专利名称：一种利用米根霉一步发酵法产l-苹果酸的方法
技术领域：
本发明属于发酵技术领域，具体涉及ー种利用米根霉ー步发酵法产L-苹果酸的方法。
背景技术：
苹果酸，又名羟基琥珀酸或羟基丁ニ酸，分子式为C4H6O5,分子量134. 09，结构式为hoocchohch2cooh。主要有三种苹果酸:z-型苹果酸，比较广泛的存在于自然界中，密度I. 595，熔点100°C，分解点140°C，比旋光度-2. 3° (8. 5克/100毫升水)，易溶于水、甲醇、丙酮等，不溶于苯；而ガ-型苹果酸和规-混合型苹果酸则主要为化学合成，前者密度
I.595，熔点lore，分解点140で，比旋光度+2.92° (甲醇)，溶于水、甲醇、こ醇、丙酮。等量的左旋体和右旋体混合得外消旋体，密度I. 601，熔点131-132°C，分解点150°C ;溶于水、甲醇、こ醇、丙酮等，不溶于苯。由于Z-苹果酸分子中含有羟基和羧基，因此对极性溶剂的溶解度大，化学性质较为活泼。在常温下它极易溶于こ醇及こ醚中，在水中其溶解度随水温的升高而增大，呈强酸性。其酸性随浓度的升高而增加，可进行两步解离(1=3.9\10_4，K2=7. 5X1(T6)。L-苹果酸是生物体代谢过程TCA循环中产生的ー种重要有机酸，作为优良的酸味剂和保鲜剂，在食品、医药、化工、日化和保健等领域具有广泛用途。由于Z-苹果酸ロ感接近天然苹果的酸味，且与柠檬酸相比具有酸度大、味道柔和、滞留时间长等特点，具有特殊的香味并且不损伤口腔和牙齿等特点，已被广泛用于高档饮料、食品等行业。有研究表明，
苹果酸有可能替代柠檬酸成为新一代食品添加。苹果酸与柠檬酸配合使用，可以模拟天然果实的酸味特征，使ロ感更自然、协调、丰满。清凉饮料、粉末饮料、乳酸饮料、乳饮料、果汁饮料中均可添加苹果酸改善其ロ感和风味，苹果酸常与人工合成的ニ肽甜味剂阿斯巴甜(ASPARTME)配合使用，作为软饮料的风味固定剂。也可用作天然果子露保色剂、蛋黄酱乳稳定剂、果酱调整剂、甜味辅助剂、酵母生长促进剂等。在欧美各国及日本的食品饮料生产中，苹果酸已成为不可缺少的基本原料之一。目前，美国年消耗在1500万磅以上，其中90%用于食品和饮料加工。另外，苹果酸可形成许多衍生物，日本近几年已成功地将苹果酸盐应用于减糖、减盐食品中，应用苹果酸某些盐类代替食盐浸溃咸菜时，其咸味仅有食盐1/5-1/7情况下，而浸溃效果却是食盐的两倍，同时可以做为肾炎患者的食盐代用品；在豆浆中添加苹果酸钙盐，可有效地改善其ロ感和风味；利用苹果酸的抗疲劳、护肝、肾、心脏作用可以开发保健饮料。食品中添加L-苹果酸可使pH得到调整，加上其本身所具有的抗菌作用，Z-苹果酸亦被广泛应用于其他食品エ业，如用作水产品的保鲜剂等。苹果酸的生产方法主要有化学合成法、发酵法、转化法。化学合成法生产的苹果酸在应用上受到限制。转化法主要是固定化酶和固定化细胞转化。20世纪80年代末以来，对转化工艺的研究获得突破，并成功地应用于エ业化生产。而发酵法生产苹果酸的研究还未有重大进展，非糖质原料发酵法尚处于实验室水平。糖质原料发酵法エ艺中，一步发酵法和混合发酵法都有较大进展，但有关的研究报道尚少。而混合发酵法由于涉及到两种微生物，培养条件要求比较严格，发酵周期较长，产酸率较低，副产物较多。因此，本专利采用米曲霉发酵糖质原料生产苹果酸，通过对发酵温度、接种量、起始糖浓度及碳酸钙加入量的优化，以淀粉水解液为原料，其产酸水平最高可达90 g/L
发明内容
本发明提供了ー种利用米根霉ー步发酵法产L-苹果酸的方法，本文采用米曲霉发酵糖质原料生成苹果酸，通过对发酵温度、接种量、起始糖浓度及碳酸钙加入量的优化，以淀粉水解液为原料，其产酸水平最高可达90 g/L。I. ー种利用米根霉ー步发酵法产L-苹果酸的方法，其特征在于，其特征在于，在500 mL摇瓶中配制100 mL发酵培养基，加入一定量的碳酸钙，接入一定量的米根霉孢子，在恒温振荡器中培养温度32 38°C，摇瓶转速200 r/min。2.步骤I里的种子培养基(％ ):豆饼粉6. 0，蔗糖2. 0，NaNO3 0. 3，K2HPO4 0. 1，KCl 0. 1，MgSO4 7H20 0. 03，FeSO4 7H20 0. 05。加水至 100. 0 mL，于三角瓶中 121°C、0. I
MPa湿热灭菌。3.步骤 I 里的发酵培养基(％ ):豆饼粉 0.5，FeSO4^H2O 0.01，CaCl2 0.01，K2HPO4 0. 01, MgS04 H2O 0.01，MnSO4 0. 05, (MM)2SO4 0. 2，葡萄糖 8. 0 13. 0，CaCO3
6.5 8. 5 (单独灭菌)。4.步骤I所述的米根霉接种量最佳为12%。5.步骤I所述的发酵培养温度最佳为33°C。。6.步骤I所述的初始糖浓度最适为110 g/L。7.步骤I所述的碳酸钙的最佳添加量为80 g/L。
图I接种量对米曲霉产L-苹果酸的影响。图2发酵温度对米曲霉产L-苹果酸的影响。下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。本发明所用的米根霉orjzae)菌株购买自上海丹曦化工科技有限公司，菌株号为40281。实施例I
本实施例说明接种量对米根霉ー步发酵法产L-苹果酸的影响，在发酵培养基其他条件相同的情况下，将米根霉分别按1%，4%，8%，12%，16%的接种量接种入发酵培养基中。在不同的接种量下，米曲霉菌株产L-苹果酸情况见图I。实验结果表明，接种量为12%时产酸率最高。接种量太高会造成菌丝结团从而影响通气过程，接种量太低会使发酵不充分影响产酸过程。实施例2
本实施例说明发酵温度对米根霉ー步发酵法产L-苹果酸的影响，在其他条件相同的情况下，探讨发酵温度对L-苹果酸产量的影响。发酵温度分布控制在30で，31で，32で，33で，34で，35で，36で，37で。从图2可以看出，米曲霉菌株的最适发酵温度为33°C。实施例3本实施例说明接种量对米根霉ー步发酵法产L-苹果酸的影响，米曲霉菌株的碳源适应范围比较广，液化淀粉、葡萄糖、淀粉水解液都是较好的碳源，考虑到以水解糖为原料更有利于产品的后提取，因此选用淀粉水解液为发酵碳源，同时，淀粉原料来源丰富，采用双酶制糖エ艺技术成熟、质量可靠。将淀粉水解液配制成不同的浓度70 g/L,80 g/L,90 g/L,100 g/L, 110 g/L, 120 g/L，考察米曲霉菌株的产酸情況，结果见表I。实验结果表明，随着糖浓 度的増加，产酸逐渐增加，起始糖浓度为110 g/L时转化率最高。初糖浓度高于此值时，转化率降低，发酵残糖偏高。综合考虑产酸、残糖和发酵周期等指标的前提下，将糖浓度控制在110 g/L为佳。表I起始糖浓度对米曲霉产L-苹果酸的影响
权利要求
1.ー种利用米根霉ー步发酵法产L-苹果酸的方法，其特征在于，在500 mL摇瓶中配制100 mL发酵培养基，加入一定量的碳酸钙，接入一定量的米根霉孢子，在恒温振荡器中培养温度32 38°C，摇瓶转速200 r/min。
2.权利I所述的方法，其特征在于，种子培养基(％):豆饼粉6.0，蔗糖2.0，NaN030.3，K2HPO4 0. 1，KCl 0. 1，MgSO4 7H20 0. 03，FeSO4 7H20 0. 05 ;加水至 100. 0 mL，于三角瓶中121°C、0. I MPa 湿热灭菌。
3.发酵培养基(％):豆饼粉0. 5，FeSO4 H2O 0. 01，CaCl2 0. 01，K2HPO4 0.01，MgS04 H2O 0.01，MnSO4 0. 05, (MM)2SO4 0. 2，葡萄糖 8. 0 13. 0，CaCO3 6. 5 8. 5 (单独灭菌)。
4.权利I所述的方法，其特征在于米根霉接种量为12%。
5.权利I所述的方法，其特征在于培养温度为33°C。
6.权利I所述的方法，其特征在于初始糖浓度为110g/L。
7.权利I所述的方法，其特征在于碳酸钙的添加量为80g/L。
全文摘要
本发明提供了一种利用米根霉一步发酵法产L-苹果酸的方法，本文采用米曲霉发酵糖质原料生成苹果酸，通过对发酵温度、接种量、起始糖浓度及碳酸钙加入量的优化，以淀粉水解液为原料，其产酸水平最高可达90g/L。
文档编号C12P7/46GK102618589SQ20121010533
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月12日 优先权日2012年4月12日
发明者张斌 申请人:苏州百趣食品有限公司