的光信号。所述的标记单 体可以是单色的，即四种单体均标记相同的标记物，也可以是多色的，即四种单体标记不 相同或者不完全相同的标记物。如标记单体可以是四种不同荧光标记的dATP(ddATP)、 dCTP(ddCTP)、 dGTP(ddGTP)和dUTP(ddUTP)。 所述的标记单体的延伸是标记的四种单体(A，G,C，T)的延伸。如果标记单体是单色的， 则对于任一杂交引物，相同标记的不同的四种单体(A，G,C,T)应分别延伸并读取碱基延伸 信息，不同的单体读取后应将其标记物去除后，再延伸另一种标记单体，其目的是芯片扫 描仪能读出不同碱基的信息。容易理解，如果四种单体标记不相同，则四种单体可以同时 延伸并读取延伸碱基的信息。单体的延伸可以一步延伸即延伸一个碱基，或多步延伸即延伸多个碱基。在多个碱基延伸中，每次延伸一个碱基，通过检测确定哪些未知DNA模板上的待测点发生了该次碱基 的延伸信息；然后采用标记物去除方法，如将荧光切除的方法，再进行下一个碱基的延伸， 或者釆用标记物叠加，如荧光叠加的方式确定那些未知DNA模板上的待测点发生了碱基的 多次延伸。完成某一待测点上DNA序列中的数个碱基序列的测定后，可以将延伸碱基的杂交引物 从未知DNA模板中用变性液洗脱。所述的变性液中含有尿素、NaOH、乙二醇、丙三醇和甲 酰胺等能降低DNA变性温度的组分。延伸标记单体的杂交引物从DNA模板中分离后，可重复步骤l)至步骤2)的方法，将 3'末端已知碱基序列不同的另一杂交引物与未知DNA模板杂交，延伸单体，并读出待测点上 未知DNA序列的碱基序列信息。以不同的杂交引物，循环上述"杂交-延伸-检测"过程， 直到测出未知DNA模板的序列谱，或4"种(K为杂交引物末端已知碱基的数目)杂交引物 都经过上述步骤，完成DNA序列测定。有益效果本发明与现有技术相比，具有如下优点1. 本发明的最大优点是正确性可靠。在传统的杂交测序方法中，如果末端有一个或多 个碱基错配，也有可能读出信号，但是读出的信号是错误的。而本发明的方法，只读3'末 端的最后几个碱基，而且加上延伸一步(聚合酶对3'末端错配碱基非常敏感)大大增加了 正确性。2. 本发明的测序方法成本低，最少只需要合成64条杂交引物(每条长度10-15个碱 基左右)、普通的聚合酶、荧光标记的dNTP及芯片扫描仪，就可以进行大规模DNA序列测 定。3. 本发明可实现高通量DNA测序。通过polony或乳液PCR等方法制得的高密度DNA 芯片，利用反向杂交偶联延伸DNA测序方法，很容易读出这些芯片上的序列。本发明所提出的方法，由于加入延伸一步，可解决假阳性及成本高的问题。而且应用 在芯片上进行杂交延伸测序，可达到高通量水平。此外本发明不需通过破坏或者切割标记
物的方法清除杂交引物，可建立快速、准确、便宜的基因组序列测定方法。 以下将结合具体实施方式
对本发明作进一步详细描述。
图1是本发明反向杂交偶联延伸DNA测序方法的示意图其中1为未知DNA模板；2为杂交引物；3为荧光基团；4为基片；i、 j、 k、 1、 m分别为芯片上的待测点。图2为DNA序列拼接示意图其中4为基片；1为固定在基片上的未知DNA模板，2为杂交引物；3为延伸的带标记的碱基；e为经过拼接得到的序列。
具体实施方式
实施例一将某一待测DNA序列通过常规的PCR扩增，并固定在丙烯酰胺基片上，制成未知DNA 模板。制备64条杂交引物，3'末端为三个已知碱基，5'端带有8个碱基，杂交引物序列特 征可以5' NNNNNNNNXYZ 3'表示，其中为N为四种碱基T， A， G， C中不限定的任意一种， 或者可用通用碱基I来代替，X， Y， Z均是选自T， A，G，C中的确定的一种碱基，如NNNN丽NNACG、 NN丽丽NNGAG等，杂交引物中XYZ组成64种不同序列。1) 杂交将杂交引物刚NNNNNNACG与固定的未知DNA模板杂交。把杂交引物以100uM 浓度溶解于1倍的杂交液中，取适量(把待测模板完全浸没)所配的杂交引物置于待测模 板中，60°C变性2分钟，然后4°C复性3分钟，用1倍4°C储藏的聚合酶缓冲液(10 mM Tris-HC1(pH 7.5) ， 5 mM MgC12 ， 7. 5 mM DTT)冲洗30秒，完成杂交过程。2) 延伸在lXEcoPol缓冲液(lOmMTris-HCl (pH7.5) ， 5 mM MgC12 ， 7. 5mMDTT) 中，加入不同荧光标记的四种标记单体dATP (ddATP) 、 dCTP (ddCTP) 、 dGTP (ddGTP)和 dUTP(ddUTP)，在聚合酶(Klenow片段(3'—>5'exo-))的作用下，在4°C条件下发生延伸 反应10分钟，使杂交引物的3'末端延伸一个标记的碱基。3) 检测通过芯片扫描仪读取延伸碱基的信息，确定未知DNA序列某一待测点上包含 4个碱基的序列信息。即可以知道该序列是否含有与杂交引物上已知的三个碱基GCA及延伸 的一个碱基形成碱基互补的、共四个碱基的序列。
如图1，未知DNA模板1固定到固相载体丙烯酰胺基片4上，杂交引物NNNNNNNNACG 2 与DNA模板1杂交反应，加入标记单体后杂交引物2发生标记单体延伸反应，通过检测可 以知道本次延伸中，不同位置的待测点i、 j、 k、 l和m中，i、 j、 l和m处未知DNA模板分 别含有与序列ACGT、 ACGC、 ACGG和ACGA碱基互补的包含4个碱基的序列。4)杂交引物NNNNNNNNACG检测完后，再把其余的杂交引物依次重复1) 3)步，最多 检测其余的63条杂交引物，直至得到每一个待测点上的序列谱，通过对这些序列谱进行数 据整理、拼接，就可以读出这些序列。DNA序列拼接如图2所示，基片4上固定有DNA模板1，杂交引物2杂交后延伸带标 记的一个碱基3，图中一段序列共有19条杂交引物，经过拼接可得到序列e，则待测DNA 序列中有一与序列e碱基互补的DNA序列。实施例二反向杂交偶联延伸DNA测序方法对单个人类全基因组测序 DNA模板可按下述步骤制备1. 提取人类基因组。2. DNA片段化。用超声波处理，使DNA的平均大小在50bp左右。3. 加接头引物a。先把片段化后的基因组DNA用聚合酶补平，并使其3末端带一 个突出的A处理。然后在连接酶的作用下，把带有Mme I内切酶识别位点的接头引物连接 到小片段的DNA上。4. 酶切处理。在Mme I内切酶的作用下，把全基因组切成待测片段大小了 1%P的 基因组文库。5. 同步骤3，把另一端也加上接头引物b。6. 微乳液PCR扩增出单克隆的基因组文库。7. 全基因组芯片制作。把上一步的扩增产物，固定在丙烯酰胺基片上。 将所制备的固定的DNA模板利用本发明的方法进行杂交-延伸测序，测序方法同实施例一。将杂交序列组装、拼接后，得到全基因组信息。实施例三反向杂交偶联延伸DNA测序方法进行RNA表达谱分析
DNA模板可按下述步骤制备1. 分别提取正常细胞及病变细胞mRNA,用磁珠固定有30个T的核苷酸链纯化mRNA 使磁珠吸有mRNA。2. 反转录为cDNA，并用RNaseH、 DNA聚合酶等作用下合成第二链。3. 用识别四个碱基的内切酶(Sau 3AI)消化步骤2的产物。用binding buffer 洗干净磁珠。4. 在连接酶的作用下加上接头引物A (引物上带有内切酶Acu I识别位点)。5. 用Acu I消化步骤4的产物。得到接头引物A后面跟着要测的16个未知序列的 c賺文库。6. 加上另一接头引物B。然后用乳液PCR进行扩增。7. 扩增产物固定在芯片上。将所制备的固定的DNA模板利用本发明的方法进行杂交-延伸测序，测序方法同 实施例一。数据分析后拼接得到所要测定的DNA测序。实施例四反向杂交偶联延伸DNA测序方法检测包含人基因组中 SNP位点编号为rs 11053646 —段DNA片断设计一对PCR弓l物，其中一条引物修饰了丙烯酰胺基团。用PCR引物扩增人样本(如 血、唾液等)中包含SNP位点编号为rs 11053646 —段DNA序列片断。用聚合方法将PCR 产物固定在玻璃片上，采用变性、电泳方法将未固定的另一条PCR链和其他杂质清除，得 到一条纯净的DNA链。采用实施例一所描述的方法，把杂交引物跟上述芯片进行杂交，在延伸反应条件下， 插入带有荧光标记的A、 G、 C、 T，数据读取后，冲洗已经杂交上的引物，并对其他的杂交 引物重复进行杂交、延伸和检测，直到所有杂交引物完成杂交-延伸过程，对不同样品所对 应的序列进行序列谱分析，就可知编号为rs 11053646的SNP位点的碱基情况。
权利要求
1、一种反向杂交偶联延伸DNA测序方法，其特征在于DNA序列确定是通过3’末端为已知碱基的杂交引物平行地与待测DNA序列经过多次杂交、延伸、检测来实现，包括如下步骤步骤1)3’末端为三个或三个以上已知碱基的杂交引物与固定的未知DNA模板在杂交液中加热，然后冷却退火进行杂交；步骤2)用洗液洗净杂交液后，标记单体在聚合酶的催化下，在杂交引物的3’末端延伸一个或多个碱基；通过芯片扫描仪读取延伸碱基的信息，确定未知DNA模板上的包含数个碱基的序列；步骤3)用变性液将延伸碱基的杂交引物从未知DNA模板中洗脱，再将3’末端已知碱基序列不同的杂交引物按步骤1)与未知DNA模板杂交并进行步骤2)，确定未知DNA模板上的包含数个碱基的不同序列；用不同的杂交引物重复上述过程，直到完成DNA序列测定。
2、 根据权利要求I所述的DNA测序方法，其特征在于所述的杂交引物5'端带有7个或7个 以上碱基。
3、 根据权利要求2所述的DNA测序方法，其特征在于所述的杂交引物3'末端为3个已知碱 基，5'端带有7 13个碱基，杂交引物序列特征为5' (N)nXYZ3'，其中为N为四种碱基T， A， G， C中不限定的任意一种，或者是通用碱基I， X， Y， Z为选自T， A， G， C中的任一确 定的碱基，n为7 13的整数。
4、 根据权利要求1所述的DNA测序方法，其特征在于所述的未知DNA模板，是通过常规的 PCR、滚环扩增、固相扩增或桥式扩增方法，增加基因组中目的序列量后的待测DNA序列或 序列片断。
5、 根据权利要求1所述的DNA测序方法，其特征在于步骤l)中，所述的未知DNA模板通 过化学或者物理方法固定在平面基片上，或"96、 384孔板"上，或者各种修饰的珠子载 体上；固定单个DNA模板，或者固定多个DNA模板。
6、 根据权利要求1所述的DNA测序方法，其特征在于所述的标记单体，是指碱基单体(A， G， C 或T)上包含可以直接或者间接检测的基团或者粒子，而且3'为双脱氧或被可切割基团所封 闭。
7、 根据权利要求6所述的DNA测序方法，其特征在于所述的可检测的基团或者粒子，为修 饰荧光基团、生物素或量子点，或者不修饰的单体在反应中产生的光信号。
8、 根据权利要求6所述的DNA测序方法，其特征在于所述的标记单体是四种不同荧光标记 的dATP(ddATP)、 dCTP(ddCTP)、 dGTP(ddGTP)和dUTP(ddUTP)。
9、 根据权利要求1所述的DNA测序方法，其特征在于所述的变性液中含有能降低DNA变性温度的尿素、NaOH、乙二醇、丙三醇或甲酰胺组分。
10、根据权利要求1所述的DNA测序方法，其特征在于根据杂交引物已知碱基和所延伸的 碱基，通过碱基互补原理确定未知DNA模板的DNA序列。
全文摘要
本发明公开了一种反向杂交偶联延伸DNA测序方法，将未知DNA模板与多条3’末端为3个或3个以上已知碱基的探针平行杂交并延伸标记的碱基，通过检测是否有标记物延伸，根据碱基互补原理确定未知DNA模板是否有对应的四个(或以上)连续碱基的信息，拼接出待测DNA序列信息；包括重复进行的杂交、延伸和检测步骤。本发明方法在传统杂交测序法中加入延伸一步，能够解决假阳性及成本高的问题，实现高通量，低成本，高灵敏度和快速测定短片段DNA序列。
文档编号C12Q1/68GK101130823SQ20071013153
公开日2008年2月27日 申请日期2007年9月4日 优先权日2007年9月4日
发明者李燕强, 潘志强, 肖鹏峰, 陆祖宏 申请人:东南大学