用于生长激素高表达的dna及其应用的制作方法

专利名称：用于生长激素高表达的dna及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种融合蛋白编码的DNA，这种融合蛋白含有具有特异调节包括人类在内的哺乳动物生长和形态建成的生理活性的生长激素，或与其功能相同的，或者具有进一步改善功能的蛋白质片段或类似物。另外涉及使用该种DNA，通过其表达大量产生所需要的生长激素、或其功能性蛋白质片段、变异体或类似物。
背景技术：
生长激素是由脑下垂体前叶分泌的一种肽类激素，是生长期身体生长，特别是骨骼生长不可缺少的物质。如果由于某种原因不能分泌生长激素，生长就会停止，从而导致侏儒症。
医用生长激素可以用于治疗这种侏儒症。生长激素不仅可以治疗侏儒症，还适用于各种疾病造成的矮小症，并正在扩大应用到有效防止衰老等多方面。
过去医用生长激素是从尸体的脑下垂体提取，因而可利用的量稀少而价格贵昂。1970年代建立的基因重组技术也被用于生产生长激素，1980年代建立了用大肠杆菌基因重组生产生长激素的方法。(参见日本专利公报平成6年-65318号、公开专利平成7年-46988号公报、专利公报平成8年-2314号)用大肠杆菌表达外源蛋白质一般是在细胞质中表达(日本专利公报平6-65318号公报)，或使其分泌到周质内。(公开专利平成7年-46988号、专利公报平成8年-2314号)，但是前一类方法存在时常形成包含体而变性，或不能形成对于维持蛋白质生理活性很重要的二硫键等问题；后一类方法解决了蛋白质空间折叠和二硫键的问题，但在周质空间中分泌的量受到限制。为此，现状是用大肠杆菌大量表达生长激素这类有二硫键的蛋白质还受到制约。
近年来开发了用短小芽孢杆菌(Bacillus brevis)表达基因重组蛋白的系统，利用该系统，能够在有活性的状态，即正常形成二硫键的状态下表达具有二硫键的多肽(人类上皮细胞增殖因子)并大量分泌到培养基中。(日本专利公报第2082727号，公开专利昭和62年-201583号公报、Yamagata，H.et al.，J.Bacteriol.169，1239-1245(1987)、鵜高重三，日本农艺化学会志，61，669-676(1987)，Takao，M.et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，30，75-80(1989)，Yamagata，H.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，3589-3593(1989))，这种大量产生有二硫键的蛋白质的系统受到人们的关注。
短小芽孢杆菌表达系统在培养基中分泌外源蛋白质的原理，是由于紧接细胞壁蛋白质信号肽的外源蛋白质能诱导信号肽透过细胞膜，然后借助信号肽酶把外源蛋白质与信号肽切割开来，并分泌到培养基中。人类上皮细胞增殖因子利用这个系统实现了大量表达和分泌是一个好例子，但并不是所有外源蛋白质都能够利用这个系统大量表达分泌。作为利用这种表达系统表达分泌人生长激素的报告，有在信号肽的后面紧接人生长激素而使之分泌到培养基中的报告(日本公开专利平成7年-51072号公报)，还有为提高分泌量，以融合蛋白质的形式紧随信号肽连接使之分泌的报告(日本公开专利平成11年-341991号公报)。关于后一种表达方式，虽然可以见到融合蛋白的高表达，但是，由于为了识别的氨基酸序列的方便，用来把融合蛋白和生长激素切割开来的蛋白酶切割出的生长激素的氨基末端多了一个Gly或Ser，变成了生长激素的变异体，所以没有得到天然生长激素。此外，即使是相关生长激素变异体的生产，也希望获得进一步提高效率产生大量所需蛋白质的技术。
因此，本发明的目的是提供利用细胞壁蛋白质的信号肽，适当选择用于大量分泌表达生长激素的氨基酸序列组成并加以连接而得到的融合蛋白中，能够在宿主细胞中进一步提高生长激素分泌量的融合蛋白质。同时，本发明的目的在于选择出表达的融合蛋白中能获得不含额外氨基酸序列的与天然产物一样的生长激素的酶切部位，在使含切割用氨基酸序列的融合蛋白的分泌量不降低的情况下发现各氨基酸序列的组合。
本

发明内容
本发明人成功地实现了大量表达分泌含有二硫键的具备生物活性的生长激素或它的功能性片段、含有变异体或类似物的融合蛋白。方法是单独用芽孢杆菌属细菌的细胞壁蛋白(CWP，Cell Wall Proteins)中一种中间细胞壁蛋白(MWP，Middle Wall Protein)的氨基末端第1到第20位氨基酸序列(前导氨基酸序列，Leader)，或与多个His残基或作为接头(Linker)的Asp-Tyr-Asp-Ile-Pro-Thr-Thr一起，紧接酶的切割部位(Cleavage)Ile-Glu-Gly-Arg或Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly序列之后配置生长激素。开发了使用能够识别上述切割部位的酶作用于该融合蛋白，从而得以大量生产天然型生长激素(20kd、22kd)，或者获得氨基末端尚残留Gly的生长激素的变异物(20kd、22kd)的技术。
本发明的第一实施方案提供的是为融合蛋白编码的DNA，这种融合蛋白包含以下顺序连接的氨基酸序列从芽孢杆菌属细胞壁蛋白质(cwp)氨基末端开始，由一个以上氨基酸残基组成的前导肽(Leader)、在酶切中利用的氨基酸序列(Cleavage)、生长激素或它的功能性片段、生长激素变异体或其类似物的氨基酸序列(GH)，并且Cleavage的氨基酸序列为Ile-Glu-Gly-Arg(序列编号1)。
在本发明另外的实施方案中，提供了编码融合蛋白的DNA，这种融合蛋白包含以下顺序连接的氨基酸序列从芽孢杆菌属细胞壁蛋白质(CWP)氨基末端开始，由一个以上氨基酸残基组成的前导肽(Leader)、在酶切中利用的氨基酸序列(Cleavage)、生长激素或它的功能性片段、生长激素变异体或类似物的氨基酸序列(GH)，并且GH为20kd人生长激素(GH 20kd)。
本发明的其它实施方案中还提供了编码按以下顺序连接而成的融合蛋白的DNA，即从芽孢杆菌属细胞壁蛋白质(CWP)氨基末端开始，由一个以上氨基酸残基组成的前导肽(Leader)、多个组氨酸残基组成的nH、在酶切中利用的氨基酸序列(Cleavage)、以及生长激素或它的功能性片段、生长激素变异体或类似物的氨基酸序列(GH)。在优选实施方案中，是6个组氨酸残基。
本发明更优选的实施方案中，GH为22kd的人生长激素(GH22kd)或20kd的人生长激素；酶切识别序列(Cleavage)为Ile-Glu-Gly-Arg(Cleavage 1，序列编号1)或Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly(Cleavage2，序列编号2)。
此外，还有为特定融合蛋白编码的DNA，该特定融合蛋白是在酶切识别序列上游连接由1个以上氨基酸残基组成的接头形成的，最佳接头的氨基酸序列是Asp-Tyr-Asp-Ile-Pro-Thr-Thr(序列编号3)。
细胞壁蛋白以中间细胞壁蛋白(MWP)最佳，前导肽则特以从MWP的氨基末端第1到第20位氨基酸序列为佳。
本发明另外的实施方案中，提供了DNA，该DNA是在编码上述融合蛋白的DNA的5’末端上游由含有基因表达所必需的启动子序列的DNA(Promoter)、在启动子3’末端下游的SD序列、以及编码芽孢杆菌属细胞壁蛋白质(CWP)之信号肽的DNA(CWPsp)以该顺序连接而成。此处所用之启动子，最好来自芽孢杆菌属细胞壁蛋白质(CWP)。
在本发明的其它实施方案中，本发明提供了载体，它含有DNA，该DNA是在编码上述融合蛋白的DNA的5’末端上游由含有基因表达所必需的启动子序列的DNA(Promoter)、启动子3’末端下游的SD序列、以及编码芽孢杆菌属细胞壁蛋白质(CWP)之信号肽的DNA(CWPsp)以该顺序连接而成。
再者，本发明提供了利用上述载体进行了转化或转染的宿主细胞。合适的宿主细胞是芽孢杆菌属细菌，该属细菌中以短小芽孢杆菌(Bacillus brevis)最好。
本发明的特别优选的实施方案中，含有上述载体的宿主细胞是菌株，该菌株的申报编号为FERM BP-7727，在2001年9月7日向位于日本国茨城县つくば市东町1丁目1番地1中央第6所的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物委托中心(布达佩斯条约授权的国际委托机构)申报注册。
本发明提供生长激素或其功能性片段、变异体或类似物的生产方法，其中培养上述宿主细胞，使融合蛋白在培养该宿主细胞的培养基上表达，用酶切割法从该融合蛋白上切割得到生长激素或它的功能性片段、变异体或类似物，生产重组生长激素或其功能性片段、变异体或类似物。


图1融合体MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH22kd重组到短小芽孢杆菌中的表达载体(pNU211R2L5)的略图。
图2表示各种转化子的培养基的SDS-PAGE凝胶电泳中的图谱。
第1泳道标记蛋白；第2泳道阴性对照(不含外源蛋白的质粒pNU211R2L5)；第3泳道MWPsp-GH22kd；第4泳道MWPsp-MWPmp20-Cleavage 1-GH22kd；第5泳道MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 1-GH22kd；
第6泳道MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH22kd；第7泳道MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 1-GH20kd；第8泳道MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH20kd；第9泳道MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 2-GH22kd；第10泳道MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 2-GH22kd；图3表示各种转化子的蛋白质免疫印迹图谱第1泳道阴性对照(不含外源蛋白的质粒pNU211R2L5)；第2泳道MWPsp-GH22kd；第3泳道MWPsp-MWPmp20-Cleavage 1-GH22kd；第4泳道MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 1-GH22kd；第5泳道MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH22kd；第6泳道MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 1-GH20kd；第7泳道MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH20kd；第8泳道MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 2-GH22kd；第9泳道MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 2-GH22kd；图4是表示通过各种转化子分泌的人生长激素的高效液相色谱(HPLC)得到的定量值的图，A柱阴性对照(不含外源蛋白的质粒pNU211R2L5)；B柱MWPsp-GH22kd；C柱MWPsp-MWPmp20-Cleavage 1-GH22kd；D柱MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 1-GH22kd；E柱MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH22kd；图5是表示各种人生长激素的高效液相色谱(HPLC)洗脱的图A图阳性对照(Norditropin)；B图天然的GH22kd；C图氨基末端有甘氨酸(Gly)变异型GH22kd；D图天然型GH20kd；图6是表示各种人生长激素引起的增加体重作用的图(数据平均值±SD，*P＜0.01)图中●表示阴性对照
，○表示阳性对照(Norditropin)，△表示氨基末端有甘氨酸的变异型GH22kd，◇表示天然型GH 22kd，□表示天然型GH 20kd。
图7是表示各种人生长激素引起的增加骨骼长度作用的图(数据平均值±SD，*P＜0.05，**P＜0.01)A柱阴性对照
B柱阳性对照(Norditropin)C柱氨基末端有Gly的变异型GH 22kdD柱天然型GH 22kd生长激素E柱天然型GH 20kd实施发明的最佳方式根据本发明，有可能在显著提高含有二硫键的表现生物活性的生长激素或它的功能性片段、变异体或类似物产量的同时，还大量生产与天然产物具有同样氨基末端序列的生长激素及其功能性片段的重组体。
作为用作前导肽的包含在融合蛋白中的细胞壁蛋白质(cwp)，例如可以采用来自短小芽孢杆菌菌株47(FERM P-7224日本公开专利昭和60年-58074号公报、公开专利昭和62年-201589号公报)的中间细胞壁蛋白[MWP，middle wall protein，见J.Bacteriol.，1691239-1245(1989)，序列编号40]、来自菌株HPD31(FERM BP-1087日本公开专利平成4年-278091号公报)的HWP[表层蛋白，在细胞壁中形成六角形阵列，见J.Bacteriol.，1721312-1320(1990)，序列编号41]，但并不限于以上所述。根据本发明的实施方案，合适的前导肽是MWP的部分序列。优选的前导肽，是MWP的成熟蛋白质的氨基末端的氨基酸残基，如在日本公开专利平成11年-341991号公报所报告的，通过在氨基末端装配1个以上氨基酸残基，就可以见到提高表达的生长激素分泌量的效果。在本发明的实施例中，而且氨基末端氨基酸残基数目多于或少于20个都可以。
Cleavage是可能受到酶切的氨基酸序列，只要其下游连接的生长激素不受酶切处理的影响，则不特别限定其切割的序列。根据本发明的一个实施方案，酶切的合适的氨基酸序列是可以被因子Xa识别的Ile-Glu-Gly-Arg(序列编号1)，利用这个序列，酶切处理后所得到的GH的氨基末端几乎不含有多余的氨基酸残基，因此优选该序列。本发明还可以利用酶切识别序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly(序列编号2)，该序列可以被TEV蛋白酶识别。另外，美国专利第5179007号公报指出，能被TEV蛋白酶识别的氨基酸序列还有Glu-Asn-Leu-Try-Phe-Gln-Ser(序列编号4)，如果采用序列2或序列4，经酶切处理后的生长激素的氨基末端含有甘氨酸或丝氨酸残基，但本发明确认，氨基末端有甘氨酸残基的生长激素，其生物活性与天然产物相同。
虽然本发明最理想的生长激素是人生长激素，但只要以本发明的融合蛋白形式可以装配到生长激素的一部分上，如果可望出现高表达分泌效果，则不一定非是人生长激素不可。即，除人以外的哺乳动物的生长激素，或其他生物的生长激素也可以。这些生长激素包括那些功能与在生物体内调节生长或形态建成，例如与促进骨骼生长和代谢作用有关的有生理活性的天然生长激素相同，或者有改善功能作用(包括抑制不利作用)的片段或类似物。所谓人生长激素hHG(序列编号38)，是人脑下垂体前叶产生和分泌的肽类激素。它由GH-1基因编码，成熟的分子是经加工切除由26个氨基酸残基组成的信号肽后得到的分子内有两个二硫键，由191个氨基酸残基组成的分子，分子量约22kd。它的已知变异体是由基因GH-2编码的hHG-V(序列编号39)，成熟的分子也是由191个氨基酸残基组成，分子量约22kd，但是它不在脑下垂体，而在胎盘中表达。hHG和hHG-V的成熟分子中13个氨基酸残基不同，但二者都有生长激素的生理活性。因而，本发明的生长激素中，还包括那些13个氨基酸中只有部分是从hHG变化而来的，或与这些氨基酸变为类似的其他氨基酸，预期将表现生长激素生理活性的变异体或类似物。同时，发现hHG和hHG-V两者的第32到46个氨基酸残基发生缺失，分子量为20kd，它们和22kd的分子一样也具有同等的促进生长的作用，但促糖尿作用和胰岛素作用的活性都较低。在只考虑促进生长效果时，根据患者的健康状态，也可以考虑使用这些发生了缺失的片段。因此本发明除包含以融合蛋白形式表达的生长激素(GH)、天然型的生长激素以外，还宜包含具有相应生理活性的功能性片段、变异体和类似物。
例如，为人生长激素编码的DNA，可以利用买来的人脑下垂体mRNA和合成单链cDNA的试剂盒获得。如果根据已知的DNA序列，利用市售的用于DNA合成的引物合成短链DNA，一般可以借助聚合酶链式反应(PCR)扩增所需要的DNA片段。利用PCR扩增，一个循环过程包括DNA变性、与引物的退火，以及链的延长，经过20次循环得到需要的DNA量。
关于接头，是与前导肽-nH(Leader-nH)或与前导肽、Cleavage-GH相连接的氨基酸序列，借此可以提高融合蛋白质的分泌量，或保证酶切的效率。该氨基酸序列并非特别限定，只要满足上述功能即可。但，根据本发明的实施方案，特别优选的氨基酸序列为Asp-Tyr-Asp-Ile-Pro-Thr-Thr(序列编号3)，即使该序列的部分氨基酸残基被其他氨基酸置换，只要维持高分泌量的效果，也可以使用这样的置换序列。
前导肽后面紧跟着装配的多个组氨酸(His)残基，有增加含生长激素的融合蛋白表达分泌量的效果。在外源蛋白的前后装配的多个组氨酸残基，一直被用来作为高效分离纯化外源蛋白的标记物，但本发明人发现通过导入该氨基酸序列而意外地获得了增加含生长激素的融合蛋白分泌量的效果。根据本发明的实施方案合适的His残基数为6个，但并不仅限于此，也可采用由多个组氨酸残基构成的氨基酸。
本发明提供的编码按适当顺序将以上阐述的序列连接而成的融合蛋白的DNA，可以组合该领域已经为公众掌握的技术来制作。
例如通过化学合成或克隆的方法逐个制备组成部分的各DNA序列，然后用连接酶把这些DNA顺序连接，结合采用PCR方法产生所需要的DNA。具体请参考本申请的实施例加以理解。在Maniatis T.et al.，Molecular Cloning 2nded.，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory(1989)；Innis M.A.et al.，PCR Protocols，A Guide to Methodsand Applications，Academic Press(1990)等中刊载的一般技术也可以采用。
在本发明的其他实施方案中，为了在宿主细胞中表达上述融合蛋白，提供了一个载体，该载体含有DNA，该DNA是在编码该融合蛋白的DNA 5’上游末端由含有基因表达所必要的启动子序列的DNA(Promoter)、在该启动子3’末端下游的SD序列、和芽孢杆菌细胞壁蛋白(cwp)以该顺序连接而成。
根据本发明的实施方案，合适的启动子是芽孢杆菌属细菌的CWP的启动子。作为CWP，与对于Leader的描述一样，可以采用来自短小芽孢杆菌菌株47(FERM P-7224)的MWP，或来自菌株HPD31(FERMBP-1087)的HWP，没有严格限制。芽孢杆菌属细菌的启动子，有起调节作用的Spac启动子、来自φ105噬菌体的启动子，以及来自宿主细胞结构基因的淀粉酶或蛋白质的启动子等等[Molecular BiologicalMethods for Bacillus，Harwood，C.R.&Cutting，S.M.eds.，pp202-203(1990)]，但最好选择那些能使3’末端下游连接的基因表达的启动子。例如MWP和HWP的启动子，可以适合使用从序列号40和41各自记载的5’非翻译区段存在的转录开始部位1～5存在的启动子范围内选择的DNA序列。
启动子3’末端下游连接的SD序列，已知是富含嘧啶的碱基序列(参见Shine J.和Dalgarno，L.，Eur.J.biochem.157(1)，pp.221-230)，最好选择能促进形成蛋白质合成复合体的序列。本发明中采用的合适序列是存在于短小芽孢杆菌的MWP翻译起始点上游的AGAGGAGGAGA(序列编号42、SD2)或GAAAGGAGGTGA(序列编号43、SD1)。
此外，通过把编码芽孢杆菌属细菌的细胞壁蛋白(CWP)的信号肽的DNA(CWPsp)连接到编码上述融合蛋白的DNA氨基末端(5’端)上游，翻译成蛋白质的信号肽和融合蛋白形成的联合体到达细胞膜后，融合蛋白就会由于信号肽酶的作用从联合体上分离出来，并分泌到细胞外。MWP和HWP的信号肽同样都可以作为CWPsp，而MWP的信号肽的氨基酸序列特别适合使用。
本发明还提供包含上述本发明的DNA的载体。能够使用的载体，至少必须符合以下条件，即具有可以把本发明提供的DNA插入到合适的插入部位，也就是具有限制性内切酶的切割位点；该DNA可以在宿主细胞内表达；以及可以在宿主细胞内自主复制等。载体可以含有复制起始位点和终止子序列，也可含有与耐药基因、营养要求性互补的基因等的选择标记。本发明的载体优选是可在芽孢杆菌属细菌中复制的质粒。例如pNU200、pHY500[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86pp.3589-3593(1989)]、pHY4831[J.Bacteriol.，169pp1239-1245(1987)]、pNU100(Appl.Microbiol、Biotechnol.，30pp 75-80(1989))、pNU211、[J.Biochem.，112pp.488-491(1992)]、pNU211R2L5(日本公开专利平成7年-170984号公报)、pHY700(日本公开专利平成4年-278091号公报)、pHT210(日本公开专利平成6年-133782号公报)、pHT110R2L5[Appl.Microiol.Biotechnol.，30pp.358-363(1994)]等均可用做载体，但是并不限定就是这些。在本发明的具体例中，通过如图1所示的构建方式，可以制作表达载体pNU-hGH。
本发明进一步提供了包括用上述载体转化的芽孢杆菌属细菌的宿主细胞。芽孢杆菌属细菌有短小芽孢杆菌菌株47(FERM P-7224日本公开专利昭和60年-58074号公报、公开专利昭和62年-201589号公报)、短小芽孢杆菌菌株47K(日本公开专利平成2年-257876号公报)、短小芽孢杆菌菌株310K(日本公开专利平成6年-296485号公报)、以及短小芽孢杆菌菌株HPD31(FERM BP-1087日本公开专利平成4年-278091号公报)等，但不限于这些。将表达载体pNU-hGH转移到短小芽孢杆菌菌株47-5Q中得到的重组细菌，在2001年9月7日向位于日本国茨城县つくば市东町1丁目1番地1中央第6所的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物委托中心(布达佩斯条约授权的国际委托机构)申报注册(原始委托)。该菌株的申报编号为FERM BP-7727。
用电穿孔[Methods in Enzymol.，217pp.23-33(1993)]等方法将所获得的上述表达载体转移到了芽孢杆菌属细菌等的宿主细胞中，在可以表达的条件下，用适当的培养基培养该细菌，可以在菌体外分泌含有生长激素的融合蛋白。
完成菌体培养后，融合蛋白可以组合应用凝胶过滤色谱、离子交换层析、亲和层析、疏水性相互作用色谱、电泳、等电点聚焦电泳等方法从培养基中分离纯化。通过对分离纯化的该融合蛋白进行酶切处理，可以切出GH，即天然型生长激素(20kd，22kd)，或氨基末端有甘氨酸残基(Gly)的变异型生长激素(22kd)，或功能性片段、变异体、或类似物。这样获得的重组生长激素保留了维持生物活性所必需的二硫键，可以直接用作医药品。
要进行酶切处理，根据在融合蛋白中导入了Cleavage的序列来进行就不用说了，采用能够在Cleavage上切割的酶，在该酶反应的最适条件下实施也可。例如在导入编号1序列的融合蛋白中，在约4～约25℃、pH约7～约9的条件下使Xa因子反应，然后在导入编号2或3序列的融合蛋白中，在约4～约37℃、pH约7～约9的条件下使蛋白酶TEV反应，即可实现酶切处理。
因此，本发明提供了大量生产重组生长激素或它的功能性片段、变异体或类似物的方法。该方法是通过借助上述表达载体培养转化的芽孢杆菌属细菌等，并使其在生长培养基中表达，再用酶法从融合蛋白切割出生长激素或它的功能性片段、变异体或类似物实现的。
实施例以下说明本发明的具体的实施例，但这些实施例不限于本发明。
制备编码融合蛋白的DNA时，采用通过DNA连接酶反应使通过PCR(聚合酶链式反应)扩增的DNA片段连接起来的方法。本实施例中，MWPsp是指MWP的信号肽，MWPmp20则是指成熟MWP蛋白的氨基末端开始的20个氨基酸。
在实施例1中，记载了制备MWPsp(相当于MWP信号肽的羧基末端开始的20个氨基酸)上连接了融合蛋白MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH 22kd的融合DNA，即制备MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH22kd的方法，以及构建插入该物质的载体的方法，其他融合蛋白质的生产方法则只作概述。
实施例1插入了MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage1-GH22kd融合DNA的载体(phGH)的构建(1)DNA片段MWPsp-MWPmp20的获得a模板DNA以公知的方法[Molecular Cloning 2nded.，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)]从短小芽孢杆菌(Bacillus brevis47-50株)抽提出840ng基因组DNA作为模板DNA。
b引物根据Yamagata，H.等，J.Bacteriol.，169，pp.1239-1245(1987)]和Tsuboi，A.等，J.Bacteriol.，170，pp.935-945(1988)]确定的MWP碱基序列，有机合成以下引物
正向引物5’-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3’(序列编号5，最终浓度0.1μM)反向引物5’-TACGGTTTTTTCCATATCAGC-3’(序列编号6，最终浓度0.1μM)c TaqDNA聚合酶市售商品(GIBCO BRL公司出品)5Ud其他Tris-HCl(最终浓度20mM，pH8)、MgCl2(最终浓度2.5mM)、dNTPs(dATP、dGTP、dCTP、dTTP，每种的最终浓度为50μM)实验步骤取上述a～d试剂各100μl到0.5ml的试管中，按公知方法[Innis，M.A.等，PCR Protocols，A guide to methods and applications，AcademicPress(1990)]进行PCR反应(每次循环的条件是变性94℃1分钟，退火53℃1分钟，DNA链的延长72℃1分钟，30个循环)。PCR反应结束后，用苯酚浓缩反应液后，用0.8％的琼脂糖凝胶在合适条件下电泳。用MILLIPORE公司出品的Urtrafree C3H从琼脂糖凝胶中同收PCR产物，即DNA片段MWPsp-MWPmp20。
回收的PCR产物经苯酚抽提后，用乙醇沉淀并真空干燥，溶于适量的蒸馏水中，进行平整末端反应(使用宝酒造公司出品的DNA平整化试剂盒，方法依照所附说明书)。
(2)DNA片段(His)6-接头-Cleavage 1的获得根据遗传密码字典[Molecular Cloning 2nded.，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)]化学合成编码(His)6-接头-Cleavage 1的氨基酸序列(His-His-His-His-His-His-Asp-Tyr-Asp-Ile-Pro-Thr-Thr-Ile-Glu-Gly-Arg(序列编号7)的正向寡核苷酸序列5’-CATCATCATCATCATCACGACTATGATATCCCGACCACTATCGAAGGTCGT-3’(序列编号8)，反向寡核苷酸序列5’-ACGACCTTCGATAGTGGTCGGGATATCATAGTCGTGATGATGATGATGATG-3’(序列编号9)，磷酸化反应(用ニツポンジ-ン公司出品多聚核苷酸激酶，按说明书操作)反应后，在10mMTris-HCl(pH8)、5mM MgCl2溶液中在95℃处理5分钟，37℃15分钟退火。退火后双链DNA片段TEV用苯酚抽提后，以乙醇沉淀，真空干燥后溶液适量多蒸馏水中。
(3)DNA片段、人生长激素GH22kd的获得除以下步骤外，按(1)同样多步骤获得末端平整的DNA片段GH22kd◆用插入了DNA片段GH22kd的质粒载体作为模板DNA插入了GH22kd的质粒载体按下述方法获得用PHARMACIA公司出品之单链cDNA合成试剂盒，根据所附说明书从市售的人脑下垂体mRNA(CLONTECH公司生产)合成人脑下垂体cDNA。
以该cDNA为模板，根据Roskam，W.G.et al.[Nucleic Acids Res.，7pp.305-320(1979)]和Martial，J.A.et al.[Science，205，pp.602-607(1979)]确定之人生长激素基因序列，合成正向引物[5’-ATGGCTACAGGCTCCCGGAC-3’(序列编号10)]和反向引物[5’-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3’序列编号11)]的引物，进行PCR反应(条件是每个循环94℃1分钟，退火55℃1分钟，72℃1分钟，35个循环)得到PCR产物，将该PCR产物即人生长激素(hGH)DNA，在pGEM-T载体(Promega公司出品)上进行克隆。
◆使用5’-TTCCCAACCATTCCCTTATC-3’(序列编号12)的正向引物，5’-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3’(序列编号11)的反向引物作为引物。
◆PCR的反应条件设定为25个循环，每个循环为变性94℃1分钟，退火55℃1分钟，DNA链延长72℃30秒。
(4)MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1融合DNA的获得除以下步骤外，按上述(1)同样地获得了末端平整的融合DNA、MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1◆用步骤(1)得到的DNA片段MWPsp-MWPmp20和步骤(2)得到的DNA片段(His)6-接头-Cleavage 1各取适量加以混合，用DNA连接试剂盒(宝酒造出品)在16℃反应30分钟获得的产物作为模板DNA。
◆用5’-ACGACCTTCGATAGTGGTCGG-3’(序列编号13)作为第一次PCR反应的反向引物。
◆第一次PCR的反应条件是每次循环中变性94℃1分钟，退火53℃1分钟，DNA链的延长72℃1分钟，25个循环。
接着用ニツポンジ-ン公司出品的多聚核苷酸激酶，按说明书操作对PCR反应产物进行磷酸化。磷酸化的PCR产物用宝酒造出品的DNA连接试剂盒经限制性内切酶HinII切割后，插到载体(STRATAGENE公司出品，Blue Scrip SK-)上，用公知的方法[Molecular Cloning 2nded.，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory(1989)]转化大肠杆菌DH5α菌株，从转化子中提纯作为载体的质粒DNA。采用用于确定载体碱基序列的正向引物(M13正向引物)或反向引物(M13反向引物)决定它的碱基序列，确认形成了MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage1融合DNA。
然后，以插入了MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1融合DNA的载体作为模板，采用正向引物[5’-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3’(序列编号5)]和反向引物[5’-ACGACCTTCGATAGTGGTCGG-3’(序列编号13)]，在上述同样的条件下进行第2次PCR反应，获得平整末端的融合DNA即MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1。
(5)插入了MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH22Kd 融合DNA的载体的获得除以下步骤外，按上述(4)同样的步骤获得融合DNA，即插入了MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH22kd的载体(phGH)◆将步骤(4)得到的融合DNA，MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1和步骤(3)得到的DNA片段GH22kd各取适量加以混合，用DNA连接试剂盒(宝酒造出品)在16℃反应30分钟获得的产物作为模板DNA。
◆ 采用5’-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3’(序列编号5)作正向引物，和5’-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3’(序列编号11)作反向引物作为引物。
◆PCR的反应条件是每次循环中变性94℃1分钟，退火53℃1分钟，DNA链的延长72℃1分钟，25个循环。
实施例2插入了MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 1-GH22kd融合DNA的载体的构建以实施例1所得到的融合DNA即MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH22kd为模板，用5’-GACTATGATATCCCGACCACT-3’(序列编号14)的正向引物，5’-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3’(序列编号11)的反向引物，扩增DNA片段接头-Cleavage 1-GH22kd。然后通过组合实施例1所记载的连接反应和PCR反应，将由实施例1(1)所得之DNA片段MWPsp-MWPmp20与接头-Cleavage 1-GH22kd的DNA片段得到插入了融合DNAMWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 1-GH22kd的载体。
实施例3插入了MWPsp-MWPmp20-Cleavage 1-GH22kd融合DNA的载体的构建以实施例1所得到的融合DNA即MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH22kd为模板，用5’-ATCGAAGGTCGTTTCCCAACC-3’(序列编号15)的正向引物，5’-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3’(序列编号11)的反向引物，扩增了DNA片段Cleavage 1-GH22kd。然后通过组合实施例1记载的连接反应和PCR反应，由实施例1(1)所得之DNA片段MWPsp-MWPmp20与Cleavage 1-GH22kd的DNA片段得到插入了融合DNA MWPsp-MWPmp20-Cleavage 1-GH22kd的载体。
实施例4插入了MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH20kd融合DNA的载体的构建以实施例1所得到的融合DNA即MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH22kd为模板，用5’-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3’(序列编号5)的正向引物，用5’-AAACTCCTGGTAGGTGTCAAA-3’(序列编号16)的反向引物，扩增DNA片段MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH(A)，还用5’-AACCCCCAGACCTCCCTCTGT-3’(序列编号17)的正向引物，用5’-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3’(序列编号11)的反向引物，扩增DNA片段GH(B)。然后通过组合实施例1所记载的连接反应和PCR反应，由这两个DNA片段得到插入了融合DNA MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH20kd的载体。
实施例5插入了MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 1-GH20kd融合DNA载体的构建以实施例2所得到的融合DNA即MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 1-GH22kd为模板，用5’-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3’(序列编号5)的正向引物，用5’-AAACTCCTGGTAGGTGTCAAA-3’(序列编号16)的反向引物，扩增DNA片段MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage1-GH(A)，还用5’-AACCCCCAGACCTCCCTCTGT-3’(序列编号17)的正向引物，用5’-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3’(序列编号11)的反向引物，扩增DNA片段GH(B)。然后通过组合实施例1记载的连接反应和PCR反应，由这两个DNA片段得到插入了融合DNA MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 1-GH20kd的载体。
实施例6插入了MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 2-GH22kd融合DNA的载体的构建以与实施例1(2)相同的方法，化学合成编码氨基酸序列His-His-His-His-His-His-Asp-Tyr-Asp-Ile-Pro-Thr-Thr-Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly(序列编号18)的5’-CATCATCATCATCATCACGACTATGATATCCCGACCACTGAAAACCTGTACTTCCAAGGT(序列编号19)的正向寡核苷酸，5’-ACCTTGGAAGTACAGGTTTTCAGTGGTCGGGATATCATAGTCGTGATGATGATGATGATG-3’(序列编号20)的反向寡核苷酸，获得DNA片段(His)6-接头-Cleavage 2。然后通过组合实施例1记载的连接反应，由实施例1获得的DNA片段MWPsp-MWPmp20和(His)6-接头-Cleavage 2得到融合DNA MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 2。
再采用同样的方法由这样得到的融合DNA与实施例1(3)得到的DNA片段GH22kd获得插入了融合DNA MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 2-GH22kd的载体。
实施例7插入了MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 2-GH22kd融合DNA的载体的构建以实施例6得到的融合DNA MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage2-GH22kd为模板，用5’-GACTATGATATCCCGACCACT-3’(序列编号14)的正向引物，用5’-CTA GAAGCCACAGCTGCCCT-3’(序列编号11)的反向引物，扩增DNA片段接头-Cleavage 2-GH22kd。然后通过组合实施例1记载的连接反应物PCR反应，由实施例1(1)所得之DNA片段MWPsp-MWPmp20与接头-Cleavage 2-GH22kd的DNA片段得到插入了融合DNA MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 2-GH22kd的载体。
实施例8插入了融合DNA MWPsp-GH22kd的载体的构建用短小芽孢杆菌(Bacillus brevis 47-5Q菌株)的基因组DNA840ng为模板，用5’-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3’(序列编号5)的正向引物，用5’-TGCGAAAGCCATTGGAGCAAC-3’(序列编号21)的反向引物，扩增DNA片段MWPsp。然后通过组合实施例1记载的连接反应和PCR反应，由DNA片段MWPsp与由实施例1(3)所得之DNA片段GH22kd得到插入了融合DNA MWPsp-GH22kd的载体。
实施例9融合蛋白之表达分泌与解析(1)融合物的氨基酸和碱基序列实施例1～8所得到的融合物的氨基酸和碱基序列分别给予以下所示的编号。
MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH22kd(序列编号22、30)MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 1-GH22kd(序列编号23、31)MWPsp-MWPmp20-Cleavage 1-GH22kd(序列编号24、32)MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH20kd(序列编号25、33)MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 1-GH20kd(序列编号26、34)MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 2-GH22kd(序列编号27、35)MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 2-GH22kd(序列编号28、36)MWPsp-GH22kd(序列编号29、37)
(2)融合物的表达分泌用实施例1～8得到的各种融合DNA表达它们所编码的融合蛋白质。其代表性的实施例如图1所示，是把MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH22kd插入到表达载体中的方式。
此方法就是把实施例1～8得到的插入了各种融合DNA的载体，用限制性内切酶ApaL I和Hind III(DNA相对于确定融合碱基序列用M13引物被正向插入时)或ApaL I和kpn I(相对于M13引物被反向插入时)处理，然后进行0.8％琼脂糖凝胶，切割出含有各种融合DNA的DNA片段。含有把切出的DNA片段和序列编号为40的MWP的启动子，以及SD序列的短小芽孢杆菌表达载体pNU211R2L5(参见日本公开专利平成5年-304962号公报)用ApaL I和Hind III(反向插入的融合DNA时则是Kpn I)切割，各取适量切割后的产物加以混合，用宝酒造出品的DNA连接试剂盒在16℃反应30分钟，从而把融合DNA插入到表达载体上。用所得到的表达载体，按公知的方法[Method inEnzymol.，217，23(1993)]转化短小芽孢杆菌(Bacillus brevis 47-5Q菌株(FERM P-7224日本公开专利昭和60年-58074号公报、公开专利昭和62年-201589号公报)，接种在T2琼脂培养基(T2琼脂培养基聚蛋白胨1％，肉膏0.5％，酵母膏0.2％，尿嘧啶0.1mg/ml，葡萄糖1％，红霉素10μg/ml，琼脂1.5％，pH7)中获得转化子。
转化子在T2培养基(从T2琼脂培养基除去琼脂的培养基)中37℃培养1天后，用公知的方法[Molecular Cloning 2nded.，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)]提纯质粒DNA，用ApaL I和Hind III(或Kpn I)处理，确认各融合DNA已经插入。对于已确认插入了融合DNA的转化子，试验表达分泌由插入的融合DNA编码的融合蛋白质。
方法是把用T2培养基在37℃培养1天的菌悬液，以1/1000的比例加入液体培养基(聚蛋白胨3％，酵母膏0.4％，葡萄糖3％，MgSO4·7H2O 0.01％，MnSO4·4H2O 0.001％，红霉素10μg/ml，pH8)中，分装在试管(2ml/20ml试管)或三角瓶(50ml/500ml三角瓶)中30℃培养4天。
培养结束后，培养液经15000rpm离心2分钟得到培养上清液，按公知方法(Laemmli，U.K.，Nature，227，pp.680-685)以电泳法分析蛋白质。具体做法是在10μl培养上清液中加入1μl缓冲液1[125mMTris-HCl(pH6.8)，20％甘油，4％SDS，10％2-巯基乙醇]，煮沸5分钟，再加2μl缓冲液2[250mM Tris-HCl(pH6.5)，50％甘油，0.5％BPB]，用市售的15/25％SDS聚丙烯酰胺凝胶进行(第一化学公司制)电泳(电泳缓冲液100mM Tris，100mM Tricine，0.1％SDS)，电泳后用考马斯亮蓝染色，检测有无表达分泌。
图2表示的是使各种融合体表达、在培养基中分泌的蛋白质的SDS-PAGE图象。把人生长激素基因紧连MWP信号肽后所得到的MWPsp-GH22kd的SDS-PAGE图象(第3泳道)与完全不含外源蛋白基因的pNU211R2L5(第2泳道)是相同的，但是在MWPsp后面直接配置Leader、(His)6、接头和Cleavage的氨基酸序列而配置有人生长激素基因的融合体，融合蛋白(箭头)的显著表达分泌被发现(第4～10泳道)。对于22kd人生长激素而言，如MWPsp-MWPmp-Cleavage 1-GH22kd(第4泳道)、MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 1-GH22kd(第5泳道)、MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH22kd(第6泳道)所示，通过在Cleavage 1-GH22kd序列前装配接头，则融合蛋白质分泌量明显增加。此外，通过在接头-Cleavage 1-GH22kd前装配(His)6序列，进一步增加了分泌量。配置(His)6的效果，从MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 2-GH22kd(第9泳道)、MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 2-GH22kd(第10泳道)也可看出。另一方面，在20kd的人生长激素的MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage l-GH20kd(第7泳道)和MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH20kd(第8泳道)中也可以看出通过配置(His)6而显著增加分泌量的作用。
(3)人生长激素的免疫学鉴定用免疫学方法之一的蛋白质免疫印迹法对人生长激素进行了鉴定。把在实施例9(2)中所得到的各种转化子经过培养，得到的培养液经15000rpm离心2分钟得到培养上清液，取此上清液15μl按与实施例9(2)所用相同的方法电泳后，用公知的方法[Towbin，H.等人76，4350-4354(1979)]用电印在硝酸纤维素膜上。然后将膜浸泡在溶于缓冲液3(20mM Tris-HCl(pH7.4)，150mM NaCl，0.1％Tween20)配成的5％的脱脂奶粉溶液中15分钟，然后放在用缓冲液3稀释2000倍的兔抗人生长激素(Biostride公司出品)液中振荡浸泡30分钟。然后，用缓冲液3振荡清洗3次，每次10分钟。再浸泡在用缓冲液3稀释2000倍的经过氧化氢酶标记的抗兔IgG抗体(E-Y Laboratories公司出品)液中振荡30分钟。
完成浸泡后，用缓冲液3进行振荡清洗3次，每次10分钟，用アマシヤム公司出品的ECL检测试剂盒检查人生长激素存在与否。方法按操作说明书。如图3所示，除完全没有插入GH基因序列的pNU211R2L5(第一泳道)外的所有融合体，即MWPsp-GH22kd(第2泳道)、MWPsp-MWPmp20-Cleavage 1-GH22kd(第3泳道)、MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 1-GH22kd(第4泳道)、MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH22kd(第5泳道)、MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 1-GH20kd(第6泳道)、MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH20kd(第7泳道)、MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 2-GH22kd(第8泳道)、MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 2-GH22kd(第9泳道)中，均有与抗人生长激素抗体反应的融合蛋白的明显信号(箭头所指)检出。可以看出，箭头的显色带按MWPsp-MWPmp20-Cleavage 1-GH22kd(第3泳道)、MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 1-GH22kd(第4泳道)、MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH22kd(第5泳道)3的顺序浓密，分泌量增多。也就是说，接头单独或接头与(His)6共存时有增加分泌量的效果。即使对于切断方式Cleavage 2的融合体，当接头单独或接头与(His)6同时存在(第9泳道)的情况下，比接头单独(第8泳道)存在时更有增加分泌量的效果。此外，GH20kd的融合体的分泌量比GH22kd的要少。而且接头与(His)6一起的效果不明显。另一方面，对于在MWP的信号肽后面直接连接人生长激素基团的MWPsp-GH22kd而言，信号微弱，说明分泌量非常少。
(4)用高效液相色谱(HPLC)定量人生长激素的表达量对于使用Cleavage 1的融合体，即MWPsp-MWPmp20-Cleavage1-GH22kd、MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 1-GH22kd和MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH22kd，通过用HpLC定量培养基中人生长激素，并同时与阴性对照pNU211R2L5和在MWP信号肽基因后直接连接GH22kd基因而成的MWPsp-GH22kd相比较，调查了Leader在MWPmp20、接头和(His)6中的分泌量的效果。
培养在实施例9(2)中所得到的各种转化子，得到的培养液经15000rpm离心20分钟得到上清液194μl，加入6μl 6N HCl混合，再经15000rpm离心10分钟。上清液用0.22μm的滤膜过滤，应用于经过0.1％TFA/45％乙腈平衡过的C4柱(Waters Symmetry300 4.6×250mm，5μm)，用0.1％TFA/45-73％乙腈洗脱。当用2％/分的比例提高乙腈浓度时，在20.35分钟附近出现一个峰，并定量这个峰。图4表示的是各克隆的培养基每升中分泌的生长激素的定量值。发现MWPsp-22kd(B柱)中仅有微少的分泌，但如果在MWP信号肽MWPsp和GH22kd之间插入Leader(MWPmp20)-Cleavage 1(C柱)、Leader(MWPmp20)-接头-Cleavage 1(D柱)，或Leader(MWPmp20)-(His)6-接头-Cleavage 1(E柱)，则分泌量增加。
实施例10从融合蛋白质切割并分析人生长激素将含有插入了MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH22kd、MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH20kd和MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 2-GH22kd等融合DNA的表达载体的转化子培养一夜，所得培养液以1/1000的比例，接种到装有50ml培养基的500ml三角瓶中(共10个)，30℃培养4天，其中培养基成分与实施例9(2)中表达中所用的相同。所得培养液在4℃以9500rpm离心20分钟。在得到的培养上清液中加入最终浓度为40％的硫酸铵，在4℃放置1小时以上，再在4℃以9500rpm离心20分钟。在沉淀物中加入1/2体积的蒸馏水溶解，再以20000rpm离心20分钟。将上清液上样到20mM磷酸缓冲液(pH8)平衡的镍螯合柱(ChelatingSepharose HP，Amersham Pharmacia Biotech)中而吸附到树脂上，用90mM的咪唑洗脱，得到含有融合蛋白的级分。然后在该级分中分别加入尿素和异丙醇，使其各自的浓度达到1M和20％，在4℃放置1小时以上。然后对20mMTris HCl缓冲液(pH8)/1mM EDTA透析，上样到经过相同缓冲液平衡过的阴离子交换柱(Q SepharoseHP，Amersham Pharmacia Biotech)上而吸附到树脂上，用0.05～0.3M的NaCl溶液洗脱含有所需产物生长激素的融合蛋白。
为了从融合蛋白切割出生长激素，进行以下的酶处理。对具有Cleavage 1即Ile-Glu-Gly-Arg(序列编号1)的氨基酸序列的融合蛋白，即MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH22kd、MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH20kd，在50mMTris HCl缓冲液(pH8)/100mMNaCl/5mM CaCl2中，每100μg融合蛋白加入1单位的因子Xa(Novagen)，于8℃反应6天。这样可以从融合蛋白质切出天然型的人生长激素GH22kd和GH20kd。
对具有Cleavage 2即Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly((序列编号2)的氨基酸序列的融合蛋白，即MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 2-GH22kd，在20mMTris HCl缓冲液(pH8)/1mM EDTA/10Mm DTT中，相对于每50μg融合蛋白加入1单位TEV蛋白酶(Invitrogen)，于室温(25℃)反应1昼夜(16小时)。这样可以从融合蛋白切割出氨基末端具有甘氨酸残基的人生长激素。
为了从上述反应产物中提纯人生长激素，将上述反应物上样到反相柱(Resource RPC，Amersham Pharmacia Biotech)上并使其吸附，该反相柱事先用0.1％TFA/10％乙腈平衡过。用38-52％的乙腈洗脱。再对20mMTris HCl缓冲液透析，即可获得所需要的生长激素。
把在市场出售的人生长激素(Norditropin)，以及分离纯化的天然型人生长激素22kd和20kd，以及氨基末端残留有甘氨酸残基的变异型生长激素22kd中加入最终浓度为0.5％的TFA，再上样在事先用0.1％TFA/40％乙腈平衡过的C4柱(Waters Symmetry300，4.6×250mm，5μm)上，再用0.1TFA/52-55％乙腈洗脱。洗脱曲线图如图5所示。
天然型人生长激素22kd(B)、氨基末端残留有甘氨酸残基的变异型生长激素22kd(C)的洗脱峰图和市售的生长激素(A)的相同，但天然型人生长激素20kd(D)则在不同的位置上出现洗脱峰，这反映了分子量的差异。
实施例11天然型人生长激素22kd、20kd和变异型生长激素的生物活性的测定将含有通过实施例10中的HPLC洗脱出的生长激素峰的级分干固，溶解在蒸馏水中，取其一部分在上述相同条件下用HPLC洗脱，根据所得到的峰面积求得浓度。此时用市售生长激素的峰面积为标准，用0.25％BSA/0.9NaCl％溶液调整了各生长激素的浓度。用它们进行以下的生物活性试验。人生长激素的生物活性通过在切除脑下垂体的大鼠中施用后对生长的影响来研究。每只摘除脑下垂体后第4天的35日龄雌性Wistar系大鼠，每4天皮下给用0.05单位的待测样品，每组7只。作为阴性对照，施用0.25％BSA/0.9％NaCl溶液。投药后第4天杀死大鼠，取出大腿骨测量骨长。一并测定了投药期间的体重。用学生氏t检验方法检测显著差异。图6表示了投药后体重改变的情况。阴性对照没有观察到体重增加，而被测定样品，包括氨基末端有甘氨酸残基的变异型GH22kd、天然型GH22kd和天然型GH20kd都和阳性对照一样有增加体重的效果。
在大腿骨骨长测量上，也看到投以被测定样品的动物，与阳性对照一样有增加骨长的作用(图7)。
工业实用性如上所述，凭借本发明，建立了大幅度增加基因重组人生长激素产量，大量生产有活性的天然型人生长激素及其功能性片段、变异体或类似物的技术。
序列表<110>伊藤火腿株式会社(ITOHAM FOODS INC.)<120>用于生长激素高表达的DNA及其应用(DNA for high expression of growth hormone，and use thereof)<130>SCT034073-47<160>43<210>1<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Cleavage 1用作融合蛋白与因子Xa的切割位点生成GH<400>1Ile Glu Gly Arg1<210>2<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Cleavage 2用作融合蛋白与TEV蛋白酶的切割位点生成GH<400>2Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly1 5<210>3<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>有效产生GH的候选接头
<400>3Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr1 5<210>4<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>候选Cleavage用作融合蛋白与TEV蛋白酶的切割位点生成GH<400>4Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser1 5<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于在其5′端PCR扩增含有MWPsp-MWPmp20的DNA的正向引物<400>5gtcgttaaca gtgtattgct20<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR扩增MWPsp-MWPmp20 DNA的反向引物<400>6tacggttttt tccatatcag c 21<210>7
<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>含有接头和Cleavage、(His)6-接头-Cleavage 1的设计肽<400>7His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Ile Glu Gly1 5 10 15Arg<210>8<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>编码(His)6-接头-Cleavage 1的正向寡核苷酸<400>8catcatcatc atcatcacga ctatgatatc ccgaccacta tcgaaggtcg t51<210>9<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>编码(His)6-接头-Cleavage 1的反向寡核苷酸<400>9acgaccttcg atagtggtcg ggatatcata gtcgtgatga tgatgatgat g51<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR扩增编码GH22kd的DNA的正向引物
<400>10atggctacag gctcccggac 20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于在其3′端PCR扩增包括编码GH22kd的序列的DNA的反向引物<400>11ctagaagcca cagctgccct 20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR扩增GH22kd的正向引物<400>12ttcccaacca ttcccttatc 20<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR扩增命名为MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1的融合DNA的反向引物<400>13acgaccttcg atagtggtcg g 21<210>14<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR扩增融合DNA为接头-Cleavage 1-GH22kd的正向引物<400>14gactatgata tcccgaccac t21<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR扩增融合DNA为Cleavage 1-GH22kd的正向引物<400>15atcgaaggtc gtttcccaac c21<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR扩增命名为MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 1-GH(A)的DNA片段的反向引物<400>16aaactcctgg taggtgtcaa a21<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR扩增编码人生长激素片段GH(B)的DNA的正向引物<400>17aacccccaga cctccctctg t21
<210>18<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>设计的融合蛋白，(His)6-接头-Cleavage 2<400>18His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu1 5 10 15Tyr Phe Gln Gly20<210>19<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>编码(His)6-接头-Cleavage 2的正向寡核苷酸<400>19catcatcatc atcatcacga ctatgatatc ccgaccactg aaaacctgta cttccaaggt 60<210>20<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>编码(His)6-接头-Cleavage 2的反向寡核苷酸<400>20accttggaag tacaggtttt cagtggtcgg gatatcatag tcgtgatgat gatgatgatg 60<210>21<211>21<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>用于PCR扩增MWPsp的反向引物<400>21tgcgaaagcc attggagcaa c 21<210>22<211>248<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>融合蛋白命名为MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH22kd<400>22Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro1 5 10 15Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro Lys Met20 25 30Asp Ala Asp Met Glu Lys Thr Val His His His His His His Asp Tyr35 40 45Asp Ile Pro Thr Thr Ile Glu Gly Arg Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser50 55 60Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu65 70 75 80Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu85 90 95Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser100 105 110Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser115 120 125Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu130 135 140Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr145 150 155 160Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu165 170 175Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr180 185 190Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His195 200 205
Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg210 215 220Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg225 230 235 240Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe245<210>23<211>242<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>融合蛋白命名为MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 1-GH22kd<400>23Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro1 5 10 15Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro Lys Met20 25 30Asp Ala Asp Met Glu Lys Thr Val Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Ile35 40 45Glu Gly Arg Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala50 55 60Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln65 70 75 80Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu85 90 95Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro100 105 110Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg115 120 125Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu130 135 140Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn145 150 155 160Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met165 170 175Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln180 185 190Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu195 200 205Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val
210 215 220Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys225 230 235 240Gly Phe<210>24<211>235<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>融合蛋白命名为MWPsp-MWPmp20-Cleavage 1-GH22kd<400>24Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro1 5 10 15Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro Lys Met20 25 30Asp Ala Asp Met Glu Lys Thr Val Ile Glu Gly Arg Phe Pro Thr Ile35 40 45Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu50 55 60His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile65 70 75 80Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu85 90 95Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln100 105 110Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln115 120 125Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser130 135 140Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp145 150 155 160Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser165 170 175Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr180 185 190Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr195 200 205Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val210 215 220Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
225 230 235<210>25<211>233<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>融合蛋白命名为MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH20kd<400>25Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro1 5 10 15Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro Lys Met20 25 30Asp Ala Asp Met Glu Lys Thr Val His His His His His His Asp Tyr35 40 45Asp Ile Pro Thr Thr Ile Glu Gly Arg Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser50 55 60Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu65 70 75 80Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe85 90 95Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys100 105 110Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp115 120 125Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val130 135 140Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu145 150 155 160Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg165 170 175Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser180 185 190His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe195 200 205Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys210 215 220Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe225 230
<210>26<211>227<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>融合蛋白命名为MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 1-GH20kd<400>26Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro1 5 10 15Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro Lys Met20 25 30Asp Ala Asp Met Glu Lys Thr Val Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Ile35 40 45Glu Gly Arg Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala50 55 60Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln65 70 75 80Glu Phe Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr85 90 95Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu100 105 110Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe115 120 125Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser130 135 140Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu145 150 155 160Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys165 170 175Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu180 185 190Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys195 200 205Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser210 215 220Cys Gly Phe225<210>27<211>251<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>融合蛋白命名为MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 2-GH22kd<400>27Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro1 5 10 15Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro Lys Met20 25 30Asp Ala Asp Met Glu Lys Thr Val His His His His His His Asp Tyr35 40 45Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Phe Pro Thr Ile50 55 60Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu65 70 75 80His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile85 90 95Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu100 105 110Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln115 120 125Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln130 135 140Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser145 150 155 160Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp165 170 175Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser180 185 190Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr195 200 205Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr210 215 220Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val225 230 235 240Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe245 250<210>28<211>245<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>融合蛋白命名为MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 2-GH22kd<400>28Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro1 5 10 15Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro Lys Met20 25 30Asp Ala Asp Met Glu Lys Thr Val Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu35 40 45Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe50 55 60Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp65 70 75 80Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr85 90 95Ser Phe Leu Gln Ash Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile100 105 110Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu115 120 125Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val130 135 140Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser145 150 155 160Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln165 170 175Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile180 185 190Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp195 200 205Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met210 215 220Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu225 230 235 240Gly Ser Cys Gly Phe245<210>29<211>211<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>融合蛋白命名为MWPsp-GH22kd<400>29Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro1 5 10 15Met Ala Phe Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn20 25 30Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr35 40 45Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe50 55 60Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr65 70 75 80Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu85 90 95Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe100 105 110Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser115 120 125Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu130 135 140Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys145 150 155 160Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu165 170 175Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys180 185 190Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser195 200 205Cys Gly Phe210<210>30<211>744<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>编码MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH22kd的设计的核苷酸序列<400>30gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60
gcagaagaag cagcaactac tacagctcca aaaatggacg ctgatatgga aaaaaccgta 120catcatcatc atcatcacga ctatgatatc ccgaccacta tcgaaggtcg tttcccaacc 180attcccttat ccaggctttt tgacaacgct atgctccgcg cccatcgtct gcaccagctg 240gcctttgaca cctaccagga gtttgaagaa gcctatatcc caaaggaaca gaagtattca 300ttcctgcaga acccccagac ctccctctgt ttctcagagt ctattccgac accctccaac 360agggaggaaa cacaacagaa atccaaccta gagctgctcc gcatctccct gctgctcatc 420cagtcgtggc tggagcccgt gcagttcctc aggagtgtct tcgccaacag cctggtgtac 480ggcgcctctg acagcaacgt ctatgacctc ctaaaggacc tagaggaagg catccaaacg 540ctgatgggga ggctggaaga tggcagcccc cggactgggc agatcttcaa gcagacctac 600agcaagttcg acacaaactc acacaacgat gacgcactac tcaagaacta cgggctgctc 660tactgcttca ggaaggacat ggacaaggtc gagacattcc tgcgcatcgt gcagtgccgc 720tctgtggagg gcagctgtgg cttc 744<210>31<211>726<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>编码MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 1-GH22kd的设计的核苷酸序列<400>31gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60gcagaagaag cagcaactac tacagctcca aaaatggacg ctgatatgga aaaaaccgta 120gactatgata tcccgaccac tatcgaaggt cgtttcccaa ccattccctt atccaggctt 180tttgacaacg ctatgctccg cgcccatcgt ctgcaccagc tggcctttga cacctaccag 240gagtttgaag aagcctatat cccaaaggaa cagaagtatt cattcctgca gaacccccag 300acctccctct gtttctcaga gtctattccg acaccctcca acagggagga aacacaacag 360aaatccaacc tagagctgct ccgcatctcc ctgctgctca tccagtcgtg gctggagccc 420gtgcagttcc tcaggagtgt cttcgccaac agcctggtgt acggcgcctc tgacagcaac 480gtctatgacc tcctaaagga cctagaggaa ggcatccaaa cgctgatggg gaggctggaa 540gatggcagcc cccggactgg gcagatcttc aagcagacct acagcaagtt cgacacaaac 600tcacacaacg atgacgcact actcaagaac tacgggctgc tctactgctt caggaaggac 660atggacaagg tcgagacatt cctgcgcatc gtgcagtgcc gctctgtgga gggcagctgt 720ggcttc 726<210>32<211>705<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>编码MWPsp-MWPmp20-Cleavage 1-GH22kd的设计的核苷酸序列<400>32gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60gcagaagaag cagcaactac tacagctcca aaaatggacg ctgatatgga aaaaaccgta 120atcgaaggtc gtttcccaac cattccctta tccaggcttt ttgacaacgc tatgctccgc 180gcccatcgtc tgcaccagct ggcctttgac acctaccagg agtttgaaga agcctatatc 240ccaaaggaac agaagtattc attcctgcag aacccccaga cctccctctg tttctcagag 300tctattccga caccctccaa cagggaggaa acacaacaga aatccaacct agagctgctc 360cgcatctccc tgctgctcat ccagtcgtgg ctggagcccg tgcagttcct caggagtgtc 420ttcgccaaca gcctggtgta cggcgcctct gacagcaacg tctatgacct cctaaaggac 480ctagaggaag gcatccaaac gctgatgggg aggctggaag atggcagccc ccggactggg 540cagatcttca agcagaccta cagcaagttc gacacaaact cacacaacga tgacgcacta 600ctcaagaact acgggctgct ctactgcttc aggaaggaca tggacaaggt cgagacattc 660ctgcgcatcg tgcagtgccg ctctgtggag ggcagctgtg gcttc 705<210>33<211>699<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>编码MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 1-GH20kd的设计的核苷酸序列<400>33gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60gcagaagaag cagcaactac tacagctcca aaaatggacg ctgatatgga aaaaaccgta 120catcatcatc atcatcacga ctatgatatc ccgaccacta tcgaaggtcg tttcccaacc 180attcccttat ccaggctttt tgacaacgct atgctccgcg cccatcgtct gcaccagctg 240gcctttgaca cctaccagga gtttaacccc cagacctccc tctgtttctc agagtctatt 300ccgacaccct ccaacaggga ggaaacacaa cagaaatcca acctagagct gctccgcatc 360tccctgctgc tcatccagtc gtggctggag cccgtgcagt tcctcaggag tgtcttcgcc 420aacagcctgg tgtacggcgc ctctgacagc aacgtctatg acctcctaaa ggacctagag 480gaaggcatcc aaacgctgat ggggaggctg gaagatggca gcccccggac tgggcagatc 540ttcaagcaga cctacagcaa gttcgacaca aactcacaca acgatgacgc actactcaag 600aactacgggc tgctctactg cttcaggaag gacatggaca aggtcgagac attcctgcgc 660atcgtgcagt gccgctctgt ggagggcagc tgtggcttc 699<210>34<211>681<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>编码MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 1-GH20kd的设计的核苷酸序列<400>34gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60gcagaagaag cagcaactac tacagctcca aaaatggacg ctgatatgga aaaaaccgta 120gactatgata tcccgaccac tatcgaaggt cgtttcccaa ccattccctt atccaggctt 180tttgacaacg ctatgctccg cgcccatcgt ctgcaccagc tggcctttga cacctaccag 240gagtttaacc cccagacctc cctctgtttc tcagagtcta ttccgacacc ctccaacagg 300gaggaaacac aacagaaatc caacctagag ctgctccgca tctccctgct gctcatccag 360tcgtggctgg agcccgtgca gttcctcagg agtgtcttcg ccaacagcct ggtgtacggc 420gcctctgaca gcaacgtcta tgacctccta aaggacctag aggaaggcat ccaaacgctg 480atggggaggc tggaagatgg cagcccccgg actgggcaga tcttcaagca gacctacagc 540aagttcgaca caaactcaca caacgatgac gcactactca agaactacgg gctgctctac 600tgcttcagga aggacatgga caaggtcgag acattcctgc gcatcgtgca gtgccgctct 660gtggagggca gctgtggctt c681<210>35<211>753<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>编码MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-Cleavage 2-GH22kd的设计的核苷酸序列<400>35gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60gcagaagaag cagcaactac tacagctcca aaaatggacg ctgatatgga aaaaaccgta 120catcatcatc atcatcacga ctatgatatc ccgaccactg aaaacctgta cttccaaggt 180ttcccaacca ttcccttatc caggcttttt gacaacgcta tgctccgcgc ccatcgtctg 240caccagctgg cctttgacac ctaccaggag tttgaagaag cctatatccc aaaggaacag 300aagtattcat tcctgcagaa cccccagacc tccctctgtt tctcagagtc tattccgaca 360ccctccaaca gggaggaaac acaacagaaa tccaacctag agctgctccg catctccctg 420ctgctcatcc agtcgtggct ggagcccgtg cagttcctca ggagtgtctt cgccaacagc 480ctggtgtacg gcgcctctga cagcaacgtc tatgacctcc taaaggacct agaggaaggc 540atccaaacgc tgatggggag gctggaagat ggcagccccc ggactgggca gatcttcaag 600cagacctaca gcaagttcga cacaaactca cacaacgatg acgcactact caagaactac 660gggctgctct actgcttcag gaaggacatg gacaaggtcg agacattcct gcgcatcgtg 720cagtgccgct ctgtggaggg cagctgtggc ttc 753<210>36
<211>735<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>编码MWPsp-MWPmp20-接头-Cleavage 2-GH22kd的设计的核苷酸序列<400>36gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60gcagaagaag cagcaactac tacagctcca aaaatggacg ctgatatgga aaaaaccgta 120gactatgata tcccgaccac tgaaaacctg tacttccaag gtttcccaac cattccctta 180tccaggcttt ttgacaacgc tatgctccgc gcccatcgtc tgcaccagct ggcctttgac 240acctaccagg agtttgaaga agcctatatc ccaaaggaac agaagtattc attcctgcag 300aacccccaga cctccctctg tttctcagag tctattccga caccctccaa cagggaggaa 360acacaacaga aatccaacct agagctgctc cgcatctccc tgctgctcat ccagtcgtgg 420ctggagcccg tgcagttcct caggagtgtc ttcgccaaca gcctggtgta cggcgcctct 480gacagcaacg tctatgacct cctaaaggac ctagaggaag gcatccaaac gctgatgggg 540aggctggaag atggcagccc ccggactggg cagatcttca agcagaccta cagcaagttc 600gacacaaact cacacaacga tgacgcacta ctcaagaact acgggctgct ctactgcttc 660aggaaggaca tggacaaggt cgagacattc ctgcgcatcg tgcagtgccg ctctgtggag 720ggcagctgtg gcttc 735<210>37<211>633<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>编码MWPsp-GH22kd的设计的核苷酸序列<400>37gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60ttcccaacca ttcccttatc caggcttttt gacaacgcta tgctccgcgc ccatcgtctg 120caccagctgg cctttgacac ctaccaggag tttgaagaag cctatatccc aaaggaacag 180aagtattcat tcctgcagaa cccccagacc tccctctgtt tctcagagtc tattccgaca 240ccctccaaca gggaggaaac acaacagaaa tccaacctag agctgctccg catctccctg 300ctgctcatcc agtcgtggct ggagcccgtg cagttcctca ggagtgtctt cgccaacagc 360ctggtgtacg gcgcctctga cagcaacgtc tatgacctcc taaaggacct agaggaaggc 420atccaaacgc tgatggggag gctggaagat ggcagccccc ggactgggca gatcttcaag 480cagacctaca gcaagttcga cacaaactca cacaacgatg acgcactact caagaactac 540gggctgctct actgcttcag gaaggacatg gacaaggtcg agacattcct gcgcatcgtg 600cagtgccgct ctgtggaggg cagctgtggc ttc 633
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<211>217<212>PRT<213>智人<300>
<303>基因组<304>4<306>479-497<307>1989<400>39Met Ala Ala Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu1 5 10 15Cys Leu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu20 25 30Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala Arg Arg Leu Tyr Gln35 40 45Leu Ala Tyr Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Leu Lys50 55 60Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe65 70 75 80Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Val Lys Thr Gln Gln Lys85 90 95Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Set Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp100 105 110Leu Glu Pro Val Gln Leu Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val115 120 125Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Arg His Leu Lys Asp Leu Glu130 135 140Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Trp Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg145 150 155 160Thr Gly Gln Ile Phe Asn Gln Ser Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Lys Ser165 170 175His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe180 185 190Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys195 200 205Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe210 215<210>40<211>1200<212>DNA
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<221>misc_特征/注释＝″转录起始位点2″<222>374<220>
<221>misc_特征/注释＝″转录起始位点3″<222>444<220>
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160 165 170act cct aac aat gca gca act cgt ggc gat atc ttc aaa atg ctc gac 1181Thr Pro Asn Asn Ala Ala Thr Arg Gly Asp Ile Phe Lys Met Leu Asp175 180 185aac gct ctt cgc gta gac ctg atg gag caa gtt gaa ttc 1220Asn Ala Leu Arg Val Asp Leu Met Glu Gln Val Glu Phe190 195 200<210>41<211>4330<212>DNA<213>短小芽孢杆菌(Bacillus brevis)<220>
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<221>misc_特征/注释＝″转录起始位点5″<222>521<300>
<303>J.Bacteriol.
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90 95 100ggt ttt gta aac gta gct tcc ggt gaa gaa atc gta aaa ggt ttc ccg991Glv Phe Val Asn Val Ala Ser Gly Glu Glu Ile Val Lys Gly Phe Pro105 110 115gac aaa tct ttt aaa cca caa aac caa gtt act tat gct gaa gca gta1039Asp Lys Ser Phe Lys Pro Gln Asn Gln Val Thr Tyr Ala Glu Ala Val120 125 130acc atg atc gtt cgt gct ttg ggt tat gag cca tcc gtt cga ggt gta1087Thr Met Ile Val Arg Ala Leu Gly Tyr Glu Pro Ser Val Arg Gly Val135 140 145tgg ccg aac agc atg atc tcc aaa ggt tcc gaa ctg aac att gca aaa1135Trp Pro Asn Ser Met Ile Ser Lys Gly Ser Glu Leu Asn Ile Ala Lys150 155 160 165ggt atc aac aac cct aac atg cag cag ttc gcg gcg aca atc ttc aaa1183Gly Ile Asn Asn Pro Asn Met Gln Gln Phe Ala Ala Thr Ile Phe Lys170 175 180atg ctg gac aac gct ctt cgc gtt aag ctg atg gag caa atc gaa tac1231Met Leu Asp Asn Ala Leu Arg Val Lys Leu Met Glu Gln Ile Glu Tyr185 190 195ggt act gac atc cgt tta aac gta act gac gaa act ctc ttg act aaa1279Gly Thr Asp Ile Arg Leu Asn Val Thr Asp Glu Thr Leu Leu Thr Lys200 205 210tat ttg aaa gtt acc gta cgt gat atg gac tgg gct cac gaa aag ggt1327Tyr Leu Lys Val Thr Val Arg Asp Met Asp Trp Ala His Glu Lys Gly215 220 225aac aat tct gat gaa ttg cca ctt gta aca aac gta cct gct att ggt1375Asn Asn Ser Asp Glu Leu Pro Leu Val Thr Asn Val Pro Ala Ile Gly230 235 240 245ctg ggt agt ttg aaa gca aat gaa gtt act ttg aat gga aaa gat gct1423Leu Gly Ser Leu Lys Ala Asn Glu Val Thr Leu Asn Gly Lys Asp Ala250 255 260gat ctg ggt agc aac act act tat aaa gta gct gaa ggc atc aat cct1471Asp Leu Gly Ser Asn Thr Thr Tyr Lys Val Ala Glu Gly Ile Asn Pro265 270 275aac gca ttt gat ggt caa aaa gta caa gtg tgg atc aaa gat gac cga1519Asn Ala Phe Asp Gly Gln Lys Val Gln Val Trp Ile Lys Asp Asp Arg280 285 290gaa aat gtc atc gtt tgg atg gaa ggt tcc gaa gac gaa gat gtc gtt1567Glu Asn Val Ile Val Trp Met Glu Gly Ser Glu Asp Glu Asp Val Val295 300 305atg gac cgt gtg agt gct ctg tac ctg aaa ggt aaa gcc ttc aca gat1615Met Asp Arg Val Ser Ala Leu Tyr Leu Lys Gly Lys Ala Phe Thr Asp310 315 320 325gat att gta aaa gat ctt agc aag tct gat ttg gat gat gta aaa atc1663
Asp Ile Val Lys Asp Leu Ser Lys Ser Asp Leu Asp Asp Val Lys Ile330 335 340gaa atg gat ggt agc gag aaa tcg tat cgc ttg acg gaa gat acg aaa1711Glu Met Asp Gly Ser Glu Lys Ser Tyr Arg Leu Thr Glu Asp Thr Lys345 350 355atc act tat aac ttc act cgt ttc aac gat cca gta gat gct ctg agc1759Ile Thr Tyr Asn Phe Thr Arg Phe Asn Asp Pro Val Asp Ala Leu Ser360 365 370aaa att tac aaa gac aac gac acg ttt ggt gtt aaa gtt gtt ttg aat1807Lys Ile Tyr Lys Asp Asn Asp Thr Phe Gly Val Lys Val Val Leu Asn375 380 385gat aac aat gaa gtt gca tac ctc cac atc att gac gat caa aca att1855Asp Asn Asn Glu Val Ala Tyr Leu His Ile Ile Asp Asp Gln Thr Ile390 395 400 405gat aaa agc gta aaa ggc gtt aaa tac ggt tcc aaa gtt att agc aaa1903Asp Lys Ser Val Lys Gly Val Lys Tyr Gly Ser Lys Val Ile Ser Lys410 415 420atc gat gct gat aag aag aaa atc acc aac ttg gat aac tcc aaa ttt1951Ile Asp Ala Asp Lys Lys Lys Ile Thr Asn Leu Asp Asn Ser Lys Phe425 430 435agc gac ttg gaa gat cag gat gaa gga aaa gac ttc ttg gta ttc ctt1999Ser Asp Leu Glu Asp Gln Asp Glu Gly Lys Asp Phe Leu Val Phe Leu440 445 450gat ggc caa cca gct aaa ctg ggt gat ctg aaa gaa tcc gat gtt tac2047Asp Gly Gln Pro Ala Lys Leu Gly Asp Leu Lys Glu Ser Asp Val Tyr455 460 465tcg gta tac tat gct gat ggt gat aaa gat aag tac ttg gtg ttt gct2095Ser Val Tyr Tyr Ala Asp Gly Asp Lys Asp Lys Tyr Leu Val Phe Ala470 475 480 485aac cgt aac gtt gca gaa gga aaa gta gaa aaa gtg gta agc cgt aac2143Asn Arg Asn Val Ala Glu Gly Lys Val Glu Lys Val Val Ser Arg Asn490 495 500aag aca gac att cgt ctg act gtt ggt ggt aaa act tac aaa gta tat2191Lys Thr Asp Ile Arg Leu Thr Val Gly Gly Lys Thr Tyr Lys Val Tyr505 510 515cca gat gct tct tac tcc gaa aac gca aat aaa gat gtt aag aag gtt2239Pro Asp Ala Ser Tyr Ser Glu Asn Ala Asn Lys Asp Val Lys Lys Val520 525 530aat tcc gac ttg gat ctg att agc aac ctt gat gga gaa gaa gta aaa2287Asn Ser Asp Leu Asp Leu Ile Ser Asn Leu Asp Gly Glu Glu Val Lys535 540 545ctt ctc ttg gat cca tcc ggt cga gtt cgt cac atc gaa aca aaa gac2335Leu Leu Leu Asp Pro Ser Gly Arg Val Arg His Ile Glu Thr Lys Asp550 555 560 565
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790 795 800805gct gat gat ttg aaa gtt gat caa gac atc aga cgt gga gat gtc att3103Ala Asp Asp Leu Lys Val Asp Gln Asp Ile Arg Arg Gly Asp Val Ile810 815 820tct ttc aca ctg aat tct gat gga gaa gtt att gtt gac gat gta gtc3151Ser Phe Thr Leu Asn Ser Asp Gly Glu Val Ile Val Asp Asp Val Val825 830 835gag gtt gta aat aac aac cac att gat aac aet gct tct aaa tca gct3199Glu Val Val Asn Asn Asn His Ile Asp Asn Thr Ala Ser Lys Ser Ala840 845 850acg ctc atg cct gaa gac gaa cgt caa aaa gca gga atc gac aaa ttg3247Thr Leu Met Pro Glu Asp Glu Arg Gln Lys Ala Gly Ile Asp Lys Leu855 860 865gtt gtt gct cgc gtt gac gaa gtt gat ggt aac act att tcc ttg aac3295Val Val Ala Arg Val Asp Glu Val Asp Gly Asn Thr Ile Ser Leu Asn870 875 880 885tat gct gac gga aag aca caa aaa tat tac aca aaa gca tcc act gcg3343Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln Lys Tyr Tyr Thr Lys Ala Ser Thr Ala890 895 900ttc att gat gtg tat gac ggt ctt gaa gga att gat gga gta gat gaa3391Phe Ile Asp Val Tyr Asp Gly Leu Glu Gly Ile Asp Gly Val Asp Glu905 910 915ggc gac tac atc gta atg atc gat agc gcc gat att gac gga act cgc3439Gly Asp Tyr Ile Val Met Ile Asp Ser Ala Asp Ile Asp Gly Thr Arg920 925 930ttt gac tat gta ctg gta gtt tct agc gat gat gag atc cgc acg caa3487Phe Asp Tyr Val Leu Val Val Ser Ser Asp Asp Glu Ile Arg Thr Gln935 940 945cac atc tcc act aaa gca gtt acg gac ttc ctg aac aag cca acc aga3535His Ile Ser Thr Lys Ala Val Thr Asp Phe Leu Asn Lys Pro Thr Arg950 955 960 965cta tgt acc aaa tcc tgg cga tgg gga aga agt agt cac ggc acc aaa3583Leu Cys Thr Lys Ser Trp Arg Trp Gly Arg Ser Ser His Gly Thr Lys970 975 980gtt aat aca gtt aac gat gaa gca gtt gta gat ggt att gta act ctt3631Val Asn Thr Val Asn Asp Glu Ala Val Val Asp Gly Ile Val Thr Leu985 990 995cca gct gat gca tct gtt aga aac ttc aac att gca ttt gat caa gaa3679Pro Ala Asp Ala Ser Val Arg Asn Phe Asn Ile Ala Phe Asp Gln Glu100010051010att aac agc aaa gat gca acg gta act gtt act aat gaa gat acg ctt3727Ile Asn Ser Lys Asp Ala Thr Val Thr Val Thr Asn Glu Asp Thr Leu101510201025ggt aac gta acg gta tct gag gtt gcg aca gat gca aaa gta ttg agc3775
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<304>169<306>1239-1245
<307>1987<400>43gaaaggaggt ga1权利要求
1.编码一种融合蛋白的DNA，该融合蛋白由下列组分顺序连接而成从芽孢杆菌属细菌细胞壁蛋白质(CWP)氨基末端开始由一个以上氨基酸残基构成的前导肽(Leader)，用于酶切的氨基酸序列(Cleavage)，以及生长激素或它的功能性片段、变异体或类似物的氨基酸序列(GH)，并且Cleavage的氨基酸序列为Ile-Glu-Gly-Arg(Cleavage 1，序列编号1)。
2.编码一种融合蛋白的DNA，该融合蛋白由下列组分顺序连接而成从芽孢杆菌属细菌细胞壁蛋白质(CWP)氨基末端开始由一个以上氨基酸残基构成的前导肽(Leader)，用于酶切的氨基酸序列(Cleavage)，以及生长激素或它的功能性片段、变异体或类似物的氨基酸序列(GH)，并且GH为20kd人生长激素(GH20kd)。
3.编码一种融合蛋白的DNA，该融合蛋白由下列组分顺序连接而成从芽孢杆菌属细菌细胞壁蛋白质(CWP)氨基末端开始由一个以上氨基酸残基构成的前导肽(Leader)，多个组氨酸(His)残基构成的nH，用于酶切的氨基酸序列(Cleavage)，以及生长激素或它的功能性片段、变异体或类似物的氨基酸序列(GH)。
4.权利要求3记载的DNA，其中His残基数目为6个。
5.权利要求1、3或4记载的DNA，其中GH为22kd人生长激素(GH22kd)或20kd人生长激素。
6.权利要求2至4任一项记载的DNA，其中Cleavage为Ile-Glu-Gly-Arg(Cleavae 1，序列编号1)或Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly(Cleavae 2，序列编号2)。
7.权利要求1至6任一项记载的DNA，其编码在所述Cleavage的上游进一步连接了由一个以上氨基酸残基构成的接头的融合蛋白质。
8.权利要求7记载的DNA，其中所述接头为Asp-Tyr-Asp-Ile-Pro-Thr-Thr(序列编号3)。
9.权利要求1至8任一项记载的DNA，其中所述CWP为中间细胞壁蛋白[middle wall protein(MWP)]。
10.权利要求9记载的DNA，其中所述前导肽为从MWP的氨基末端到1～20位的氨基酸序列。
11.权利要求1至10任一项记载的DNA，其是在编码上述融合蛋白的DNA之5’末端上游由包含基因表达必需的启动子(Promotert)序列的DNA、在该启动子3’末端下游的SD序列(SD)以及编码芽孢杆菌属细菌细胞壁蛋白质(CWP)信号肽的DNA(CWPsp)以该顺序连接而成。
12.权利要求11记载的DNA，其中上述启动子为来自芽孢杆菌属细菌的CWP。
13.含有权利要求11或12记载的DNA的载体。
14.用权利要求13记载的载体进行转化或转染的宿主细胞。
15.权利要求14记载的宿主细胞，其为芽孢杆菌属细菌。
16.权利要求15记载的宿主细胞，其中上述芽孢杆菌属细菌为短小芽孢杆菌。
17.权利要求16记载的宿主细胞，其中上述短小芽孢杆菌为以申报编号FERM BP-7727委托的微生物。
18.重组生长激素或它的功能性片段、变异体或类似物的生产方法，其为生长激素或其动能性片段、变异体或类似物的生产方法，包括培育权利要求14至17任一项记载的宿主细胞使融合蛋白在培养基中表达，从该融合蛋白用酶法切割出生长激素或它的功能性片段、变异体或类似物的工序。
全文摘要
本发明公开了为一种融合蛋白编码的DNA，这种融合蛋白是从芽孢杆菌属细菌细胞壁蛋白质(CWP)氨基末端开始的由一个以上氨基酸残基构成的前导肽(Leader)、用于酶切的氨基酸序列(Cleavage)、及生长激素或它的功能性片段、变异体或类似物的氨基酸序列(GH)、多个组氨酸残基组成的nH，以及接头(Linker)经适当连接而成的。还公开了含有使该DNA能够表达的DNA序列的DNA、含有使其能够表达的DNA的载体、含有该载体的宿主细胞，以及用该宿主细胞生产重组生长激素的方法。
文档编号C12N15/18GK1547610SQ0281665
公开日2004年11月17日 申请日期2002年9月9日 优先权日2001年9月13日
发明者佐藤静治, 近藤雅昭, 工藤季之, 远藤广介, 渡边重明, 肋能广, 山中昌哉, 之, 介, 哉, 明, 昭 申请人:伊藤火腿株式会社, 鹈高重三