一种甜菜碱合成途径中的甲基转移酶基因及应用的制作方法

专利名称：一种甜菜碱合成途径中的甲基转移酶基因及应用的制作方法
技术领域：
本发明公开一种蓝细菌甘氨酸甜菜碱合成途径中的两种甲基转移酶基因序列以及其修饰基因的序列和它们分别编码的蛋白质序列，并将这两种基因用于作物抗逆育种， 属于基因工程领域。具体地说涉及到克隆和修饰参与一条甘氨酸甜菜碱生物合成途径中的甘氨酸肌氨酸N-甲基转移酶基因和二甲基甘氨酸N-甲基转移酶基因及利用。
背景技术：
在甜菜碱天然合成植物中，甘氨酸甜菜碱作为一种渗透保护物质，能够提高植物对多种非生物胁迫(如盐碱、干旱、低温等)的抗性，而且对某一胁迫的抗性程度与甜菜碱的积累水平密切相关。基因工程研究表明，通过转基因技术在植物中积累甘氨酸甜菜碱能够提高其抗逆性。在自然界中，已知的甘氨酸甜菜碱的生物合成途径主要有两种，即胆碱氧化途径和甘氨酸甲基化途径。胆碱氧化途径以胆碱为底物，通过一步或两步氧化反应合成甘氨酸甜菜碱。此途径分布广泛，由存在于微生物、植物和哺乳动物中的胆碱脱氢酶(CDH)和甜菜碱醛脱氢酶催化。存在于微生物中的胆碱氧化酶，能催化合成甜菜碱的两个连续的反应。在合成甘氨酸甜菜碱的高等植物中胆碱单加氧酶和甜菜碱醛脱氢酶依次催化甘氨酸甜菜碱合成。已有多个参与胆碱氧化合成甘氨酸甜菜碱的酶基因被相继克隆。甘氨酸甲基化途径是甘氨酸经过连续三步N-甲基化生成甜菜碱，是由依赖S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甘氨酸肌氨酸甲基转移酶(glycine sarcosine methyl transferase, GSMT)和依赖SAM的肌氛酸二甲基甘氛酸甲基转移酶(sarcosine dimethyl glycine methyltransferase, SDMT)分别催化完成的。从上个世纪80年代后期开始，陆续在一些古细菌、真细菌和极端兰细菌中发现了该条途径，但了解极少，至今只从少数几个物种中克隆得到相关基因。以胆碱为底物的合成途径已在多种生物中进行了研究。该途径中根据胆碱氧化方式的不同涉及一种或两种酶。在高等植物中，甜菜碱生物合成途径的研究主要集中于藜科植物，在苋科和禾本科植物中也有研究(McNeil et al. ,1999, 2001) 在藜科和苋科植物中，甜菜碱由胆碱经两步氧化反应合成，先由胆碱单加氧酶(CMO)催化生成甜菜碱醛，后者在甜菜碱醒脱氢酶(BADH)催化下生成甜菜碱(Weretilnyk et al. , 1989 ；Akamoto, 2000) 目前，CMO仅在藜科和苋科植物中发现，推测其它科植物可能具有不同的胆碱氧化酶。而编码BADH的基因已经从菠菜(Weretilnyk and Hanson, 1990)等多种植物中克隆。BADH并不是甘氨酸甜菜碱合成特用的酶，它与ω-氨基醛脱氢酶(一种在多胺代谢中广泛存在的
3酶)相同(Holmstrom et al. , 1994 ；Rathinasabapathi et al. , 1994)。在大肠杆菌中，与甜菜碱合成相关基因由bet操纵子编码(Andresen et al., 1988 ；Lamark et al. , 1991) :betA 编码 CDH, betB 编码 BADH, betT 编码胆喊转运蛋白，betl 编码调控蛋白，从胆碱到甜菜碱的转变途径与植物中类似，是由两种酶催化的，即胆碱脱氢酶(choline dehydrogenase, Q)H)和BADH。Q)H是一种依赖氧的膜结合黄素蛋白，不但能催化胆碱氧化为甜菜碱醛，而且能以几乎相同的速率催化甜菜碱醛的氧化。BADH是一种依赖于NAD的可溶性蛋白，对甜菜碱醒具有很高的亲合性(Landfald and Strom, 1986)。在微生物球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)和滋养节杆菌(A. pascens) 中，甘氨酸甜菜碱的合成仅需要一种酶即胆碱氧化酶(choline oxidase, COD)催化(Ikuta et al.，1977)，同时产生 H2O2。以甘氨酸为底物合成甜菜碱的途径首先是在两种极嗜盐的微生物 Actinopolyspora halophila和Ectothiorhodospira halochloris 中发现的(Nyyssola et al. ,2000,2001 ；ffaditee et al. ,2003) 在这些微生物中，甘氨酸经过连续三步N-甲基化生成甘氨酸甜菜碱，反应的第一步是由依赖S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)的甘氨酸肌氨酸甲基转移酶(glycine sarcosine methyltransferase, GSMT)催化的，反应的第二步由GSMT或依赖SAM的肌氨酸二甲基甘氨酸甲基转移酶(sarcosine dimethylglycine methyltransferase, SDMT)催化，最后一步是由 SDMT 催化的(Nyyssola et al. , 2001 ；ffaditee et al. ,2003)。甜菜碱生物合成的基因工程研究对天然积累甜菜碱生物体的生化分析表明，甜菜碱在植物体内是稳定的，并且甜菜碱积累的限速步骤是其合成而不是其降解(Rhodes and Hanson, 1993)。随着人们对植物和微生物中甜菜碱生物合成途径分子机制深入了解，大量甜菜碱合成的相关基因也相继被克隆。这为通过基因工程的手段在不积累甜菜碱的生物体内建立甜菜碱生物合成途径提供了分子依据。目前参与甜菜碱合成的多个基因如COD、CDH、CM0、BADH等已在多种植物中转化成功，这些转基因植株积累了不同水平的甜菜碱，提高了其对多种逆境的抗性。高等植物中，胆碱转化为甜菜碱由胆碱单氧化酶(CMO)催化，已先后从菠菜 (Rathinasabapathi et al·, 1997)、甜菜(Russell et al. , 1998)和山菠菜(Atriplex hortensis)(沈义国等，2001)中克隆到CMO并进行了转基因研究，这些基因具备信号肽序列，用于引导成熟肽链定位于叶绿体基质。Nuccio等(1998)将菠菜的CMO基因转入烟草，转基因产物定位于叶绿体中，然而CMO活性和甜菜碱含量都非常低(彡50nmol g—1 FW) (Nuccio et al. ,2000)。然而，当CMO在细胞质中表达,而不是在叶绿体中表达时,转基因烟草中甜菜碱含量大大提高(430nmol g-1 FW)。McNeil等(2000)用14C标记的胆碱(甜菜碱合成底物)追踪研究转基因烟草中胆碱代谢的动力学，发现胆碱由胞质向叶绿体的转运是制约叶绿体内甜菜碱合成的主要因素(McNeil et al.，2000)。磷酸乙醇胺-N-甲基转移酶(PEAMT)是胆碱合成途径中的关键酶，它催化磷酸乙醇胺生成磷酸胆碱的甲基化反应。McNeil等(2001)将菠菜的PEAMT和CMO基因以及甜菜的BADH基因共转化到烟草叶绿体，同单转CMO基因烟草相比，转多基因烟草的游离胆碱含量提高了 50倍，甜菜碱含量提高 7 30 倍，最高达至 Ij I. 8 μ mo I g_1 Fff (McNeil et al. ,2001) 自1981年从高等植物中分离到BADH后，有关甜菜碱合成酶的研究很快引起了广泛关注。已从疲菜(Weretilnyk and Hanson, 1990)、甜菜(McCue and Hanson, 1992)、高梁(Wood et al. , 1996)、水稻(Nakamura et al.，1997)、大麦(Ishitani et al. , 1995 ； Nakamura et al. , 2001)、山菠菜(肖岗等，1995)和千穗谷(Legaria et al., 1998)中克隆到BADH基因。在藜科、苋科等植物中，BADH主要存在于叶绿体基质；而在水稻、大麦等单子叶植物中BADH主要存在于过氧物酶体中。BADH在细胞中的不同定位可能有利于其酶活性的发挥。正常条件下植物BADH基因表达量很低，一些资料(Nakamura et al.，1997;肖岗等，1995 ；WeretiInyk et al.，1989)表明，BADH基因的表达受盐胁迫诱导，但这个反应并不具有盐诱导的特异性，而是对渗透胁迫的反应(Ishitani et al.，1995)。转BADH基因的研究较多。Rathinasabapathi等(1994)最早将在菠菜和甜菜的 BADH基因转入烟草，转基因产物定位于叶绿体中。外源基因的表达使转基因烟草能够抵抗甜菜碱醛的毒害。在培养基中加入5mM甜菜碱醛时，转基因烟草中甜菜碱的含量达到了 20μπιΟ1 g-1 FW。然而，在培养基中不加甜菜碱醛时，转基因烟草不能合成甜菜碱。郭岩等(1997)利用基因枪法将山菠菜BADH基因转移到水稻内，筛选出的转基因水稻能够在盐胁迫下生长结籽。Kumar等(2004)获得了转BADH基因的胡萝卜，甜菜碱含量分别为 93-101 μ mo I g—1 DW，大大提高了转基因植株的耐盐性。Yang等(2005，2007)将来源于菠菜(Spinacia oleracea)的BADH基因转化烟草,转基因植株能合成甘氨酸甜菜碱,合成的甜菜碱主要积累于叶绿体中，转基因植株提高了对高温胁迫的抗性。他们认为在中度高温胁迫下，转基因烟草光合作用的维持是由于甜菜碱对Rubisco活化酶的保护作用；在严重高温胁迫下，转基因烟草通过提高体内抗氧化酶系统的功能，减轻了高温胁迫对光合机构造成的活性氧伤害，维持了转基因烟草较高的PS II活性(Yang et al.，2007)。已有的关于CMO和BADH基因工程的研究多集中在单个基因的转化，虽然转基因植物的抗逆性有不同程度的提高，但甜菜碱含量很低。大肠杆菌的CDH兼有胆碱单氧化物酶和甜菜碱醛脱氢酶的功能，此特性使仅转移 betA基因的基因工程即可赋予植物积累甘氨酸甜菜碱的能力。1996年，Lilius等将betA 基因转入烟草，转基因植物的耐盐性与对照植株相比有明显的提高，但他们没有报道甜菜碱的积累水平。Takabe等(1998)将修饰后包含线粒体定位信号的betA基因导入水稻，转基因水稻能够积累5 μ mol g-1 FW的甜菜碱，而且其耐盐和抗旱性较对照有明显提高。王淑芳等(2001)将betA转移到番茄中，提高了番茄的抗盐性。在盐胁迫条件下，转betA基因的卷心菜(Brassica oleracea var. capitata)的叶绿素含量和生物量都显著高于野生型植株的(Bhattacharya et al. ,2004)。我们实验室通过农杆菌介导法获得了转betA基因玉米和棉花，抗逆性生理分析表明转基因玉米的耐冷和抗旱能力有明显提高(Quan et al.， 2004a，b)，转基因棉花的抗旱性也的得了明显的改善(Lv et al.，2007)。节杆菌体内的胆碱氧化酶(COD)催化甜菜碱合成只需要单个酶，因此，转COD基因的研究有较多工作。COD 酶由 codA (Arthrobactor globiformis)或 cox (A. pascens)基因编码，目前使用最多的是codA基因。codA基因已被转入拟南芥(Hayashi et al. , 1997, 1998 ；Alia et al. , 1998 ；Sakamoto et al. ,2000)、水稻(Akamoto et al. , 1998 ；Mohanty et al. ,2002)和番茄(Park et al.，2004)等多种植物中，转基因植株的耐盐(Hayashi et al. ,1997,1998 ;Akamoto, 1998)、耐冷(Park, 2004 ；Hayashi et al. , 1997 ；Alia et al.， 1998 ；Akamoto et al.，1998)、耐热(Alia et al. , 1998)和抗冻(Sakamoto et al. , 2000)能力都有显著提高。在拟南芥中表达带有叶绿体定位信号的COD基因，叶片和种子中甜菜喊浓度分别为I. 2 μ mol g 1FW和18 μ mol g 1 Dff (Hayashi et al. , 1997),转基因植株表现出很强的耐盐性。在冰冻胁迫下，GB在转基因拟南芥植株中的积累显著提高了植株的存活率，而很多冷调控基因(如cor6. 6, corl5a, cor47和cor78)的表达水平与野生型相比无明显差别(Sakamoto et al.，2000)。在水稻的转化中将COD定位于叶绿体，转基因水稻叶片中甜菜碱浓度与转基因拟南芥中类似；如果将COD定位于胞质内，合成的甜菜碱浓度比 COD定位于叶绿体的植株高3-5倍(Akamoto et al.，1998)。这可能因为胆碱浓度在细胞质中(胆碱合成位点)比在叶绿体中高所致(Mudd and Datko, 1989 ；Alia et al. ,1999)。 然而，甜菜碱在叶绿体中的积累却能更好的保护PS II复合体免受高盐和低温胁迫的伤害 (Akamoto et al. , 1998)。转codA基因番爺能够积累O. 3-1. 2 μ mol g 1 FW甜菜喊,转基因植株在从种子萌发到结实的各个阶段的耐冷性都得到明显提高。在冷胁迫条件下，转基因番茄的产量比野生型提高了 10-30% (Park et al.，2004)。由于COD催化胆碱生成甜菜碱的过程中伴随着H2O2的产生，而转基因植株体内H2O2水平的适当提高激活了一些活性氧清除机制如抗坏血酸氧化酶和过氧化氢酶等的表达，这些酶可以将H2O2转化成H2O,从而使 H2O2含量维持在一个较低的对细胞无害的水平。同时，转基因植株体内活性氧清除酶类活性的增高，也有利于提高植物的抗逆境胁迫能力(Park et al.，2004)。Nyyssola等(2000)分别从两种在系统发生学上相去甚远的喜盐生物 (Ectothiorhodospira halochloris 和 Actinopolyspora halophila,即嗜盐隐杆藻)中分离到两个催化甜菜碱合成的甲基转移酶GSMT(甘氨酸肌氨酸甲基转移酶)和SDMT(肌氨酸二甲基甘氨酸甲基转移酶)，两个物种中的甲基转移酶在氨基酸水平上序列相似性很高， 而且它们都以甘氨酸为底物通过两步甲基化反应合成甘氨酸甜菜碱。Nyyssola等(2001) 从E. halochloris克隆出这两个甲基转移酶基因，分别命名为EcGSMT和EcSDMT。在哺乳动物中甘氨酸N-甲基转移酶(GMT)催化甘氨酸甲基化成肌氨酸，不发生进一步的甲基化反应。哺乳动物中的GMT和EcGSMT、EcSDMT以及ApGSMT、ApSDMT之间缺少同源性(Waditee et al.，2003)。2005 年，Waditee 等将 A. halophila 中编码 GSMT (ApGSMT)和 SDMT (ApSDMT) 的基因共转化到淡水藻青菌(Synechococcus sp. PCC 7942)和拟南芥中，发现在盐胁迫下转ApGSMT/ApDMT基因的PCC 7942细胞的GB浓度高达200mM，比转bet (betA、betB)基因的淡水藻青菌的含量提高了 5倍，前者在600mMNaCl条件下和海水中能够生长。转ApGSMT/ ApDMT的拟南芥植株甜菜碱含量比转CMO基因的植株显著增加，推测是由于底物不同造成的。另外，GB在转ApGSMT/ApDMT基因拟南芥的根、茎、叶和花等中都有积累，转基因植株的耐盐、耐冷和抗旱性与转CMO基因的拟南芥相比都有明显提高。最近，Waditee等(2007) 从A. hanothece中克隆出磷酸甘油酸脱氢酶基因(ApP⑶H),并将其转入大肠杆菌E. coli 和拟南芥中。结果表明，无论是在天然合成GB的大肠杆菌中还是不能自身合成GB的拟南芥中，ApP⑶H的异源表达都提高了甘氨酸甜菜碱的积累水平。他们还将ApP⑶H、ApGSMT和 ApSDMT三个基因在拟南芥中共表达，在IOOmM NaCl条件下，转基因拟南芥根的甜菜碱含量是转 ApGSMT/ApSDMT 的 L 5 倍(Waditee et al.，2007)，积累水平达到 I. 6 μ molg-1 FW。这些结果表明，将以甘氨酸为底物的GB合成途径引入不合成GB的植物中，有望使植物积累大量GB。如何提高细胞甘氨酸甜菜碱积累水平从而进一步提高转基因植物抗逆性是植物科学领域里十分关注的课题之一。开展甘氨酸甲基化途径引入的基因工程可利用细胞中较胆碱丰富的甘氨酸为底物，有望在转基因植株中积累高浓度的甘氨酸甜菜碱。本发明的用语和培养基“莖尖”是指十到几十微米的莖尖分生组织(shoot meristemetic)和大到几十毫米的芽端(Shoot tip)，“茎尖分生组织”是指顶端生长锥及其邻近的叶原基。在本发明中，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化程序基本上同Ishida等(Ishida等，1996)报道的,在转染液中添加乙酰丁香酮(acetosyringone, As) 等酚类化合物和中性单糖。在本发明中，转染所用的农杆菌含有改造后的Ti-质粒，后者可携带或不携带除草剂抗性基因或其它选择剂抗性基因。在本发明中，所用的除草剂抗性基因或其它抗性基因只要在转化植物细胞中活跃表达并赋予植株抗性即可，不限制基因的来源、大小、所用启动子和所抗除草剂或其它选择剂的种类的限制，也不受农杆菌菌株的限制。在本发明中，基本培养基及植物生长调节物质用热压灭菌；抗生素等活性成分用过滤灭菌，在培养基灭菌后加入。在本发明中，除草剂等筛选剂用中性自来水溶解后喷洒。在本发明中，农杆菌培养一般采用YEP培养基(酵母提取物10g/l，蛋白胨10g/l， NaCl 5g/l，pH 7. O,固体培养基加入15g/l琼脂)培养。禾谷类作物种子萌发和胚培养采用的基本培养基为改良MS培养基=KNO3 1900mg/ I, NH4NO3 1650mg/l、CaCl2 · 2H20 440mg/l、MgSO4 · 7H20 370mg/l、KH2PO4 · H2Ol70mg/1、 FeSO4 · 7H20 27. 8mg/l、ZnSO4 · 7H20 10mg/l、MnSO4 · H2O 22mg/l、H3BO3IOmg/U Na2MoO4 0. 5mg/l、CuSO4 · 5H20 0. 05mg/l、CoCl2 · 2H20 0. 05mg/l、盐酸硫胺素 10mg/l、盐酸吡哆醇 lmg/1、烟酸lmg/1、甘氨酸2mg/l、肌醇100mg/l、生物素0. 05mg/l、酪蛋白水解物250mg/l、 蔗糖30g/l、琼脂粉7g/l、pH 5. 8-6.0。植物生长调节物质的种类和浓度因培养材料的基因型而调整。豆科作物种子萌发和胚培养采用的基本培养基为改良MS培养基(同上)或改良 B5 培养基。后种培养基成分为KNO3 2500mg/l、(NH4)2SO4 134mg/l、CaCl2 · 2H20150mg/l、 MgSO4 · 7H20 250mg/l、NaH2PO4 · H2O 150mg/l、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/l、ZnSO4 · 7H20 2mg/l、 MnSO4 · H2O 10mg/l、H3BO3 10mg/l、Na2MoO4 0. 5mg/l、CuSO4 · 5H20 0. 05mg/l、CoCl2 · 2H20 0. 05mg/l、盐酸硫胺素10mg/l、盐酸批卩多醇lmg/1、烟酸lmg/1、甘氨酸2mg/l、肌醇100mg/l、 生物素0. 05mg/l、酪蛋白水解物250mg/l、蔗糖20g/l、琼脂粉7g/l、pH 5. 8-6. O。植物生长调节物质的种类和浓度因培养材料的基因型而调整。在本发明中，移栽苗隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐溶液或1/2改良B5培养基无机盐溶液，pH 6. 0-7. O。

发明内容
针对现有技术本发明的目的是提供一种甜菜碱合成途径中的甲基转移酶基因及其修饰和利用。ApGSMT2基因和ApDMT2基因的克隆
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本发明提取嗜盐隐杆藻(Aphanothece halophytica)基因组DNA,根据哺乳类甘氨酸N-甲基转移酶(GMT)的保守序列设计PCR引物，克隆出ApGSMT2、ApDMT2基因，构建植物表达载体，转入烟草中进行基因功能验证。通过检测转基因烟草的甘氨酸甜菜碱含量，结合基因序列分析比较，确定了 ApGSMT2和ApDMT2基因是有功能的，分别是ApGSMT和ApSDMT 的同源基因。具体步骤为30ml菌液装入50ml离心管中，4°C 5000g离心IOmin收集菌体。STE(O. IM NaCl, IOmM Tris-HCKpH 8. O), ImM EDTA(pH 8. O))重悬2次。向盛有菌体的50ml离心管中加 Λ 20ml 2XCTAB(IOOmmoI/L Tris-HCl pH 8. O,I. 4mol/L NaCl,20mmol/L EDTA ρΗ8· 0， 2% CTAB)缓冲液，混匀，65°C水浴中温育90min(预热前加入1% β -巯基乙醇)，中间摇匀2-3次。然后将离心管从水浴锅中取出，待混合物冷至室温后加入等体积氯仿/异戊醇 (24 : I),轻轻颠倒离心管几次,室温下IOOOOrpm离心lOmin。再将上清转入新的50ml离心管中，O. 8倍体积异丙醇沉淀。絮状沉淀转入盛有70%乙醇的7ml离心管中，洗涤两次。 弃去乙醇，晾干，2ml TER(2ml ΤΕ+2 μ I 10mg/ml RNaseA)溶解，37°C水浴助溶。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25 24 1)，轻轻颠倒，使其充分混匀抽提10min，4°C 12000rpm 离心lOmin。取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇(24 I)，轻轻颠倒，使其充分混匀抽提 lOmin, 4°C 12000rpm离心IOmin0取上清液，加入1/10体积3M醋酸钠(PH 5. 2)，混匀后， 加入2倍体积冷的无水乙醇。轻轻混匀静置一会儿后，用枪头勾出DNA，用70%乙醇冲洗2 次后，真空干燥。依所提DNA量加入100-500ul的TE溶解DNA。检索GenBank数据库，收集相关甲基转移酶基因，对相应蛋白序列进行分析，设计简并引物 GSMT-F 5’ATGGCNAARA ARGTNGA 3’ 和 GSMT-R 5’YTARTCYTTY TTNGC3’ ；DMT_F 5’ ATGACNAARG CNGAYGC 3’ 和 DMT-R 5’ YTANGGYTTR TGRAA 3’。注释RA/G ；ff A/T ；K G/T ；B C/G/T ；M A/C ；D A/G/T ；V A/C/G ；H A/C/T ；N A/C/G/T ；Y C/T ；S G/C.以嗜盐隐杆藻基因组DNA为模板，分别用简并引物GSMT-F和GSMT-R，DMT-F和 DMT-R，扩增得到DNA片段。反应程序为95°C预变性5min ;95°C变性lmin，45°C退火lmin， 72°C延伸30s，循环35次；72°C延伸7min。采用Takara回收Kit回收PCR扩增得到的DNA 片段，选用 pGEM-T Easy Vector Systems Kit (Promega, USA)对 PCR 片段进行克隆，送测序公司进行测序。测序结果表明，获得了两条长为798bp和834bp的核昔酸序列。对获得的序列进行分析，确定了它们分别编码两个0RF。将两个ORF序列编码的蛋白序列进行blast分析， 发现它们与已报道来源于其他种生物的GSMT和DMT序列有很高的相似性。进一步分析表明它们均含有甲基转移酶的特征基序(Motif I,Post I7Motif II，和Motif III)，初步推定它们是嗜盐隐杆藻甲基转移酶基因的新成员，分别命名为ApGSMT2、ApDMT2基因。本发明克隆的嗜盐隐杆藻甘氨酸肌氨酸N-甲基转移酶基因(ApGSMT2)的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 5所示。ApGSMT2编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 6所示。本发明克隆的嗜盐隐杆藻二甲基甘氨酸N-甲基转移酶基因(ApDMT2)的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 7所示。ApDMT2编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 8所示。
ApGSMT2基因和ApDMT2基因的修饰本发明为了使嗜盐隐杆藻(一种蓝藻)的基因能在禾谷类作物中高效表达，我们选用禾谷类植物及玉米的偏爱密码子取代部分ApGSMT2和ApDMT2的密码子，修饰后的 ApGSMT2 命名为 ApGSMT2d，修饰后的 ApDMT2 基因命名为 ApDMT2d。ApGSMT2d 和 ApDMT2d 基因人工合成，并经过测序验证。ApGSMT2d的核甘酸序列如序列表SEQ ID NO. 9所示。ApDMT2d的核甘酸序列如序列表SEQ ID NO. 10所示。甲基化酶与叶绿体蛋白导肽序列融合本发明为了使ApGSMT2及ApGSMT2d和ApDMT2及ApDMT2d基因在高等植物细胞内能有效提高植株的抗逆性，从实现甘氨酸甜菜碱在细胞内的区域化积累角度出发， 将ApGSMT2及ApGSMT2d和ApDMT2及ApDMT2d分别与定位叶绿体蛋白的导肽(transit peptide)编码区融合，使ApGSMT2及ApGSMT2d和ApDMT2及ApDMT2d蛋白在合成后定位于叶绿体中，促进叶绿体内积累大量的甘氨酸甜菜碱。克隆出拟南芥的RUBISC0小亚基基因的导肽编码区,分别与ApGSMT2及ApGSMT2d和ApDMT2及ApDMT2d基因融合，产生ApTpGSMT2 及 ApTpGSMT2d 和 ApTpDMT2 及 ApTpDMT2d 基因。拟南介的RUBISC0小亚基基因的导妝编码区如序列表SEQ ID NO. 11所不。其编码的导肽如序列表SEQ ID NO. 12所示。本发明产生的融合蛋白ApTpGSMT2和ApTpGSMT2d氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 13所示。本发明产生的融合蛋白ApTpDMT2和ApTpDMT2d的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 14所示。克隆的甲基化酶基因与线粒体蛋白导肽序列融合本发明构建融合基因以实现甘氨酸甜菜碱在植物线粒体中积累达到进一步提高转基因植物的抗逆性的目的。线粒体作为细胞内ATP合成的场所，是细胞能量来源的主要场所，实现甜菜碱在线粒体内的积累有利于提高转基因植物的抗逆性。如将玉米柠檬酸合成酶基因的导肽编码序列与ApGSMT2和ApDMT2基因融合，产生ApTpGSMT2m和ApTpDMT2m基因。玉米线粒体蛋白导肽序列如序列表SEQ ID NO. 15所示。本发明产生的融合蛋白ApTpGSMT2m序列如序列表SEQ ID NO. 16所示。本发明产生的融合蛋白ApTpDMT2m序列如序列表SEQ ID NO. 17所示。植物表达载体的构建本发明将ApGSMT2/ApDMT、ApTpGSMT2d/ApTpDMT2d、ApTpGSMT2m/ApTpDMT2m 等分别与高等植物启动子如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S RNA基因启动子、玉米Ubiquitin基因启动子、拟南芥RD29启动子和基因3’尾巴区相连，形成高效表达的融合基因，进而构建出分别携带 ApGSMT2 和 ApDMT、ApTpGSMT2d 和 ApTpDMT2d 及 ApTpGSMT2m 和 ApTpDMT2m 的植物表达载体(目标基因分别由不同的启动子启动，可有不同组合)。如利用mini-Ti质粒产生 T-DNA区为图I所示的不同植物表达载体。基因重组采用常规的分子生物学技术。基因功能确定及其应用价值的评估本发明为了确定ApGSMT2和ApDMT2是否具有催化甲基化反应的活性，二者协同表达能否提高细胞甘氨酸甜菜碱的含量，将ApGSMT2和ApDMT2重组到原核表达载体上， 转入大肠杆菌，测定转基因大肠杆菌和野生型大肠杆菌的甘氨酸甜菜碱含量。甘氨酸甜菜碱提取采用Xing和Rajashekar (2001)方法，含量用1H NMR测定(Bruker AM500NMR spectrometer)。在ApGSMT2和ApDMT2共表达的大肠杆菌BL21 (DE3)plysS细胞中甘氨酸甜菜碱的含量比未转基因对照细胞高一倍左右(在LB培养液中)，在培养液中增加 O. 3-0. 5mol/LNaCl，转基因细胞的甘氨酸甜菜碱含量比未转基因对照增加30% -60%，转基因细胞表现出比对照明显提高的耐盐性，生长速率显著高于对照。即ApGSMT2和ApDMT2 在大肠杆菌中共表达能大量合成甘氨酸甜菜碱，提高细胞的耐盐性。本发明以含有CaMV 35S启动子、多克隆位点和植物抗除草剂基因EPSPs (5_e noIpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase gene)的植物表达载体 pCPE 为受体， 插入ApGSMT2和ApDMT2基因(均由CaMV 35S启动子启动)，产生质粒pCPE_ApGSMT2、 pCPE-ApDMT2和pCPE_ApGSMT2_ApDMT2。将这些质粒分别转入根癌农杆菌LBA4404中， 然后转化不能合成甘氨酸甜菜碱的烟草细胞，产生转基因植株。在不同转基因植株的叶片中测定甘氨酸甜菜碱含量，确定转基因是否产生产物功能。遗传转化和转基因植株分析步骤为取烟草无菌苗为材料，采用叶盘法进行转化。转基因小芽在含有选择剂4mg/ L glyphosate (Monsanto, USA)的诱导培养基上筛选，在生根培养基上生根。采用PCR和 Southern杂交分析法确定转基因植株。通过RT-PCR(Reverse Transcription PCR)方法检测转基因在烟草叶片中的表达水平，利用1H NMR测定法定量叶片中甘氨酸甜菜碱含量。结果表明，共表达ApGSMT2/ApDMT2的烟草不仅细胞内有较高丰度的转基因转录本，而且积累了较高浓度的甘氨酸甜菜碱(株系9浓度为0. 1832 μ molg-1 Fff)，大幅度高于转betA基因植株的甘氨酸甜菜碱含量。而未转基因植株和只含ApGSMT2或ApDMT2基因的转基因植株没有检测出甘氨酸甜菜碱积累。为检测转ApGSMT2/ApDMT2基因对烟草植株生长发育和抗逆性的影响，将转基因植株种子和未转基因对照植株种子播种在花盆中，观察生长发育的变化。在正常生长条件下转基因烟草植株没有表型差异。然而，通过检测转基因烟草叶盘在高盐和渗透胁迫条件下的存活率和生长速率，得出转ApGSMT2/ApDMT2基因的烟草与对照相比耐盐耐旱性大幅度提高，转基因烟草耐盐耐旱性的改变是由于ApGSMT2/ApDMT2基因表达及甘氨酸甜菜碱积累造成。为了了解ApGSMT2/ApDMT2基因表达能否影响转基因烟草植株对干旱胁迫的反应，将转基因烟草小苗置于含10% (ff/V)PEG 6000的MS无机盐溶液中进行渗透胁迫处理， 检测叶片相对含水量的变化和细胞膜损伤等变化。得出烟草植株在渗透胁迫过程中叶片相对含水量逐渐降低，细胞膜损伤不断加重，而转基因植株相对含水量比对照植株降低速率低，细胞膜损伤明显较轻，生长较快，表明ApGSMT2/ApDMT2基因表达的烟草植株耐旱性有较大提高。该基因在作物抗性育种中有很好的应用价值。作物遗传转化及转基因株系获得根据转基因受体材料选用不同转基因方法获得转基因植物。常用的转化方法有1)农杆菌介导的遗传转化方法，如通过花序浸染法转化拟南芥，通过平板抗生素筛选以及PCR验证获得阳性转化植株进行后续分析。2)直接转化法，即提取重组质粒DNA，采用基因枪轰击法、聚乙二醇诱导法、电融合法、硅碳纤维法等直接将质粒DNA导入细胞。3)种系转化法，包括花粉管通道法、子房注射法等。此外，还有将不同类方法组合使用的转化程序，如将基因枪轰击法和农杆菌结合使用以提高转化效率。本发明以以玉米、小麦、高梁、大豆、棉花等作物为材料进行遗传转化，采用的转化方法主要为农杆菌介导法和基因枪轰击法。本发明以农杆菌介导法转化小麦获得抗性株系为例简述试验步骤及方法小麦种子用70%乙醇浸泡l-3min,再用O. I %氯化萊溶液浸泡7_10min,然后用无菌水洗涤5遍。灭菌期间不断摇晃种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌种子放在盛有用无菌水浸润滤纸的罐头瓶内，封口后放在黑暗条件(24±2°C )下1-2天。待种子萌动长出胚根及胚芽后，将其放在Ml培养基上于黑暗条件(24±2°C)下继续培养。待胚芽伸长至2-5cm 时，用解剖刀剥去胚芽鞘及1-2片幼叶，暴露出芽尖，再用解剖刀从中部纵向切伤茎尖生长点，切去初生根。切伤茎尖生长点的无菌苗用于农杆菌转化。将带有目的质粒的根癌农杆菌LBA4404在附加抗生素的YEP培养基中28°C下震荡培养，震荡速率为180rpm，使细菌处于对数生长期。然后在3000rpm下离心5分钟，弃上清夜。再将菌体用添加100mg/l乙酰丁香酮(acetosyringone, AS)的MS液体培养基重悬。 然后将菌液倒在直径15cm的培养皿中，倾斜培养皿，使已被切伤的无菌苗茎端浸泡在菌液中，抽真空(O. 05MPa)感染7 IOmin。浸染后的茎尖用无菌滤纸吸干，将小苗插入小麦萌发培养基(MS培养基无机盐成分，N族维生素(李世润等，1990)，蔗糖30g/L,琼脂7g/L，pH 5. 8-6. O)上黑暗中共培养3 天。培养温度为22-24°C。3天后将共培养后的无菌苗移栽到上层蛭石下层土壤的花盆中， 并用松散湿润的蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温22-28°C，夜温 15-21°C。隔天浇灌1/2MS培养基的无机盐溶液。移栽到蛭石中的转化植株长到三叶期时，均匀喷洒合适浓度的除草剂水溶液进行筛选。喷洒以植株叶片掉液滴为宜。喷洒后植株放在温室生长，白天温度15_20°C，夜间温度10°C左右，日光照12h左右，每3天浇水I次。返青期取叶片DNA进行PCR检测。以epsps基因为筛选标记基因的转化植株喷洒O. 12% Roundup水溶液，即每升自来水中加入I. 2ml “Roundup”(41%草甘膦异丙胺盐)。喷洒后15天左右未转基因对照植株开始死亡，25天后对照植株死亡率在90%左右。转化植株在喷洒除草剂水溶液后，一些个体变化同对照植株相似，另一些个体则持续生长，变化不明显。存活植株长到4-5叶期时移栽到田间。抗除草剂筛选的转化植株(TO)自交产生Tl代种子，后者在花盆中萌发，小苗长到 3-4叶期时喷洒除草剂水溶液，除草剂浓度和植株生长条件同TO代。存活植株长出3片新叶后取材进行分子检测。PCR检测阳性植株部分移栽入花盆，每株一盆；部分移栽到大田， 按照常规管理方法进行管理，自然越冬，返青后取叶片DNA进行分子检测。单株隔离自交授粉得T2代种子。部分T2代种子在大田播种，小苗自然越冬，返青后取新叶进行PCR检测、 Southern杂交和半定量RT-PCR验证。转基因纯合株系的种子用于耐盐、耐旱生理性测定。转基因植株的抗逆性检测本发明以转基因小麦的耐盐检测及利用为例简述转基因植株的抗逆性检测及利用的一般程序及方法。以非转基因植株为对照，选择来自不同独立转化体的转基因纯合株系进行抗逆性测定。在种子萌发试验中，将种子晒干后种于大小一致的砂盆中，分别浇灌含不同浓度 NaCl(0、100mM、200mM、300mM)的水溶液，各株系每浓度种300粒种子。浇灌量各盆之间保持一致，每天观察种子出苗状况和小苗的整齐度，并避免雨淋。20天后统计种子最终出苗率，胚芽鞘露出覆盖的沙子即认为出芽。根据种子出芽率的测定，选择合适浓度NaCl溶液作为盐胁迫处理期间的盐浓度。 分别选取来自不同独立转化体的转基因纯合株系和非转基因对照进行耐盐生理学测定。将各株系种子播种于大小一致的砂盆中(直径10cm，高15cm)，每盆种20粒，每个株系种8 盆，每天烧灌Hoagland营养液,植株长到3叶期时定苗,各盆中留下大小长势一致的小苗15 株。植株长到5叶期时，将沙盆按每个株系随机分成两组。其中一组开始浇灌含有NaCl的 Hoagland营养液,连续烧灌10天,另一组继续烧灌Hoagland营养液作为未处理对照组。盐胁迫处理过程中，测定处理植株和未处理植株的甘氨酸甜菜碱含量及其它生理指标包括光合作用指标、离子含量、RWC、叶绿素含量、细胞溶质势、可溶性糖和脯氨酸含量、细胞膜离子渗漏、丙二醒含量和生物量。在盐碱地种植转基因纯合的小麦株系进行耐盐性分析，研究转基因能否提高小麦全生育期耐盐性以及耐盐性提高的机制。冬小麦对盐胁迫的敏感期分别是出苗及小苗阶段和早春返青期，耐盐性强弱最终表现在盐碱地中的经济产量。测定结果表明，转基因株系的种子在盐胁迫条件下萌发率显著高于野生型，小苗生长较好。其中部分株系在200mM NaCl浓度处理下萌发率为95%左右，约为野生型的I. 5 倍，小苗受害较轻。对5叶期小苗进行盐胁迫处理，NaCl浓度以每天50mM递增至终浓度 200mM，然后每天浇灌一次，盐浓度不变。盐胁迫处理后，转基因植株长势明显优于对照植株的，处理半月后部分转基因植株的地上部分生物量比对照植株高30%以上，根生物量也比对照植株高30%左右。测定盐胁迫条件下不同株系小苗的生理参数的变化，得出无论转基因植株还是对照植株，叶片和根中的Na+含量都明显升高，K+含量先略有升高而后降低。与对照植株相比， 转基因植株Na+增加量少，K+降低幅度小，部分株系的Na+、K+含量与对照相比均差异显著， 并且K+/Na+比值也显著高于对照植株的。在盐胁迫条件下，所有株系的叶绿素含量均是先有小幅度升高然后以不同速率下降，但转基因植株的叶绿素含量在处理期后期显著高于对照植株的。光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度以及PS II光化学效率的测定结果显示，在较长时间NaCl胁迫处理下，光合速率大幅度降低是由于气孔导度降低和PS II复合体活性受抑共同造成的。但在盐胁迫处理中，转基因植株表现出明显较高的光合速率、气孔导度和最大光化学效率(Fv/Fm)，即在盐胁迫处理中能合成较多的碳水化合物。盐胁迫条件下，叶细胞溶质势随着胁迫时间的增加而逐渐降低，但部分转基因株系的溶质势显著低于对照植株的，即具有更强的保水和吸收水分的能力。与对照植株相比， 转基因植株叶片含有较多的可溶性糖和脯氨酸。这些结果表明，在盐胁迫条件下转基因株系细胞内积累了较多的可溶性物质(包括Na+和脯氨酸及可溶性糖等)，使细胞维持较低的溶质势，有利于细胞正常代谢和光合作用以及植株的生长。在盐胁迫条件下，转基因植株表现出较低的MDA水平和离子渗漏率，表明细胞膜受损程度小于对照植株的，这与转基因植株中积累较高的甘氨酸甜菜碱水平呈显著的负相关，与转基因植株有较高的PS II活性相一致。表明甘氨酸甜菜碱在转基因植株中的过量积累对细胞膜的稳定性和生物大分子功能产生了有益的保护作用。在滨海盐碱地种植的转基因株系和对照品种的试验结果显示，一些转基因株系在盐碱地中的存活和生长发育明显优于对照品种的，经济性状如单株分蘖数、旗叶面积、单株产量等显著优于对照品种的，表现出显著提高的耐盐性。即转甘氨酸肌氨酸N-甲基转移酶基因(ApGSMT2)和二甲基甘氨酸N-甲基转移酶基因(ApDMT2)小麦有显著提高的耐盐性。本发明的有益效果本发明公开了一种蓝细菌甘氨酸甜菜碱合成途径中的甘氨酸肌氨酸N-甲基转移酶基因(ApGSMT2)和二甲基甘氨酸N-甲基转移酶基因(ApDMT2)序列及推测的编码蛋白质序列。这两个基因来源于嗜盐隐杆藻(Aphanothece halophytica),在与高等植物组成型启动子(花椰菜花叶病毒(CAMV) 35SRNA基因启动子、玉米Ubiquitin基因启动子)融合后， 共同转入玉米、小麦、棉花、烟草等作物中，显著提高了植株的抗逆(旱、盐、冷、高温)性，表明这两个基因在作物抗逆育种中有很好的应用价值。本发明以克隆的ApGSMT2和ApDMT2基因为基础，根据作物抗逆育种的需要，对基因序列进行了修饰，(I)以禾谷类植物及玉米偏爱的密码子替换在高等植物中使用频率低的密码子，合成了 ApGSMT2d和ApDMT2d基因；(2)将蛋白质在叶绿体定位序列的编码区与 ApGSMT2 和 ApDMT2 基因、ApGSMT2d 和 ApDMT2d 基因分别融合，产生 ApTpGSMT2 和 ApTpDMT2 基因、ApTpGSMT2d和ApTpDMT2d基因，实现了转基因表达产物在叶绿体内的定位；(3)将蛋白质在线粒体基质定位序列的编码区与ApGSMT2和ApDMT2基因、ApGSMT2d和ApDMT2d基因分别融合，产生 ApTpGSMT2m 和 ApTpDMT2m 基因、ApTpGSMT2dm 和 ApTpDMT2dm 基因，实现了转基因表达产物在线粒体内的定位；(4)通过多基因转化载体的应用和转基因聚合方法的应用，获得了转基因表达产物在细胞内不同区域的定位以及甘氨酸甜菜碱在胁迫诱导条件下的局部高浓度积累。这样，可根据需要重组出多样的转基因抗逆育种新材料或新品种。


图I、质粒 pCUA-APGSMT2-ApDMT2-印sp 的 T-DNA 区图谱P35S promoter,花椰菜花叶病毒35S启动子；PUbi,玉米泛素ubiquintin基因启动子；epsp,筛选标记基因；RB与LB, Ti质粒的T-DNA左、右边界；Tnos, nos终止子。
具体实施例方式实施例I :ApGSMT2/ApDMT2基因克隆和玉米转基因抗逆材料的创造l)ApGSMT2/ApDMT2 基因克隆培养嗜盐隐杆藻(Aphanothecehalophytica)至 0D600 = I. 2,取 30ml 菌液装入50ml离心管中，离心收集菌体。用STE (0. IMNaCl，IOmMTris-HCl (pH 8. 0)， ImMEDTA(pH8. O))液重悬菌体，离心收集，重复I次。再加入20ml 2XCTAB(IOOmmoI/L Tris-HCl ρΗ8· 0，I. 4mol/LNaCl，20mmol/LEDTApH 8. 0,2% CTAB)缓冲液，混匀，65°C水浴中温育90min (预热前加入1% β -巯基乙醇)，中间摇匀2_3次。然后将离心管从水浴锅中取出，冷却至室温后加入等体积氯仿/异戊醇(24 I)，轻轻颠倒离心管几次，室温下 IOOOOrpm离心IOmin。再将上清转入新的50ml离心管中，用0. 8倍体积异丙醇沉淀。沉淀转入70%乙醇中洗涤2次，然后晾干，用2ml TER(2ml ΤΕ+2 μ I RNaseA(10mg/ml))在37°C溶解。然后加入2倍体积冷的无水乙醇。轻轻混匀静置一会儿后用枪头勾出DNA，用70% 乙醇冲洗2次后，真空干燥。依所提DNA量加入100-500ul的TE溶解DNA。设计简并引物GSMT-F 5，ATGGC (T/C/A/G) AA (A/G) AA (A/G) GT (T/C/A/G) GA 3’ 和 GSMT-R 5， (C/T)TA(G/A)TC(C/T)TT(C/T)TT(C/T/G/A)GC ；DMT-F 5’ ATGAC(T/C/A/G) AA (A/G)GC(T/C/A/G)GA(T/C)GC 3 ’ 和 DMT-R 5，(C/T)TA (T/C/A/G)GG(C/T)TT(G/A)TG(G/A) AA 3’。以所提DNA为模板，分别用简并引物GSMT-F和GSMT-R，DMT-F和DMT-R，扩增得到 DNA片段。反应程序为95°C预变性5min ;95°C变性lmin，45°C退火lmin，72°C延伸30s，循环 35次；72°C延伸7min。采用Takara回收Kit回收PCR扩增出的DNA片段，选用pGEM-T Easy Vector Systems Kit (Promega7USA)对PCR片段进行克隆,测序公司测序。获得了长度分别为798bp和834bp的核苷酸序列，各自编码一个0RF。基于已报道的其他种生物的 GSMT和DMT序列，命名所克隆基因为ApGSMT2、ApDMT2基因。2)植物表达载体的构建采用常规的DNA重组技术，以含有CaMV 35S启动子、多克隆位点和植物抗除草剂基因 EPSPs (5_enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase gene)的植物表达载体 pCPE为受体，在T-DNA区插入ApGSMT2和ApDMT2基因(均由CaMV 35S启动子启动)，产生质粒pCPE-ApGSMT2-ApDMT2。将该质粒采用冻融法转入根癌农杆菌LBA4404或AGLO等，用于玉米转基因。3)转基因受体系统的建立以我国农业生产上所用的骨干自交系为材料，如郑58、掖478、掖515等的自交系种子。离体培养诱导茎尖产生丛生芽块，以丛生芽块为受体进行遗传转化。所用培养基有种子萌发培养基KN031 900mg/l, NH4NO3 1650mg/l, CaCl2 · 2H20 440mg/l, MgSO4 · 7H20 370mg/l, KH2PO4 · H2O 170mg/l, FeSO4 · 7H20 27. 8mg/l, ZnSO4 · 7H20 10mg/l, MnSO4 · 4H20 22. 3mg/l, H3BO3 10mg/l, KI 0. 83mg/l, Na2MoO4 · 2H20 0. 5mg/l, CuSO4 · 5H20
0.025mg/l, CoCl2 · 6H20 0. 025mg/l,盐酸硫胺素 10. Omg/1,盐酸吡哆醇 1.0mg/l,烟酸
1.Omg/1,甘氨酸2. Omg/1,肌醇100. Omg/1,生物素0. 05mg/l,酪蛋白水解物500mg/l,鹿糖 30g/l，琼脂粉7g/l，pH 5. 8-6. O。用于种子萌发。液体培养基则去掉琼脂粉。A培养基种子萌发培养基附加 6-BA 4. 5-9. O μ mol/1 和 2，4-D I. 0-3. O μ mol/1, 用于诱导离体培养芽尖产生丛生芽组织块和丛生芽组织块继代培养。B培养基种子萌发培养基附加6-BA4. 5 μ mol/1和IBA (吲哚丁酸)I. 8 μ mol/1， 用于丛生芽组织块分化小苗。成苗培养基种子萌发培养基附加6-BA2. 25 μ mol/1和IBA3. 6 μ mol/1，用于丛生小芽发育成小苗。生根培养基种子萌发培养基附加IBA2. 8 3. 6μπι01/1，用于无根小苗生根。基本培养基及植物生长调节物质热压灭菌；抗生素和除草剂等活性成分过滤灭菌，在培养基灭菌后加入。种子灭菌和萌发玉米种子用70%乙醇浸泡10分钟，再用O. I %氯化萊浸泡 10-15分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量 (30-40毫升/250毫升三角瓶)无菌水，封口后放在黑暗条件(23-30°C )下1—2天。萌动 (露白)后种子放在基本培养基上于黑暗条件下继续萌发。
茎尖培养和丛生芽组织块诱导、继代、分化萌发种子的胚芽伸长至3-5厘米时， 剥离胚芽鞘及幼叶，切取长约5毫米左右的上胚轴及茎尖，接种到A培养基上于黑暗下 (24-270C )培养，并及时切去伸长的胚轴和剥去幼叶。培养6-10天后，茎尖开始不规则膨大生长，在膨大的分生组织上出现数个瘤状或指状突起。20天后，在瘤状或指状突起的表面开始形成不定芽及胚状体。一般每4周继代培养一次。在继代培养中，若丛生芽组织块丛生小芽偏多2，4-D浓度取3. O μ mol/1 ;若丛生芽组织块愈伤组织化较重，虽有大量的分生细胞团，但表面很少出现不定芽，可将2，4-D浓度降为Ι.ΟμπιοΙ/1，继续培养则重新产生大量瘤状或指状突起。A培养基上的丛生芽组织块，少数有不定根的产生。与幼叶存在一样， 不定根也影响组织块的膨大生长及胚状体和丛生小芽的产生，需要及早去掉。丛生芽组织块在转移到B培养基上2-3天后，色泽逐渐变黄，质地较柔韧，5-6天后表面出现微小突起。 扫描电镜下观察可见各期胚状体及不定芽。胚状体及不定芽迅速发育，在组织块表面形成丛生小芽。4)以丛生芽组织块为受体的转化和植株再生将带有目的基因的根癌农杆菌(如AGLO和LBA4404)在附加抗生素的LB培养基 (每升培养基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g, pH 7.0，高压灭菌)中28°C 下震荡培养，震荡速率为110rpm(转/分)，使细菌处于对数生长期。然后在3000rpm下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2浓度的液体种子萌发培养基(即种子萌发培养基成分减半，去掉琼脂粉)洗漆，再离心收集。再将菌体用添加乙酰丁香酮(acetosyringone, As) 100 μ mol/1的1/2浓度的液体丛生芽诱导培养基悬浮，稀释5_10倍用于转化。取继代后培养13-20天的丛生芽组织块为转基因受体。用农杆菌介导法进行转化，转化后材料在暗中进行恢复培养。农杆菌感染的丛生小芽或丛生芽组织块在加有头孢霉素(Cefotaxime) 250mg/l或羧苄青霉素(Carb) 500mg/L的培养基上于黑暗中培养7-12 天，抑制细菌生长。恢复培养后或抑菌培养后的丛生小芽或丛生芽组织块在加有选择剂的培养基上连续筛选3-4代，获得转基因细胞及小芽。在筛选培养中绝大数丛生芽组织块逐渐死亡。将存活的组织块转移到无选择剂的去掉2，4-D的A培养基上恢复培养后产生小芽。将小芽放在成苗培养基上照光下生长，光强2000-30001x，光照14_15小时/天。 小苗长到3-4片叶时转入生根培养基中生根。培养15天左右，约40%的小苗产生新根。对于未生根苗，切伤其基部，转移到新的生根培养基上培养，10天后大多数植株产生根系。生根苗洗去培养基后，移栽到以蛭石为栽培介质的花盆中生长。植株在自然光照下生长，日温 22-28°C，夜温15-21°C，隔天浇灌1/2浓度的种子萌发培养基的无机盐成分。生长2周左右，移植苗产生发达根系，然后定植于田间。5)转基因植株的抗性检测和选择利用取移栽成活植株的叶片进行分子生物学检测确定转基因植株。将转基因植株套袋自交结实。取种子播种在砂盆中，用O. 7% NaCl水溶液进行连续浇灌30天，将存活小苗移栽到大田，待植株长大后套袋自交结实。对其下一代继续进行分子生物学鉴定和甘氨酸甜菜碱含量测定，择优套袋自交留种。对转基因纯合株系分别进行耐盐、耐旱性检测，并套袋自交繁种，获得抗逆性比未转基因自交系显著提高的转基因自交系。后者可用于配制玉米耐盐耐旱杂交种。
6)转基因玉米的耐盐、耐旱性检测及利用将转ApGSMT2d/ApDMT2d基因的纯合玉米植株套袋自交，种子播种在砂盆中，浇灌 O. 8% NaCl水溶液，并以未转基因自交系种子为对照。转基因植株的不同株系在盐水浇灌下表现出不同的耐盐性，多数转基因的株系表现出比对照明显提高的耐盐性，半数以上株系的5叶期成活率在70%以上，而对照自交系种子很少出苗，出苗后也逐渐死亡，5叶期的成活率不到10%。实时定量RT-PCR检测表明转基因表达强度高，在未转基因植株中无检测信号。挑选出耐盐性优异的转基因植株套袋自交纯合，并进行配合力测定，选择配合力与供体自交系相同或有提高的转基因自交系用于耐盐玉米杂交种选育。将转ApGSMT2/ApDMT2基因的纯合玉米植株的种子和未转基因的对照自交系的种子播在的花盆中，分别在苗期(3-7叶期)、雌雄穗发育期(9-13叶期)、开花授粉期进行干旱胁迫处理，检测干旱处理对玉米生长发育的影响、细胞膜受损程度、单株产量及其它经济性状和生理指标的差异等。综合多方面的测试结果，转基因的玉米比对照植株表现出明显提高的耐旱性。选出耐旱性优异的转基因植株套袋自交纯合，并进行配合力测定，选择配合力与供体自交系相同或有提高的转基因自交系用于玉米单交种选育。实施例2 :ApGSMT2d、ApDMT2d基因的合成和玉米转基因抗逆材料的创造l)ApGSMT2d、ApDMT2d基因的合成和植物表达结构的构建选用禾谷类植物及玉米的偏爱密码子取代部分ApGSMT2和ApDMT2的密码子，人工合成ApGSMT2d和ApDMT2d基因。然后与RD29启动子连接构建融合基因，将后者重组到植物表达载体PCPE中，产生pCPE-ApGSMT2d-ApDMT2d。将重组质粒导入根癌农杆菌中用于遗传转化。2)玉米无菌苗的获得套袋获取玉米骨干自交系如郑58、齐319、昌7_2等种子，用70%乙醇浸泡10分钟，再用O. I %氯化汞浸泡10-12分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌期间不断晃动种子， 以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水(30-40毫升水/250毫升三角瓶)，封口后放在黑暗条件(23-30°C )下1-2天。待种子萌动(露白) 后，将其放在改良MS培养基上，在黑暗条件下继续萌发。待胚芽伸长至3-5厘米时，剥离胚芽鞘及2-3片幼叶，露出茎尖顶端生长锥。3)农杆菌培养及活化将带有双元载体(Mini-Ti质粒即为pCPE-ApGSMT2d-ApDMT2d，该质粒带有除草剂草甘膦抗性基因epsps)的根癌农杆菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的YEP培养基中 28°C震荡培养，震荡速率为110r/min，使细菌处于对数生长期。然后在3000r/min下离心10 分钟，弃上清液。菌体用1/2改良MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加IOOmg/ L乙酰丁香酮的1/2MS改良液体培养基悬浮，稀释5-10倍用于转化。4)玉米无菌苗转化。A.把菌液倒在4. 5厘米直径的培养皿中，倾斜培养皿，将露出茎尖生长锥的无菌苗顶端浸泡在菌液中2-5分钟(AGL15分钟，LBA44049分钟)。B.浸染后的芽尖用无菌滤纸吸干，将根部插入改良MS培养基中于黑暗中培养2-3 天，培养温度为22-24°C，然后将无菌苗放在散射光下培养2天。C.将照光培养后的无菌苗移栽到铺有上层蛭石和下层壤土的花盆中，蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温22-28°C，夜温18-23°C，隔天浇灌1/2改良MS
培养基无机盐。5)转化植株筛选与定植转化植株长出3片叶后，喷洒草甘膦水溶液，以未转化植株为对照。喷洒量以植株不掉液滴为宜。对照植株在喷洒后3天停止生长，15天左右开始死亡。转化处理后的植株， 一些个体的变化与对照植株相似，另一些个体则持续生长，无明显变化。存活植株长到5叶期，将其定植到田间。6)转基因植株的鉴定、管理和后代分析抗除草剂植株生长到7-8叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因，对 PCR阳性植株进行Southern blotting验证和RT-PCR检测。转基因植株开花后套袋自交或姊妹交结实。种子播种在大田或温室，植株长到4-6叶期时取叶片提取DNA，采用PCR技术检测是否带有外源基因，对PCR阳性植株进行Southern blotting检测和RT-PCR检测，从中选出转基因植株。同时对转基因植株进行套袋自交留种，分析下一代中转基因个体的比例，选出转基因纯合系。7)转基因植株的抗逆性测定选转基因纯合株系用于测定，以非转基因自交系为对照。转基因植株种子和对照种子同期播种，分别播种于大小一致、土量相等的花盆中，使植株处于适宜生长季节。植株生长环境和管理方法一致。种于花盆的玉米植株长至10叶期后，控制每天浇水量(约 600ml)，使土壤中相对含水量保持在15-16%左右，白天9_16时期间植株叶片萎蔫，夜晚叶片恢复伸展，持续处理2周，然后恢复正常浇水。恢复正常浇水一周后植株抽雄。再将花盆分开放置，以使植株自交结实。收获成熟果穗和茎叶，烘干后测定生物量和籽粒产量。将植株控制浇水第2天(叶片在上午9时左右开始萎蔫)记为干旱胁迫处理第O天，分别在处理的第0、1、5、10、14天和恢复正常浇水后第7天取材，采用常规的植物生理学方法测定与抗逆相关的各项生理指标。并对雌雄穗发育情况、植株高度、籽粒重、花粉活力等进行观测。 将部分10叶期植株停止浇水，观察连续干旱对植株生长发育和存活率的影响。在整个试验过程中，植株处于自然光照和温度下生长，控水处理期间避免植株受到雨淋。在正常生长条件下，转基因植株和对照植株的生长发育和形态特征无显著差异。 经干旱胁迫处理后，转基因植株和对照植株在株高、雄穗分枝数、开花散粉时间、散粉-吐丝间隔时间、花粉活力、果穗长度、百粒重等性状均出现明显差异。未转基因植株雄穗分枝数少、雄蕊发育不良、花粉败育、散粉-吐丝间隔时间长、单株籽粒产量低，而转基因植株表现出明显提高的耐旱性，花粉发育正常，单株籽粒产量明显高于对照的。即转基因植株在干旱处理过程中生长发育较正常，具有明显增强的耐旱性。测定叶片相对含水量，可溶性总糖含量，离子渗漏率，丙二醛含量，脯氨酸含量等生理指标，表明在干旱胁迫下转基因植株叶片相对含水量比对照植株降低的慢，保水能力较强；离子渗漏率和丙二醛含量表明转基因植株叶片细胞膜损伤较小，可溶性糖及脯氨酸含量明显高于对照植株的，说明转基因植株在干旱胁迫下可能是通过积累较多的渗透保护性物质来维持正常代谢。对苗期玉米浇灌O. 8%的盐水，转基因植株的耐盐性明显高于未转基因对照植株。 测定苗期植株在盐处理条件下地上部分及地下部分鲜重、干重等发现，转基因植株生长发育正常，未出现生长迟缓、植株矮化等情况。
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本实施例创造出了耐旱耐盐性显著提高的转基因玉米材料。实施例3、ApTpGSMT2d、ApTpDMTd2基因的构建和玉米转基因抗逆材料的创造l)ApTpGSMT2d、ApTpDMTd2基因的合成和植物表达结构的构建为了使ApGSMT2和ApDMT2在玉米细胞内高效表达，并实现甘氨酸甜菜碱在叶绿体 (质体)内的积累，将ApGSMT2d和ApDMT2d基因分别与定位叶绿体蛋白的导肽(transit peptide)编码区融合，使ApGSMT2和ApDMT2蛋白在合成后定位于叶绿体(质体)中，催化在叶绿体内合成大量的甘氨酸甜菜碱。依据已报道的拟南芥RUBISC0小亚基基因序列设计PCR引物，从拟南芥中克隆出RUBISC0小亚基的导肽编码区，测序验证后分别连接到ApGSMT2d基因和ApDMT2d基因开放读码框的5'端，产生融合基因，即ApTpGSMT2d和 ApTpDMT2d基因。然后用构建的融合基因分别取代质粒pCUA-ApGSMT2d-ApDMT2d-印sps中的 ApGSMT2d 和 ApDMT2d，产生植物遗传转化结构 pCUA-ApTpGSMT2d_ApTpDMT2d-印sps。采用冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌中用于玉米遗传转化。2)玉米转基因植株的产生和转基因纯合株系的抗逆性测定同实施例2，获得了抗旱耐盐性显著提高的转基因玉米材料。实施例4、ApTpGSMT2dm、ApTpDMT2dm基因的构建和玉米转基因抗逆材料的创造l)ApTpGSMT2dm、ApTpDMTd2m基因的合成和植物表达结构的构建本实验室工作发现，在玉米遭受严重干旱或盐胁迫时，线粒体功能大幅度降低， 提高线粒体在细胞遭受胁迫时的工作效率，有利于提高玉米的抗逆性。为了使ApGSMT2 和ApDMT2在玉米细胞内高效表达，并实现甘氨酸甜菜碱在线粒体内的区域化积累，将 ApGSMT2d和ApDMT2d基因分别与定位线粒体蛋白的导肽(transit peptide)编码区融合, 使ApGSMT2和ApDMT2蛋白合成后定位于线粒体中，在线粒体内积累较多的甘氨酸甜菜碱。 依据已报道序列设计PCR引物，从玉米幼叶中克隆出柠檬酸合成酶基因的导肽编码序列， 测序验证后分别连接到ApGSMT2d基因和ApDMT2d基因开放读码框的5’端，产生融合基因， 即ApTpGSMT2dm和ApTpDMT2dm基因。然后将构建的融合基因重组到带有胁迫诱导型启动子RD29的DATEWAY入门载体中，由RD29分别启动其表达。再通过定点重组将融合基因重组到DATEWAY植物表达载体中，产生质粒pZH-ApTpGSMT2dm-ApTpDMT2dm-epsps。采用冻融法将该质粒导入根癌农杆菌中用于玉米遗传转化。2)玉米转基因植株的产生和转基因纯合株系的抗逆性测定同实施例2，获得了抗旱耐盐性显著提高的转基因玉米材料，但材料抗性提高幅度小于实施例2和实施例3产生的转基因纯合株系。实施例5、ApGSMT2d/ApDMT2d和ApTpGSMT2/ApTpDMT2共同导入创造玉米抗逆育种新材料为了使ApGSMT2和ApDMT2在玉米细胞内高效表达，实现甘氨酸甜菜碱既在叶绿体 (质体)中又在细胞质中的积累，同时避免转基因沉默发生的机率，并预防甘氨酸甜菜碱细胞质中过高浓度的积累引起植株生长变慢，因此，一方面将ApGSMT2和ApDMT2基因分别与定位叶绿体蛋白的导肽(transit peptide)编码区融合,促使合成的ApGSMT2和ApDMT2蛋白定位于叶绿体(质体)中，在叶绿体内积累大量甘氨酸甜菜碱；另一方面将ApGSMT2d和 ApDMT2d基因分别与胁迫诱导型启动子融合，实现在胁迫条件下转基因产物在胞质中大量积累。
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l)ApTpGSMT2、ApTpDMT2基因的合成和植物表达结构的构建利用已克隆的拟南芥中RUBISC0小亚基基因的导肽编码区，分别连接到ApGSMT2 基因和ApDMT2基因(不用ApGSMT2d和ApDMT2d序列，减少转基因沉默事件发生)开放读码框的5’端，产生融合基因，即ApTpGSMT2和ApTpDMT2基因。采用常规的分子生物学技术，将ApTpGSMT2d和ApTpDMT2d基因、ApGSMT2d和 ApDMT2d分别重组到GATEWAY入门载体中，分别与不同的植物启动子和基因3 ’尾巴区融合， 形成适合在禾谷类作物中表达的融合基因，其中ApGSMT2d和ApDMT2d基因分别与胁迫诱导的启动子RD29连接，ApTpGSMT2和ApTpDMT2分别与组成型启动子Ubiquitin相连。然后通过定点重组导入以GATEWAY植物表达载体为基础的多基因转化载体中，产生质粒pZH-Ap GSMT2d-ApDMT2d-ApTpGSMT2-ApTpDMT2-epsps。采用冻融法将多基因转化载体导入根癌农杆菌中用于玉米等作物遗传转化。2)玉米转基因植株的产生和转基因纯合株系的抗逆性测定同实施例2，获得了抗旱耐盐性显著提高的转基因玉米材料，后者的抗逆性显著优于实施例2和实施例3产生的材料。实施例6、转ApTpGSMT2、ApTpDMT2基因创造棉花抗逆育种新材料I)植物表达结构和农杆菌培养植物表达载体的构建和农杆菌培养及活化同实施例I。农杆菌菌株为LBA4404。2)棉花无菌苗获得取棉花优良品种或恢复系的种子，用浓硫酸脱去表面绒毛，70%乙醇浸泡I分钟， 再用O. I %氯化汞浸泡10-12分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水(30-40毫升水/250毫升三角瓶)，封口后放在黑暗条件(23-30°C)下1-2天。待种子萌动(露白)后， 将其放在铵盐减半的改良MS培养基上于黑暗条件下萌发。待胚轴伸长至3-5厘米时，剥去一片子叶，露出茎端生长锥。3)棉花无菌苗转化(I)将农杆菌菌液浸涂在解刨针刺伤的茎尖生长锥上，并在其上覆盖用农杆菌液浸湿的棉球，然后在暗中培养2-3天,培养温度为24-26°C。再将无菌苗放在散射光下培养 2天。(2)将照光培养后的无菌苗移栽到上层蛭石下层壤土的花盆中，让植株在自然光照下生长，日温22-28°C，夜温18-23°C，隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐。4)转化植株筛选与定植转化植株长出3片叶后，喷洒除草剂草甘膦(浓度因品种而异)水溶液，以植株不掉液滴为宜。未转化的对照植株在喷洒后3天停止生长，12天左右开始死亡。转化植株在喷洒后，一些个体变化同对照植株相似，另一些个体表现很强的抗性，持续生长。存活植株长到5叶期时，将其定植到田间。5)抗除草剂植株的分子生物学鉴定抗除草剂植株长到7-8叶时，从第3-4片叶上取样，混合后提取DNA，采用PCR技术检测外源基因。收获PCR阳性植株的种子(自交)，种植后在3-4叶期时喷洒除草剂草甘膦筛选，存活植株取叶片提取DNA进行PCR检测，阳性植株进行Southern blotting验证和RT-PCR检测。转基因植株自交结桃，收获种子继续种植。T2代植株仍在3-4叶期时喷洒除草剂草甘膦，统计存活植株和死亡植株比例，结合上代Southern blotting结果,确定转基因能否稳定遗传，并从中选出目标基因表达强度高的转基因纯合株系。然后进一步采用实时定量RT-PCR技术和甘氨酸甜菜碱含量测定技术分析不同转基因中转基因表达强度和甘氨酸甜菜碱含量，选择适宜株系进行抗性分析试验。6)转基因植株的抗性鉴定和利用取纯合的转基因植株的种子，播种在花盆中，植株2叶期时进行低温处理，通过存活率统计和生理指标测定，筛选出耐冷株系，用于生产。将转基因株系的种子播在砂盆中，用O. 7% NaCl水溶液进行连续浇灌30天，将存活小苗移栽到大田，待植株长大后套袋自交结实。对其下一代继续进行分子生物学鉴定和耐盐性检测，并套袋自交纯合，获得了耐盐品种。将转基因株系的植株分别在苗期(5叶期)、蕾期和开花期进行干旱胁迫试验，测定相关的生理指标分析，确定植株耐旱性。5叶期棉花幼苗在含有12% PEG-6000的Hogland 营养液中处理，24小时后野生型植株的叶片失水严重，植株严重萎蔫，而转基因植株叶片较伸展，植株未发生萎蔫或程度较轻，转基因植株的叶片相对含水量显著高于野生型的，净光合速率、气孔导度和蒸腾速率都显著高于野生型的。渗透胁迫降低了棉花幼苗细胞的溶质势，其中转基因植株细胞的溶质势降低较多，生理学研究表明，在干旱胁迫条件下，细胞中积累了更多的溶质，增强了细胞吸取水分和持水能力，从而有利于植株保持正常形态和细胞膨压。棉花在花盆中生长至蕾期时，一次性浇足水后停止浇水，进行干旱胁迫处理。在蕾期干旱胁迫8天后，转基因植株的叶片甜菜碱含量显著高于野生型植株的，叶片失水速度明显比对照缓慢，叶片萎蔫晚，叶片细胞膜离子渗漏率和丙二醛含量显著低于野生型植株， 说明细胞膜损伤和膜脂过氧化程度都较轻。另外，转基因植株的叶绿素含量和过氧化物岐化酶(SOD)活性在干旱胁迫处理中也较高。干旱胁迫后转基因植株的分支数比野生型对照多15% _26%，单株开花数比野生型对照多10% _20%，单株籽棉产量下降幅度明显小比野生型对照。相关性分析得出，转基因棉花单株籽棉产量与甜菜碱水平呈显著正相关。这些结果表明，甜菜碱水平的增加能大大提高转基因棉花的耐旱性，转基因棉花抗旱性的提高不仅是由于胁迫条件下甜菜碱对细胞膜稳定性和完整性的保护作用，而且也要归功于甜菜碱的积累提高了转基因植株的渗透调节能力。实施例7、转ApTpGSMT2d、ApTpDMT2d基因创造小麦抗逆育种新材料I)植物表达结构和农杆菌培养植物表达结构同实施例3。农杆菌培养及活化同实施例I。农杆菌菌株为LBA4404。2)小麦无菌苗获得和转化小麦优良品种济麦20、济麦22等的种子，分别用70%乙醇浸泡1_3分钟，再用
O.I %氯化汞浸泡8-12分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水于黑暗条件 (20-250C )下1-2天。待种子萌动(露白)后，将其放在改良MS培养基上于黑暗条件下萌发。待胚芽伸长止3-4厘米时，用解剖刀剥去胚芽鞘及1-2片幼叶，暴露出芽尖，再用解剖刀从中部纵向切伤茎尖生长点。切伤茎尖生长点的无菌苗(萌发种子)用于农杆菌转化。 将菌液倒在4. 5厘米直径的培养皿中，倾斜培养皿，使露出茎尖生长锥的无菌苗浸泡在菌液中，在O. 5 X IO5Pa大气压下处理6-10分钟。浸染后的芽尖用无菌滤纸吸干，萌发种子放在附加200mg/l谷氨酰胺的改良MS培养基上于黑暗中培养2-3天，培养温度为22_24°C。 然后将无菌苗放在散射光下培养2天。将照光培养后的无菌苗移栽到铺有上层蛭石下层壤土的花盆中，并用蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温22-28°C，夜温 15-21 °C，隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐。3)转化植株筛选、定植和分子检测转化植株长出3片叶后，喷洒除草剂草甘膦水溶液，浓度为O. 12% Roundup (41% 草甘膦异丙胺盐)，以植株掉液滴为宜。未转化对照植株在喷洒后6天后停止生长，15天左右开始死亡。转化植株在喷洒后，一些个体变化同对照植株相似，另一些个体持续生长，变化不明显。待存活植株长到7-8叶时，将其定植到田间，并促进分蘖。抗除草剂植株经春化处理后，在起身一拔节期取叶片提取DNA，采用PCR技术检测转化植株。在获得的抗除草剂植株中，约20%左右为PCR阳性个体。后者自交结实，分穗收
-M-犾。4)转基因植株后代鉴定和分析通过春化阶段(低温处理条件因品种而异)的植株在长日照下起身、拔节、开花结实。转基因植株产生的种子，在浸水萌动后放冰箱(0_2°C )中进行春化处理30-65天。部分春化处理后的种子用O. 12% Roundup水溶液处理，观察统计抗性和敏感性个体比例，存活小苗播入花盆；另一部分春化处理后的种子播种在大田和砂盆，分别进行干旱胁迫处理和高盐胁迫处理，筛选耐旱和/或耐盐转基因植株。提取抗除草剂植株及耐盐和抗旱植株的叶片DNA，采用PCR技术检测外源基因。PCR阳性植株拔节后取上部叶片提取DNA进行 Southern blotting验证。转基因植株自交结籽,下代继续种植,继续在植株3_4叶期时喷洒除草剂草甘膦，统计存活植株和死亡植株的比例，结合上代Southern blotting结果,确定转基因能否稳定遗传，并从中选择转基因纯合系。结合实时定量RT-PCR和甘氨酸甜菜碱含量测定获得的结果，选择适宜株系进行抗逆性测定。获得转基因纯系后直接用于小麦育种或进入安全性中间试验和环境释放试验。5)转基因小麦的抗旱性分析出苗及苗期是小麦对缺水的敏感时期之一，此阶段干旱影响小麦出苗率和分蘖数，可对产量造成很大影响。将转基因株系和对照植株的种子分别在含O、10%、15%、20%、 25% (W/V)PEG-6000的MS无机盐溶液中萌发，统计萌发率、根长和芽长，发现在25% (W/V) PEG-6000渗透胁迫条件下，转基因株系的种子萌发比对照早，芽和根的长度也分别大于未转基因的，且差异达到显著性水平。对盆栽的小麦幼苗进行持续干旱处理，观测植株形态差异并测定地上和地下部分的生物量。转基因植株在干旱处理中生长较好，根系发达，生物量显著高于对照植株的。不同转基因株系的耐旱性有一定差异，耐旱性最好的转基因株系在胁迫处理25天时地上和地下部分的生物量分别比对照植株高60%和40%左右。干旱胁迫条件下，转基因株系的叶片相对含水量较高、较伸展，萎蔫程度低，叶绿素含量、净光合速率、气孔导度和蒸腾速率分别比对照显著高。干旱胁迫降低了小麦幼苗细胞的溶质势，提高了细胞可溶性糖和脯氨酸含量。其中转基因植株细胞的溶质势降低幅度较大，可溶性糖和脯氨酸的积累量显著高于野生型的。干旱胁迫条件下，转基因细胞中较多的可溶性物质积累有利于细胞吸水和维持正常的膨压。转基因株系叶片细胞离子渗漏率和MDA含量均显著低于对照植株的，说明转基因株系的细胞膜损伤和膜脂过氧化程度较轻。转基因植株的过氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(POD)活性在干旱胁迫处理中也高于对照植株的，表明转基因植株在干旱胁迫条件下有较强的抗过氧化能力。这些结果提示甘氨酸甜菜碱具有提高膜稳定性和稳定酶活性的作用。这些结果表明甘氨酸甜菜碱的过量积累在转基因小麦细胞的渗透调节和减轻自由基伤害中发挥了重要作用，提高了转基因植株抗旱能力。实施例8、共转化ApGSMT2d/ApDMT2d和ApTpGSMT2/ApTpDMT2基因创造大豆抗逆育种新材料I)植物表达结构和农杆菌培养植物表达载体、农杆菌培养及活化同实施例5。农杆菌菌株为LBA4404。2)大豆无菌苗获得和农杆菌培养及活化取优良品种的种子，用70%乙醇浸泡2-3分钟，用O. I %氯化汞浸泡10_12分钟， 然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水(50-60毫升水/250毫升三角瓶)，封口后放在黑暗条件(23-30°C )下2-3天。待种子萌动后，将其放在改良B5培养基上于黑暗条件下萌发。待胚轴长至3-5厘米时，剥去子叶并露出茎端生长锥。将带有目的基因表达结构的的根癌农杆菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的YEP 培养基中28°C下震荡培养，震荡速率为110r/min，使细菌处于对数生长期。然后3000r/min 下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2改良B5液体培养基(即改良B5培养基基本成分减半)洗涤，再离心收集。再将菌体用添加100mg/l乙酰丁香酮的1/2改良B5液体培养基悬浮，稀释5-10倍用于转化。3)大豆无菌苗转化(I)将菌液倒在4. 5厘米直径的培养皿中，倾斜培养皿，使露出茎尖生长锥的无菌苗顶端浸泡在菌液中3-6分钟。(2)浸染后的芽尖用无菌滤纸吸干，把小苗根端插入改良B5培养基上于黑暗中培养3-4天，培养温度为20-23°C。(3)将无菌苗移栽到铺有上层蛭石下层壤土的花盆中，顶部覆盖蛭石，长日照(16 小时/天)下生长，日温23-28°C，夜温20-25°C，隔天浇灌1/2改良B5培养基无机盐。4)转化植株筛选与定植转化植株长出3片叶后，喷洒O. 12% Roundup水溶液处理，以植株不掉液滴为宜， 未转化的对照植株在喷洒后6天停止生长，15天左右开始死亡。转化植株在喷洒后，一些个体的变化与对照植株相似，另一些个体持续生长，变化不明显。存活植株长到5叶期，将其定植到田间。抗除草剂植株生长到7-8叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因。PCR 阳性植株保留结实。5)转基因植株后代的分子生物学鉴定转基因植株产生的种子，播种在大田或温室。植株3-4叶期时取叶片提取DNA进行PCR检测转基因ApGSMT2d/ApDMT2d和ApTpGSMT2/ApTpDMT2。取PCR阳性植株叶片进行
22Southern blotting验证,转基因植株自交结实。子二代小苗(5叶期)喷洒O. 12% Roundup 水溶液后统计存活植株与死亡植株比例，对存活植株再进行PCR检测，确定外源基因在子代植株中的分离比例。对转基因纯合株系进行实时定量RT-PCR检测和甘氨酸甜菜碱含量测定，选择转基因表达强度高的株系用于检测抗逆性。6)转基因植株后代的抗逆性测定按常规的生理学方法和育种学方法进行。实施例9、通过转基因聚合的方法实现甘氨酸甜菜碱在细胞不同区域的分布创造高抗逆性材料I)转基因聚合产生玉米高抗逆性自交系将来自同一基因型(自交系)的分别转ApGSMT2d/ApDMT2d、ApTpGSMT2d/ ApTpDMTd2、ApTpGSMT2dm/ApTpDMT2dm基因的玉米植株杂交，分别产生带有ApGSMT2d/ ApDMT2d 和 ApTpGSMT2d/ApTpDMTd2 基因的植株、带有 ApGSMT2d/ApDMT2d 和 ApTpGSMT2dm/ ApTpDMT2dm 基因的植株、带有 ApTpGSMT2d/ApTpDMTd2 和 ApTpGSMT2dm/ApTpDMT2dm 基因的植株。然后对转基因聚合植株进行连续自交、选择，获得转基因纯合系。也可将不同转基因植株与转基因聚合植株进行再次杂交，通过自交和选择获得携带不同转基因的自交系，如携带 ApGSMT2d/ApDMT2d、ApTpGSMT2d/ApTpDMTd2、ApTpGSMT2dm/ApTpDMT2dm 基因的玉米自交系，实现细胞内不同重要功能区在逆境胁迫条件下都积累有较高水平的甘氨酸甜菜碱的目标。转基因玉米的杂交、自交和选择方法同玉米常规育种，但需要在转基因玉米隔离区进行。并且在转基因聚合植株的自交世代中，需采用PCR方法检测所有靶基因是否存在，只选留那些带有全部靶基因的个体。各个靶基因的PCR引物一条对应于基因的编码区，一条对应于启动子区域，具有良好的特异性。转基因聚合材料的抗逆性测定方法同实例2。2)转基因聚合小麦抗逆新材料产生将来自同一品种的分别转ApGSMT2d/ApDMT2d、ApTpGSMT2d/ApTpDMTd2、 ApTpGSMT2dm/ApTpDMT2dm基因的小麦植株杂交，分别产生携带转基因ApGSMT2d/ApDMT2d 和 ApTpGSMT2d/ApTpDMTd2 的植株、转基因 ApGSMT2d/ApDMT2d 和 ApTpGSMT2dm/ApTpDMT2dm 的植株、转基因ApTpGSMT2d/ApTpDMTd2和ApTpGSMT2dm、ApTpDMT2dm的植株。然后对转基因聚合植株进行连续自交、选择，获得转基因纯合系。也可将不同转基因植株与转基因聚合植株进行再次杂交、自交和选择，获得携带不同靶基因的转基因聚合株系。转基因小麦的杂交、自交和选择方法同小麦常规育种，但需要在转基因小麦隔离区进行。并且要采用PCR方法检测转基因聚合植株自交后代中靶基因是否都存在，只选留那些带有全部靶基因的个体自交纯合。转基因聚合材料的抗逆性测定方法同实施例7。3)转基因聚合产生棉花抗逆新材料将来自同一品种或恢复系的分别转ApGSMT2d/ApDMT2d、ApTpGSMT2d/ApTpDMTd2、 ApTpGSMT2dm/ApTpDMT2dm基因的棉花植株杂交，分别产生携带转基因ApGSMT2d/ ApDMT2d 和 ApTpGSMT2d/ApTpDMTd2 的植株、转基因 ApGSMT2d/ApDMT2d 和 ApTpGSMT2dm/ ApTpDMT2dm 的植株、转基因 ApTpGSMT2d/ApTpDMTd2 和 ApTpGSMT2dm/ApTpDMT2dm 的植株。 然后对转基因聚合植株进行连续自交、选择，获得转基因纯合系。也可将不同转基因植株与转基因聚合植株进行再次杂交、自交和选择，获得携带不同靶基因的转基因聚合株系。转基因棉花的杂交、自交和选择方法同棉花常规育种，但需要在转基因棉花隔离区进行，并且要采用PCR方法检测转基因聚合植株自交后代中靶基因是否存在，只选留那些带有全部靶基因的个体自交、选择。转基因聚合材料的抗逆性测定方法同实例6。4)转基因聚合大豆抗逆新材料产生将来自同一品种的分别转ApGSMT2d/ApDMT2d、ApTpGSMT2d/ApTpDMTd2、 ApTpGSMT2dm/ApTpDMT2dm基因的大豆植株杂交，分别产生携带转基因ApGSMT2d/ApDMT2d 和 ApTpGSMT2d/ApTpDMTd2 的植株、转基因 ApGSMT2d/ApDMT2d 和 ApTpGSMT2dm/ApTpDMT2dm 的植株、转基因ApTpGSMT2d/ApTpDMTd2和ApTpGSMT2dm/ApTpDMT2dm的植株。然后对转基因聚合植株进行连续自交、选择，获得转基因纯合系。也可将不同转基因植株与转基因聚合植株进行再次杂交、自交和选择，获得携带不同靶基因的转基因聚合株系。转基因大豆的杂交、自交和选择方法同大豆常规育种，但需要在转基因大豆隔离区进行，并且要采用PCR方法检测转基因聚合植株自交后代中靶基因是否存在，只选留那些带有全部靶基因的个体自交、选择。转基因聚合材料的抗逆性测定方法见常规的抗逆育种方法。实施例10、利用转ApGSMT2和ApDMT2及其派生基因的不同玉米自交系配制抗逆杂交种将具有优异杂种优势的分别转入ApGSMT2d/ApDMT2d、或ApTpGSMT2d/ApTpDMTd2、 或ApTpGSMT2dm/ApTpDMT2dm基因的不同玉米自交系杂交，产生分别携带父母本转基因的杂交种子。后者可直接用于生产，即是生产上具有竞争优势的转基因抗逆杂交种。也可以转ApGSMT2d/ApDMT2d和ApTpGSMT2/ApTpDMT2基因的自交系为杂交种的父本或母本，以转 ApTpGSMT2dm/ApTpDMT2dm基因的另一自交系为杂交种的母本或父本，从而实现杂种细胞内不同重要功能区在逆境胁迫条件下都可积累有较高浓度甘氨酸甜菜碱的目标。转基因玉米的杂种生产同玉米常规育种，但需要在转基因玉米隔离区进行。转基因杂交种的抗逆性测定方法参照实例2。
权利要求
1.一种蓝细菌甜菜碱合成途径中的甲基转移酶基因在植物抗逆中的应用，其特征是 所述基因为ApTpGSMT2m和ApTpDMT2m，是将ApGSMT2和ApDMT2分别与线粒体蛋白导肽编码序列融合，产生的转基因表达产物定位于线粒体基质的融合基因，其中ApTpGSMT2m产生的融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO. 16所示，ApTpDMT2m产生的融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO. 17所示；所述应用的方法是采用转基因技术将ApTpGSMT2d和ApTpDMT2d基因分别或组合导入植物细胞中产生转基因植株，利用转基因聚合和多基因转化方式获得转基因表达产物在细胞内不同区域分布和甘氨酸甜菜碱在胁迫诱导条件下局部积累的转基因株系， 从中选择出抗逆性高于未转基因对照的转基因植物新材料。
2.如权利要求I所述的应用，其特征是所述ApGSMT2和ApDMT2是指从蓝细菌 Aphanothece halophytica中克隆出的甘氨酸甜菜碱合成途径中的甘氨酸肌氨酸N-甲基转移酶基因ApGSMT2和二甲基甘氨酸N-甲基转移酶的基因ApDMT2，其中ApGSMT2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，ApDMT2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
3.如权利要求2所述的应用，其特征是所述禾谷类植物是玉米。
全文摘要
本发明公开了一种甜菜碱合成途径中的甲基转移酶基因及应用；其方法是从嗜盐隐杆藻克隆出甘氨酸肌氨酸N-甲基转移酶基因(ApGSMT2)和二甲基甘氨酸N-甲基转移酶基因(ApDMT2)，用高等植物偏爱的密码子取代ApGSMT2和ApDMT2中在高等植物中出现机率较低的密码子产生基因ApGSMT2d和ApDMT2d基因，采用蛋白质定位导肽序列与甲基转移酶基因融合的方法构建出编码产物分别定位于线粒体的系列基因。ApGSMT2以甘氨酸、肌氨酸为底物催化甘氨酸甲基化，ApDMT催化二甲基甘氨酸的甲基化，二者协同催化甘氨酸甜菜碱的合成。将ApGSMT2/ApDMT2或它们的修饰基因协同转入玉米、小麦、棉花、大豆和烟草等作物，细胞积累了高浓度的甘氨酸甜菜碱，显著提高植株的抗逆性。
文档编号C12N15/84GK102604989SQ20121010499
公开日2012年7月25日 申请日期2009年9月9日 优先权日2009年9月9日
发明者何影, 何春梅, 张举仁, 李坤朋 申请人:山东大学