专利名称：米根霉菌球体单罐半连续高强度发酵高光学纯度l-乳酸新工艺方法
技术领域：
本发明涉及霉菌发酵L-乳酸的新工艺，更具体地说是利用米根霉细胞在搅拌培养体 系中具有聚集、凝絮形成菌丝球的倾向形成菌球体，进而通过菌球体反复发酵，从而实 现米根霉菌球体单罐半连续高强度发酵高光学纯度L-乳酸的新工艺，属于微生物与发酵 工程领域。
背景技术：
乳酸是世界上公认的三大有机酸之一，它的用途极为广泛。乳酸、乳酸盐及其衍生 物广泛应用于食品、医药、饲料、化工等领域。人体中只含有L-乳酸脱氢酶，只能代 谢L-乳酸。L-乳酸在食品工业中的使用是绝对安全的，因此世界卫生组织提倡在食品及 医药行业使用L-乳酸取代目前广泛使用的DL-乳酸。L-乳酸的聚合物——聚L-乳酸(PLA) 是无毒高分子化合物，具有生物相容性，聚L-乳酸是良好的绿色材料，对消除"白色污 染"具有极其重要的意义。在众多的产乳酸微生物中，米根霉(朋hopus 0JT幼e/AS 3.819)由于具有产物光 学纯度高、营养消耗简单、产物易于分离等特点而成为生产高光学纯度L-乳酸的理想菌 株，但是由于发酵工艺控制方面技术不成熟，工业生产受阻。菌球体连续发酵与传统分批游离发酵相比，利用菌球体自固定技术具有细胞负荷 高、生物催化高效、细胞可反复使用等优点，并可得到高的目标产量和原料转化率，易 于实现细胞与产物分离，有利于实现工艺过程的自动化、连续化，降低生产成本，具体 表现在(l)生物反应器中可以获得极高的菌体浓度，因而发酵速率可以大大提高，反 应器设备的生产强度得以强化；(2)产物分离纯化过程中菌体从发酵液中的分离十分容 易；(3)菌球体细胞可以重复或长期使用，这样既能够简化游离细胞过程需要不断培养 菌体的操作，又减少了营养物质的浪费，提高了生产率。在连续或半连续发酵工艺中，产物和菌体的分离常常是发酵成败的关键和难点，通 过控制菌球粒径大小，减轻菌液分离负担，有利于成功实现连续或半连续发酵。米根霉 深层发酵生产L-乳酸过程中，菌体形态复杂，多以丝状、片状、球体、团状、絮状、结 块等形态生长。米根霉菌体形态强烈的影响着发酵过程中传质、溶氧等性能，对其有效 的控制是发酵成功的关键因素之一。因此在控制菌球形态基础上成功实现半连续高强度 发酵对L-乳酸产业意义重大。 发明内容本发明旨在提供一种运行成本低、发酵强度高、适于工业化生产的米根霉菌球体单 罐半连续高强度发酵高光学纯度L-乳酸新工艺方法。实现上述目的具体工艺步骤如下米根霉菌球体单罐半连续高强度发酵高光学纯度L-乳酸新工艺方法包括如下工艺 步骤A、 制备高密度高活性米根霉孢子乳悬液将米根霉孢子接种于10 L机械搅拌发酵罐的液体培养基中，温度为32°C，通气流 量2.0L/ (L.min)，搅拌线速度2.4m/s,培养24小时，得到形态规则、颗粒均匀的 高密度高活性米根霉菌球体细胞；其液体培养基由下列重量配比的物质组成葡萄糖120 g/L，硫酸铵4 g/L，磷酸 二氢钾0. 3 g/L，磷酸二氢钠0. 3 g/L ，硫酸锌0. 44 g/U硫酸镁0. 25 g/L，硫酸亚 铁O.Ol g/L;液体培养基体积为7.5 L;B、 米根霉菌球体细胞的扩培将10L高密度高活性米根霉菌球体细胞无菌转接至500 L机械搅拌罐的液体培养基 中，温度为32°C，增大通气流量至3. 0 L/ (L min)，增大搅拌线速度至3. 6 m/s， 24 小时实现菌球体细胞的更新与扩培，菌球体密度超过104个/L，制得500L罐的米根霉菌 球体细胞；其液体培养基同A步骤中的液体培养基；C、 500L罐单罐首批发酵将上述制得的500L罐米根霉菌球体细胞，在温度为32°C、控制通气2. 0 L/(L *min) 条件下，培养24小时至44小时，通过流加中和剂氢氧化钙控制发酵液pH为5.5，发酵 结束后正压放料375 L，截流米根霉菌球体，首批罐发酵得产物L-乳酸，浓度112g/L;D、 500L罐单罐重复发酵向含有截流米根霉菌球体的500 L罐体内正压补入新培养基375 L，在0小时至4
小时内，通气和线速度分别为3.0 L/ (L*min)和3.6 m/s，在其后的20小时内，通 气和线速度分别为2.0 L/ (L'min)和2. 4 m/s，发酵结束后无菌正压放料375 L，截 流米根霉菌球体，得发酵产物L-乳酸，浓度113g/L;新培养基由下列重量配比的物质组成葡萄糖120g/L，硫酸铵0.5g/L，磷酸二氢 钾0. 05g/L，磷酸二氢钠0. 05 g/L ，硫酸锌0. 04 g/L，硫酸镁0. Q2 g/L，硫酸亚铁 0. 01 g/L，新培养基体积为375 L;E、 500L罐单罐连续进行15批次的半连续高强度发酵连续进行15批次的与D步骤相同单罐半连续发酵，每次重复发酵的装液系数为 0.75，每次无菌正压放料排出发酵液375L，再向罐内正压补入新培养基375 L; 15批次 的重复发酵过程中，培养基和培养条件均同步骤D;发酵结束后得发酵产物L-乳酸，其 浓度为113g/L;每批次产酸稳定在110g/L以上，发酵强度稳定在4. 50 g/ (h L)以上，细胞活力 保持在90%以上，得到光学纯度在99. 5%以上的L-乳酸。本发明发酵工艺与常规米根霉间歇式分批发酵工艺相比，有益技术效果体现在以下 几个方面(1) 、本发酵工艺方法中悬浮培养体系所形成菌球体的形状规则、大小较均一，菌 球体的平均粒径控制在0. 5mm至3. Omm的范围内；细胞集聚成菌球体的条件温和、可控。(2) 、米根霉无载体固定化细胞培养可以在生物反应器中逐级扩大培养，^产生细 胞固定化过程的附加成本。(3) 、能够成功实现反复发酵，节约菌体消耗的N源，降低发酵成本。(4) 、在反复发酵过程中，在24小时内产物乳酸浓度超过110g/L，发酵周期短， 发酵强度大，适于工业生产。(5) 、所形成的产物卜乳酸光学纯度均在99.5%以上，满足食品医药要求，完全适 于制备高质量聚L-乳酸。
图1为米根霉半连续发酵菌球体细胞。通过图中可以看出菌球体呈现形状规则、大 小均一的特征。图2为米根霉菌球体从第11批次到第15批次的半连续重复发酵产L-乳酸情况。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地说明。 实施例米根霉菌球体单罐半连续高强度发酵高光学纯度L-乳酸新工艺方法包括如下工艺 步骤(1) 米根霉孢子的准备将米根霉菌株(^ ko; "s or/幼e /AS 3.819)划线接种于马铃薯葡萄糖(PDA)平 板，第一天设置培养温度为32'C，相对培养湿度70%，利于菌丝生长，第二天设置培养 温度为34'C，相对培养湿度为30%，利于孢子生成，待黑色浓密孢子完全覆盖白色菌丝 后即可准备收集，制得成熟米根霉孢子。(2) 制备高密度高活性米根霉孢子乳悬液 将米根霉孢子刮洗至无菌水中，之后接种于带有直板式搅拌桨的10L发酵罐中，温度为32'C，罐内培养基采用葡萄糖120g/L，硫酸铵((NH4)2S04) 4.g/L，磷酸二氢钾 (K,) 0. 3g/L，磷酸二氢钠(NaH2P04) 0. 3 g/L ，硫酸锌(ZnS04 7H20 ) 0 . 44 g/L， 硫酸镁(MgS(WH20 ) 0 . 25 g/L，硫酸亚铁(FeS04) 0.01 g/L。利用血球计数板计数确 保接种后的发酵罐中的孢子乳悬液浓度超过1()6个/rnL。控制通气流量2. 0 L/ (L *min)， 搅拌线速度2.4m/s，培养24小时得到形态规则、颗粒均匀的米根霉菌球体。制得10L 罐的高密度高活性米根霉菌球体细胞，见图l。(3) 米根霉菌球体细胞的扩培 将10L罐内的培养基全部无菌转接至500 L机械搅拌罐，培养基同歩骤(2)，温度为32。C，增大通气流量至3.0L/ (L'min)，增大搅拌线速度至3. 6 m/s，约24小时实 现菌球体细胞的更新与扩培，菌球体密度超过104个/L。制得500L罐的米根霉菌球体细 胞。(4) 500L罐单罐首批发酵针对500L罐的米根霉菌球体细胞进行继续培养，培养24小时至44小时范围，控 制通气2. 0 L/ (L min)，通过流加中和剂氢氧化钙控制发酵液pH为5. 5，发酵结束后 通过罐体内置的旋转滤器无菌正压放料375L，截流米根霉菌球体。首批罐发酵得产物 L-乳酸112g/L。(5) 500L罐单罐重复发酵通过无菌补料管连接，将另一罐内375L无菌新培养基采用正压方式，向含有上述 截流米根霉菌球体的罐体进行无菌补料。温度为32i:，在0小时至4小时内，分别调节 通气和线速度为3. 0 L/ (L min)和3. 6 m/s，在其后的20小时内，分别调节通气和 线速度为2. 0 L/(L 'min)和2. 4 m/s，新培养基采用葡萄糖120 g/L，硫酸铵((NH4)2S04) 0.5 g/L，磷酸二氢钾(KH2P04) 0.05g/L，磷酸二氢钠(NaH2P04) 0.05 g/L ，硫酸锌 (ZnS04 7H20 ) 0, 04 g/L，硫酸镁(MgS04 7H20 ) 0 . 02 g/L，硫酸亚铁(FeSO》0. 01 g/L， 发酵结束后通过罐体内置旋浆过滤器无菌正压放料375L，截流米根霉菌球体。得发酵产 物L乳酸浓度113g/L。 '(6) 500L罐单罐连续进行15批次半连续高强度发酵连续进行15批次的单罐半连续重复发酵，S卩每批次发酵结束后，采用无菌正压 将375 L的液体发酵培养基排出，之后通过无菌补料管连接，将另一罐内新培养基采用 正压，向含有截流米根霉菌球体的罐体进行无菌补料375U在0小时至4小时内，分别调节通气和线速度为3. 0 L/ (L min)和3. 6 m/s，在 其后的20小时内，分别调节通气和线速度为2. 0 L/ (L'min)和2. 4 m/s，发酵结束 后通过罐体内置旋浆过滤器无菌正压放料，得发酵产物L乳酸。在15批次的重复发酵过程中，培养基和培养条件均同步骤(5)，装液系数为0.75， 每次排出发酵液约370L。对每次排出的370 L发酵培养基检测表明，L-乳酸的浓度稳定在110g/L以上，残 糖低于0.2%，发酵液中游离菌体及蛋白浓度低于0.2%，发酵强度稳定在4.50 g/(h*L) 以上，细胞活力保持在90%以上，完全实现了米根霉菌球体单罐半连续高强度发酵，所 得卜乳酸转化率90%以上，光学纯度在99.5%以上。从图2中可以看出在最后持续5个批次发酵过程中，米根霉菌球体仍能保持较高发 酵强度。
权利要求
1、米根霉菌球体单罐半连续高强度发酵高光学纯度L-乳酸新工艺方法，其特征在于包括如下工艺步骤A、制备高密度高活性米根霉孢子乳悬液将米根霉孢子接种于10L机械搅拌发酵罐的液体培养基中，温度为32℃，通气流量2.0L/(L·min)，搅拌线速度2.4m/s，培养24小时，得到形态规则、颗粒均匀的高密度高活性米根霉菌球体细胞；其液体培养基由下列重量配比的物质组成葡萄糖120g/L，硫酸铵4g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，磷酸二氢钠0.3g/L，硫酸锌0.44g/L，硫酸镁0.25g/L，硫酸亚铁0.01g/L；液体培养基体积为7.5L；B、米根霉菌球体细胞的扩培将10L高密度高活性米根霉菌球体细胞无菌转接至500L机械搅拌罐的液体培养基中，温度为32℃，增大通气流量至3.0L/(L·min)，增大搅拌线速度至3.6m/s，24小时实现菌球体细胞的更新与扩培，菌球体密度超过104个/L，制得500L罐的米根霉菌球体细胞；其液体培养基同A步骤中的液体培养基；C、500L罐单罐首批发酵将上述制得的500L罐米根霉菌球体细胞，在温度为32℃、控制通气2.0L/(L·min)条件下，培养24小时至44小时，通过流加中和剂氢氧化钙控制发酵液pH为5.5，发酵结束后正压放料375L，截流米根霉菌球体，首批罐发酵得产物L-乳酸，浓度112g/L；D、500L罐单罐重复发酵向含有截流米根霉菌球体的500L罐体内正压补入新培养基375L，在0小时至4小时内，通气和线速度分别为3.0L/(L·min)和3.6m/s，在其后的20小时内，通气和线速度分别为2.0L/(L·min)和2.4m/s，发酵结束后无菌正压放料375L，截流米根霉菌球体，得发酵产物L-乳酸，浓度113g/L；新培养基由下列重量配比的物质组成葡萄糖120g/L，硫酸铵0.5g/L，磷酸二氢钾0.05g/L，磷酸二氢钠0.05g/L，硫酸锌0.04g/L，硫酸镁0.02g/L，硫酸亚铁0.01g/L，新培养基体积为375L；E、500L罐单罐连续进行15批次的半连续高强度发酵连续进行15批次的与D步骤相同单罐半连续发酵，每次重复发酵的装液系数为0.75，每次无菌正压放料排出发酵液375L，再向罐内正压补入新培养基375L；15批次的重复发酵过程中，培养基和培养条件均同步骤D；发酵结束后得发酵产物L-乳酸，其浓度为113g/L；每批次产酸稳定在110g/L以上，发酵强度稳定在4.50g/(h·L)以上，细胞活力保持在90％以上，得到光学纯度在99.5％以上的L-乳酸。
全文摘要
本发明公开了米根霉菌球体单罐半连续高强度发酵高光学纯度L-乳酸新工艺方法，涉及如下步骤(1)制备高密度高活性米根霉孢子乳悬液，(2)米根霉菌球体细胞无菌转接至500L机械搅拌罐的扩培，(3)500L罐单罐首批发酵，(4)500L罐单罐重复发酵，(5)500L罐单罐连续进行15批次半连续高强度发酵。本发酵工艺方法中悬浮培养体系所形成菌球体的形状规则、大小较均一；能够成功实现反复发酵，节约菌体消耗的N源及其它无机盐，降低发酵成本；其发酵周期短，发酵强度大，适于工业生产；所形成的产物L-乳酸光学纯度均在99.5％以上，满足食品医药要求，完全适于制备高质量聚L-乳酸。
文档编号C12P7/56GK101153297SQ20071013151
公开日2008年4月2日 申请日期2007年8月30日 优先权日2007年8月30日
发明者姜绍通, 羽 朱, 李兴江, 潘丽军, 罗水忠, 志 郑 申请人:合肥工业大学