专利名称：纯化方法
技术领域：
本发明涉及原纤维(fibril)的纯化方法，和基本上不含无定形聚集物及可溶性前体的淀粉样(amyloid)原纤维的制备。
背景技术：
淀粉样原纤维是具有高度组织性的蛋白样聚集物，与阿尔茨海默症或转移性海绵体脑病等病变有关。Tan等，Histopathology 1994，25，403-414。淀粉样原纤维做为一种新的、具有广泛潜在应用价值的纳米结构也正处于研究之中，Lashuel等，Phil Trans R Soc Lond 2001，256，133-46。
易于形成淀粉样原纤维的蛋白质可以从缺乏天然蛋白质的致密特征的至少部分折叠或不稳定状态形成淀粉样原纤维。可以形成淀粉样原纤维的蛋白数量稳定增长，说明淀粉样蛋白的形成是一种常见现象，是多肽链的一般特性。牛磷脂酰肌醇-3’-激酶α亚单位的SH3结构域(PI3-SH3)就是一种这样的模式蛋白质。对它的研究使人们对驱动淀粉样原纤维形成的过程及淀粉样原纤维中蛋白链的分子包装细节有了新的认识。PI3-SH3在低pH溶液中形成部分折叠状态，然后慢慢从该状态聚集形成原纤维，该原纤维具有与人类疾病相关的淀粉样原纤维不可区分的结构特征。
尽管淀粉样原纤维的结构鉴定方面已取得很大进展，许多问题仍待澄清。对淀粉样原纤维中蛋白链结构特征进行详细定义就是其中的一个问题。其主要困难在于许多淀粉样原纤维样品都存在内在异质性。除此之外，所有体外形成的样品几乎都含有可溶性前体和无定形聚集物。其结果是不能很明确地说明原纤维中蛋白质所采用的结构。因而，将淀粉样原纤维和其它物质相分离的技术的开发对于淀粉样原纤维的研究将极具价值。本文介绍一种从其它成分中纯化淀粉样原纤维的方法。这一方法使我们可以用FTIR法鉴定淀粉样原纤维中具PI3-SH3特征的二极结构组分，避免了可溶性前体和非纤维状聚集物的干扰。
图1.通过FTIR来监测不同PI3-SH3聚集物对胃蛋白酶消化作用的敏感性。37℃温度下，将主要包含无定形聚集物(pH1.5)或淀粉样原纤维(pH2.0)的样品与胃蛋白酶一起温育，其中胃蛋白酶与PI3-SH3重量比为1∶200。温育的不同时间，从两种样品中取出等分试样来记录FTIR光谱。在含有淀粉样原纤维(pH2.0)的样品中观察到聚集带向高波数位置移动，1684cm-1(单箭头)处的组分减少，而1640cm-1和1660cm-1(双箭头)之间的组分增加。
图2.纯化后PI3-SH3淀粉样原纤维的鉴定。(A)纯化前(灰色迹线)和纯化后(黑色迹线)的FTIR光谱。二阶导数光谱显示了各样品中的主要组分。(B)纯化前后淀粉样原纤维的曲线拟合。使用gaussian和lorentzian分量对波谱进行拟合。通过二阶导数分析寻找各组分。尽管通过二阶导数对消化样品进行分析时缺失了1612-1处的一个组分，但在拟合程序之前，人为限定这样一个成分，可以取得较好的拟合度。曲线拟合显示胃蛋白酶消化后1684cm-1和1612cm-1之间的组分显著减少。
图3所示为不同变性剂浓度下HEWL淀粉样原纤维中蛋白质的溶解程度。
发明概述本发明利用样品中原纤维与其它非原纤维性杂质之间稳定性的不同，特别是样品中可溶性前体肽和非原纤维性聚集物之间稳定性的不同。
本发明提供一种纯化淀粉样原纤维样品的方法，包括使用蛋白酶、去污剂、化学变性剂或离液剂对含有原纤维的样品进行处理，并从处理后的样品中收集原纤维。
特别是，本发明提供一种纯化淀粉样原纤维的方法，其中样品用蛋白酶、去污剂、化学变性剂或离液剂处理，其处理条件使样品中存在的无定形聚集物和可溶性前体得以消化或降解。在本发明的一个优选方面中，通过例如对样品加以离心或过滤来收集产生的原纤维，以分离淀粉样原纤维。
本发明还涉及淀粉样原纤维的纯化的制备物，其中原纤维至少包含样品中蛋白质重量的80％，优选的是至少85％或90％，更优选的是至少95％。
发明详述本发明涉及一种纯化淀粉样原纤维的方法。对淀粉样原纤维样品进行处理，减少原纤维样品中存在的异质。本发明特别要去除的是原纤维样品中的可溶性前体肽和非原纤维性聚集物。
根据本发明，提供一种纯化样品中淀粉样原纤维的方法。本发明利用样品中原纤维与其它非原纤维杂质之间的稳定性的不同。特别的是，本发明的方法可用于去除样品中的可溶性前体肽和非原纤维性聚集物。优选的是，使用和相应的可溶性前体或非原纤维性聚集物相比，原纤维对其更为稳定的任何试剂对样品进行处理。特别的是，可以用消化或降解可溶性前体和无定形聚集物的试剂，或使聚集物变性的试剂来处理样品，以促进原纤维的分离和纯化。可以用于本发明的试剂包括蛋白酶，去污剂，化学变性剂或离液剂，有机溶剂，例如醇(TFE，HFIP，异丙醇)、乙腈、氯仿，在高温或低温下温育样品，以及使用溴化氰之类的化学制剂。所选用的条件应该不促进更多原纤维的形成，以免污染最初的那些原纤维。比如，可以在温育过程对从样品中移出的等分试样进行分析，评价以可溶性前体和非原纤维聚集物形式存在的杂质是否减少，来鉴定适用于各种原纤维样品的试剂。
在优选的方面中，本发明方法使用蛋白酶、去污剂、化学变性剂或离液剂对样品进行处理。在一个特别优选的实施方案中，提供了能够降解可溶性肽和非原纤维聚集物的蛋白酶或其它试剂，来降解样品中的非原纤维肽，而保持原纤维不受影响。
依据本发明，提供了一种纯化淀粉样原纤维的方法，该方法包括使用蛋白酶、去污剂、化学变性剂或离液剂对含有原纤维的样品进行处理，并从处理后的样品中收集淀粉样原纤维。
待处理的原纤维样品可以通过任何适当的途径获得。原纤维可以是由单个或多个肽前体形成的原纤维，因此可能包含混合原纤维。例如，待纯化样品可以是从体内形成的斑(plaque)中分离的样品。原纤维样品可以从表现出淀粉样沉积的病人或动物的活组织检查和组织样品中获得，淀粉样沉积物含有Aβ、IAPP、运甲状腺素蛋白、β2微珠蛋白、载脂蛋白、AI、凝溶胶蛋白(gelsolin)、溶菌酶、PrP或任何其他淀粉样蛋白源性蛋白之类的多肽。在另一种方案中，待处理样品可以是通过适当的体外方法，从处于导致原纤维形成的条件下的蛋白质样品中制备的样品。例如，原纤维样品可以从上面提到的多肽，或与疾病无关的肽或蛋白质中获得，其方法包括定期调整温度、pH、离子强度、有机溶剂、化学变性剂和螯合试剂等参数，对多肽进行温育，其中在至少部分变性的条件下对蛋白质进行温育，在适当的溶液条件下对小肽进行温育。
使用试剂对含有原纤维的样品进行处理，其中和样品中的肽前体、杂质或无定形聚集物相比，原纤维更为稳定。在一个实施方案中，样品用蛋白酶处理。可以使用任何适当的蛋白酶，比如胃蛋白酶之类的蛋白酶。适当蛋白酶的选择，比如，取决于特定pH值及温度条件下待纯化原纤维所表现出的稳定性。胃蛋白酶在低pH值(最适pH值1.8～2.5，20℃～37℃)条件下具有蛋白酶活性。用于相似目的的其他蛋白酶包括胰酶(最适pH值7.5～8.5，20℃～37℃)、链霉蛋白酶(最适pH值6.0～8.0，20℃～40℃)、蛋白酶K(最适pH值7.5～10.5，20℃～37℃)、木瓜蛋白酶(最适pH值6.0～7.5，20℃～37℃)、弹性蛋白酶(最适pH值7.5～8.5，20℃～37℃)、纤维蛋白酶(最适pH值7.5～9.0，20℃～30℃)、纤维蛋白溶酶(最适pH值8.0～9.5，25℃)等。
优选使用低特异性蛋白酶(胃蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶等)的情况包括原纤维物质对消化作用耐受性很强时；或需要将原纤维核心进行分离并加以鉴定时，例如鉴定参与原纤维中β结构形成的氨基酸残基，去除原纤维中任意其他的结构元件，如环、螺旋或无序片段。优选使用纤维蛋白溶酶、X因子、纤维蛋白酶之类的高特异性蛋白酶的情况包括原纤维对降解较为敏感时；或需要完整的原纤维材料，包括不参与β结构核心形成的环和其他结构元件(功能性或非功能性)时。蛋白酶也可联合使用。
可以使用任何适当方法使样品与蛋白酶相接触。优选的是，在能够消化样品中无定形聚集物和可溶性前体，而不消化淀粉样原纤维的条件下将样品和合适的蛋白酶进行温育。特别是，选择温育条件使得样品中所有蛋白杂质得以消化而不消化淀粉样原纤维自身。在本发明的优选方面中，样品用蛋白酶处理，随后温育足够长时间以基本上去除样品中的无定形聚集物和可溶性前体或其它杂质。
根据所用蛋白酶及淀粉样原纤维的稳定性选择温育温度。使用蛋白酶对样品进行处理的适当温度包括20℃～60℃，优选30℃～40℃，例如37℃。加入样品中的蛋白酶可为任何适当的量，只要足够使杂质在这一处理条件下得以消化即可。例如，样品中蛋白酶以蛋白酶与蛋白质重量比为约1∶1或1∶10至1∶10000的比例存在，优选约1∶20至约1∶100。适当条件的选择属于本领域技术人员的常规技术。
合适的是，样品的温育时间可以是10分钟，优选30分钟至24小时、2天、3天，取决于要去除杂质的数量和稳定性。
也可使用去污剂、化学变性剂或离液剂对淀粉样原纤维进行纯化。这类试剂可以用来变性肽和解聚可溶性和非原纤维性肽，促进原纤维和其它肽杂质的分离。有些情况下，淀粉样原纤维表现出对SDS或LDS等阴离子型去污剂的变性作用的强耐受性。对HEWL(鸡卵白溶菌酶)淀粉样原纤维进行的实验表明在去污剂浓度高达约1％w/v的条件下温育时，淀粉样原纤维仍保持完整。也可使用具有相似作用的其他非离子型去污剂或阳离子型去污剂。
尿素或胍，特别是氯化胍或硫氰酸胍之类的化学变性剂或离液剂对单体蛋白、非特异性和无定形聚集物以及结构化良好的淀粉样原纤维具有不同程度的影响。相应地，也可以使用胍或尿素之类的化学变性剂。胍使用浓度小于4M，如1～4M。对于所使用的每种试剂都要确定适当的温育条件，如温度和温育时间。适当的温度和温育时间包括上文描述蛋白酶时提到的温度和温育时间。
在本发明的一个方面中，可以从处理样品中抽取等分试样，从这些等分试样中分离原纤维，进行FTIR(傅里叶变换红外光谱)分析、SDS-PAGE分析或电镜分析或电喷射质谱分析等适当的分析，评价样品中存在的无定形聚集物或其它杂质的水平。这类分析可以用来评价获得纯化原纤维的优选处理条件。
在进行分离(如通过离心或过滤)或进一步分析之前，可以通过例如加入合适的蛋白酶抑制剂使样品中的蛋白酶失活。例如，胃蛋白酶或其它蛋白酶可以通过在碳酸铵或pH8.0的Tris中清洗来灭活。其它蛋白酶抑制剂包括PMSF(如1mM)、苯甲脒(如1mM)、亮肽素(如10μg ml-1)、胃蛋白酶抑制素(如10μg ml-1)、抑肽酶(如10μg ml-1)、抗蛋白酶(如10μg ml-1)、EDTA(如10μg ml-1)等。
用蛋白酶、去污剂或其它试剂处理后，可以使用任何适当的方法将淀粉样原纤维从样品中分离。典型的分离方法包括使用例如孔径受控的膜进行过滤，以及离心(沉降)。但是在一些情况下，可以利用原纤维表面的功能基团(如巯基基团、配基-DNA寡聚物等)使原纤维和活性表面(对于巯基等，例如金表面)相结合并加以清洗进行分离。也可使用化学交联剂，它例如优选与可溶性或非原纤维性聚集物发生反应，促进分离。由于原纤维表面存在大量活性基团，其亲和力比可溶性分子或小的聚集物要稳定得多。优选的是，进行离心或过滤，随后收集原纤维组分。例如，样品可以在100,000g～500,000g离心，优选300,000g，离心时间15分钟至4小时，例如1小时。去除上清液，收集沉淀，重悬于适当的介质，重复离心步骤。也可进行适当的清洗。
例如通过收集离心获得的沉淀来收集纯化的原纤维样品。这种原纤维可被重悬，或用作进一步的研究或应用，例如进行FTIR，电子显微镜分析或电喷射质谱分析和SDS-PAGE之类的进一步研究，或使用其它适当的方法研究原纤维结构，如通过质谱和NMR监测氢交换。另一方面，也可对原纤维样品进行加工，应用于纳米结构。
纯化的原纤维可用来鉴定参与聚集过程的关键残基。参与病理性蛋白质聚集过程的关键残基的分析只能在获得高纯度原纤维的情况下进行(Hoshino等，Nature Struct.Biology.2002，9332-336)。不论是对于预防聚集的药物的设计来说，还是对于疾病相关蛋白、生物活性肽中对聚集作用耐受的蛋白质和用作药物或工业应用的蛋白质进行人工改造或引入新变异来说，鉴定参与聚集过程的残基都是必要的。
淀粉样原纤维还可纯化用于纳米结构和纳米材料。可将纯化的原纤维纺成丝状纤维，用作纳米导线(利用它们在传导特性上的优势)，用作细胞生长基质，用作植入物中塑性生物相容性和生物可降解性材料，用作药物转运的封装材料，用作赋予表面特定性能(防水、抗污染表面)或改变表面性能(赋以光学特性，如发出荧光等)以用作感应器的涂层材料(涂料)。
实施例从PI3-SH3制备的淀粉样原纤维样品包含至少一定数量的非聚集性和非原纤维性物质。由于这些非聚集性和非原纤维性物质和原纤维的特性相似，且体积较大，通过普通的生化方法难以实现原纤维和其他物种，特别是大的聚集物的分离。为了解决这一问题，尝试了一种使用蛋白酶消化的新方法；由于两种类型的聚集物有不同的结构特征，它们对蛋白酶消化作用的敏感性就可能不同。出于这一目的，选用了低pH值条件下具有非特异性蛋白酶活性的胃蛋白酶。按照别处描述的方法制备两种不同种类的PI3-SH3聚集物样品。一种在pH1.5条件下温育的样品中包含无定形聚集物。另一种在pH2.0条件下温育的样品中包含良好限定(Well-defined)的淀粉样原纤维。在不同的温育时间，通过FTIR监测聚集物的消化情况(图1)。和pH1.5条件下形成的无定形聚集物相关的光谱显示它们的β片层相关组分迅速消失(分别在1612和1684cm-1处)，致使在约1649cm-1处出现和一个非结构化构象相关的主峰。相较之下，包含淀粉样原纤维的样品(pH2.0条件下温育)的光谱显示和聚集物相关的β片层的主要光谱特征随时间的变化微弱，在温育3小时后，只有少量变化。有趣的是，同时可观测到约1684cm-1处带密度的减少和中心在约1618cm-1处的主峰稍向较高波数位置移动。这一现象可能意味着样品中存在的、分别在1684和1612cm-1处有吸收的一些聚集物种被消化。这些变化表明样品中存在的无定形物质被消化，只留下了耐受蛋白酶的原纤维。还发现1640和1660cm-1之间的密度增加，这是由于出现了更多的无序物种(消化的肽)，即肽片段。
可使用不同的生物物理技术对胃蛋白酶消化后的淀粉样原纤维完整性加以分析。对样品进行电镜(EM)分析所获得的显微照片显示了胃蛋白酶消化后的大量完整淀粉样原纤维，它们保留有由原始制剂证实了的所有形态，而观测不到其它类型的聚集物。在使用6M GndHCL破坏淀粉样原纤维并重折叠后，记录PI3-SH3的1D核磁共振光谱来评价淀粉样原纤维中蛋白质分子的完整性。其光谱和聚集前的天然蛋白的光谱无法区分。胃蛋白酶处理前后原纤维的PI3-SH3的SDS-PAGE分析如下。泳道1天然蛋白质；泳道2胃蛋白酶加入前的原纤维；泳道3将泳道2样品和胃蛋白酶进行温育，使之消化后得到的沉淀；泳道4将泳道2样品和胃蛋白酶进行温育，使之消化后得到的上清液。泳道2中单体带下方出现一个较小的带，其原因可能是在淀粉样原纤维形成所需的低pH、长时间温育后形成的少量蛋白降解产物。在泳道3中，这一小带完全消失，因此在淀粉样原纤维中不存在。有趣的是，包含PI3-SH3淀粉样原纤维的样品的SDS-PAGE显示出泳动位置与PI3-SH3单体相同的一条带，表明原纤维由完整的全长蛋白形成。通过胃蛋白酶消化和超速离心去除包含原纤维的样品中所有的可溶性组分，SDS-PAGE再次显示只留下有全长的多肽，而检测不到其它的蛋白片段。相较之下，通过这一过程得到的上清液中观测不到任何条带，说明存在于原始样品中的可溶性单体完全得以降解。
对胃蛋白酶消化和随后超速离心的淀粉样原纤维样品进行电喷射质谱(EMS)分析，产生的质谱和全长PI3-SH3结构域相一致，而没有检测到其他更小的片段。因此SDS-PAGE和EMS分析表明纯化步骤后原纤维所表现出的形态学及光谱学特征和包含在有序淀粉样原纤维中的全长PI3-SH3相一致。最可能的原因是PI3-SH3在原纤维中采用了一种非常致密的构象，使蛋白酶难以靠近。
一旦确定了淀粉样原纤维对蛋白酶耐受，而相较之下原始样品中的无定形聚集物和可溶性蛋白对蛋白酶较敏感，我们就使用FTIR对淀粉样原纤维所表现出的结构特征进行进一步鉴定。原始样品与纯化样品的FTIR光谱完全相同(图2)，说明原始样品中的酰胺I带主要来源于溶液中存在的原纤维。然而，对光谱的详细分析揭示了一些差别，特别是对二者光谱的二阶导数加以比较时这些差别更为明显。事实上，消化后1684cm-1的组分消失，1612cm-1处主要聚集物带的三种组分中的一种组分在二阶导数分析时缺失(图2)。这表明位于1684cm-1和1612cm-1的带-包含无定形聚集物(见图1)的样品中的主要组分-是纯化前存在于样品中的非原纤维物质的特征。
因此我们可以推测，淀粉样原纤维中发现的氢结合组分主要在1618cm-1和1628cm-1，和β结构相对应。位于1641cm-1和1664cm-1处的其他组分消化后仍存在于原纤维中，分别对应于无序成分和β转角的存在，说明除了主要的β片层结构特征，淀粉样原纤维中蛋白质的一些区域可能表现为灵活易变的环和转角。后一结论与基于cryo-EM分析的SH3原纤维模型相一致，但由于原纤维中蛋白质对蛋白酶解作用缺乏敏感性，本结论是明显的。它必须反映出这样一个事实即使多肽链的那些区域不在明确的β片层结构中，它们仍致密地包裹在原纤维组装体中。
除了为不同类型的二极结构提供证据，有报道表明FTIR分析还可用于分辨β片层的平行和反平行构型。然而，原纤维中β链特有的几何结构可能使其IR频率和那些典型的β片层结构的IR频率的相混淆。
纯化淀粉样原纤维的FTIR分析表明位于1611cm-1～1612cm-1的组分显著减少，位于1684cm-1的组分完全消失(图2)。这一观察结果有力证明了这些减少的组分与非原纤维聚集物相关，与更低pH值下温育的、含有无定形聚集物的样品观察到的光谱相一致(图1)。位于约1684cm-1处的组分在纯化的原纤维中几乎完全缺失，表明几乎不存在平行和反平行结构的交互作用。这些结果表明，用FTIR之类的技术对淀粉样原纤维进行分析时要极为小心，保证来自杂质和可溶性物质的信号不干扰光谱。还有必要对纯化的淀粉样原纤维进行进一步FTIR分析，确定β片层的平行和/或反平行性质及其与明确聚集物/原纤维结构和形态的联系。有趣的是，和对一些淀粉样原纤维样品进行固相NMR和FTIR分析的结果相同，对胰岛素高度原纤维样品的研究也表明存在有平行β片层结构。然而，仍不确定原纤维中所需的β结构构象，或它和准确原纤维形态的关系。这是因为也有报道说明其他一些原纤维样品存在有反平行结构，而其他作者推测平行-反平行构象共存。因此需要对高纯度的材料进行进一步分析，确定淀粉样原纤维中β链的取向。使用我们在这里所报道的方法研究原纤维材料的能力，在这些研究中尤其重要。
为了评价淀粉样原纤维对化学变性剂的耐受性，将HEWL原纤维性样品的等分试样在不同浓度胍存在条件下温育。使用300,000g离心1小时使这些样品沉淀，测定胍作用后溶解的蛋白量。在280nm处对获得的上清液进行测定。同时用电镜对获得的沉淀物进行分析。结果如图3所示。
对于使用浓度高达4M胍温育后获得的沉淀物进行分析，结果显示有大量的淀粉样原纤维，并与未处理样品形态相似。而一些蛋白质在中等浓度的胍(1M～4M)作用时被溶解，说明处理过程去除了由松弛结合的蛋白质分子组成的非特异性聚集物。这也说明用中间浓度的变性剂处理后得到的原纤维比原始样品“更纯”。
总而言之，可以使用蛋白酶解消化、超速离心去污剂和化学变性剂来制备不含无定形聚集物和可溶性前体的淀粉样原纤维。该方法使我们能够说明这里研究的SH3原纤维中存在全长蛋白质。FTIR分析显示原纤维中的蛋白质具有典型β片层结构的FTIR带，β片层结构特征主要是平行的。多肽链的其它区域似乎形成转角和可能与β链有关的无序结构，虽然这些结构似乎也紧密包裹在原纤维结构中。这里描述的方法适用于广泛的其它原纤维系统，不仅对于研究疾病相关聚集物具有重要性，也是制备和鉴定由蛋白质原纤维组装的新材料的一种手段。
方法将0.5mM PI3-SH3溶液于2H2O中，pH1.5、37℃条件下温育5天制备无定形聚集物。将0.5mM PI3-SH3溶液于2H2O中，pH2.0、35℃条件下温育30天制备淀粉样原纤维。
样品在蛋白酶消化前用电镜鉴定以确定其形态。pH1.5、35℃条件下温育6天的样品出现非原纤维聚集物，而pH2.0、35℃条件下温育30天的样品呈现明确的原纤维。两种样品均在2H2O中制备，由同位素效应将读数校正。
37℃温度下，将样品和以胃蛋白酶PI3-SH3＝1∶200的重量比存在的胃蛋白酶温育，进行蛋白消化。在不同时间取出等分试样并用FTIR分析，不做进一步处理。
淀粉样原纤维样品在6M GndHCL中温育，6M GndHCL可立刻溶解原纤维。在pH7.2的20mM磷酸钠缓冲液中透析，去除GndHCL，使蛋白质重折叠形成天然构象。将从原纤维恢复的蛋白质和新鲜制备的蛋白溶于同一种缓冲液中，记录其1D NMR质谱。
在存在有1％SDS或LDS的电泳上样缓冲液中温育原纤维，使淀粉样原纤维完全溶解。MS分析前，将样品于10％氢氧化铵中温育，使原纤维解离。
将1mM PI3-SH3溶液于2H2O中，pH2.0、35℃条件下温育30天，制备包含淀粉样原纤维的样品。使用以胃蛋白酶PI3-SH3(1∶100)重量比存在的胃蛋白酶将样品于37℃下消化3小时，然后于300,000g超速离心1小时。含有未消化原纤维的沉淀于pH2.0的2H2O中重悬，在完全相同的条件下再次离心。沉淀再次于pH2.0的2H2O中重悬，将之和纯化前原始样品的等分试样一起进行FTIR分析。
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权利要求
1.一种纯化淀粉样原纤维的方法，包括(a)用蛋白酶、去污剂、化学变性剂或离液剂处理含有原纤维的样品和(b)从处理后的样品中收集淀粉样原纤维。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)包括用蛋白酶、去污剂、化学变性剂或离液剂处理所述样品，其处理条件使样品中的无定形聚集物和可溶性前体被消化、降解或变性，而淀粉样原纤维不被消化、降解或变性。
3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中步骤(a)包括用蛋白酶处理样品，并将样品温育30分钟至24小时。
4.根据前面任一项权利要求的方法，其中步骤(a)包括在20℃～60℃的温度范围内在蛋白酶存在下处理样品。
5.根据前面任一项权利要求的方法，其中步骤(a)包括使用蛋白酶处理样品，蛋白酶与蛋白的重量比为1∶10至1∶10000。
6.根据前面任一项权利要求的方法，其中步骤(a)包括使用选自胃蛋白酶、胰酶、链霉蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、纤维蛋白酶或纤维蛋白溶酶的蛋白酶对样品进行处理。
7.根据权利要求6的方法，其中蛋白酶是胃蛋白酶。
8.根据权利要求1或2的方法，其中步骤(a)包括用选自阴离子去污剂、非离子去污剂或阳离子去污剂的去污剂对样品进行处理。
9.根据权利要求1或2的方法，其中步骤(a)包括使用选自尿素或胍的化学变性剂或离液剂对样品进行处理。
10.根据前面任一项权利要求的方法，其中步骤(b)包括对处理后的样品加以离心或过滤，从而收集淀粉样原纤维。
11.淀粉样原纤维的同质制剂，所述原纤维包含样品中蛋白质重量的至少80％。
12.根据权利要求11的原纤维同质制剂，其中所述原纤维包含样品中蛋白质重量的至少95％。
13.淀粉样原纤维的纯化制剂，它可通过权利要求1至10中任一项的方法获得。
全文摘要
一种纯化淀粉样原纤维的方法，包括用蛋白酶、去污剂、化学变性剂或离液剂对含有原纤维的样品进行处理。随后从处理的样品中收集淀粉样原纤维。处理条件优选只消化、降解或变性样品中的无定形聚集物和可溶性前体，而并不消化、降解或变性淀粉样原纤维。本发明提供了淀粉样原纤维的同质制剂，其中原纤维包含样品中蛋白质重量的至少80％。
文档编号C12P21/06GK1549825SQ02817114
公开日2004年11月24日 申请日期2002年6月28日 优先权日2001年6月29日
发明者J·祖尔多, C·M·多森, J 祖尔多, 多森 申请人:埃西斯创新有限公司