控制植物叶片平均寿命的基因和一种采用该基因控制植物平均寿命的方法

专利名称：控制植物叶片平均寿命的基因和一种采用该基因控制植物平均寿命的方法
技术领域：
本发明一般的涉及一种调控植物叶片寿命的基因和一种采用该基因调控植物寿命的方法。更特别的是，涉及调控植物叶片寿命的ORE7基因，其核酸序列为SEQ ID NO1，以及一种调控植物寿命的方法，通过将ORE7基因导入植物并使其过量表达，从而推迟植物的衰老。
背景技术：
衰老是植物生一生的最后阶段。衰老的开始可以被认为是植物发育过程中的迅速的转折点。在衰老进程中，植物的合成能力逐渐降低，同时细胞内环境平衡被打破，细胞内结构和细胞内大分子的不断降解，最终导致死亡(Matile P.et al.，Elservier，413-440，1992；Nooden L.D.etal.，Academic press，1988；Thiman K.V.et al.，CRC press，85-115，1980；and Thomas H.et al.，Annu.Rev.Plant Physiol.，123193-219，1993)。这种植物的衰老是一系列连续的生物化学和生理学现象，是细胞，组织和器官水平上，由遗传注定的高度复杂和有效的方式。然而植物的衰老被视为一种细胞降解过程，同时还包括，在植物发育过程中为了适应环境而主动获得的遗传特征，和包括在冬季营养物质从生长器官向发育器官的迁移。
对植物衰老的抑制不仅自身在科学研究方面有重要的意义，而且在农作物产量或提高收获后期存储效率方面有巨大的工业意义。基于这个原因，遗传学，分子生物学，生理学和生物化学领域都在建立植物衰老现象方面开展了积极的研究。但是，有关植物生长素方面的报告是主要的感兴趣的领域；对衰老调控方面的研究，比如，至今，采用衰老调控基因诱导衰老调控方面的研究还不充分。
细胞激动素，一种植物生长激素，被认为是一种能从生理上延长衰老的激素。基于此，已有通过调控细胞激动素的合成来推迟衰老方面的研究，但是存在的问题是由于激素的影响，其他的生理行为也受到了影响。但是，通过一种将IPT基因联接至衰老特定SAG12基因启动子的从而使细胞激动素在衰老阶段获得特定调控的方法，最近在推迟衰老进程方面取得了成功。在通过这种方法使烟草植物的衰老推迟的例子中，当在开花期产生很少或不产生变化以及没有其他变形存在时，其产量增加高达50％(Gan S.et al.，Science，221986-1988，1995)。此外，在推迟衰老的植物开发中，成熟的西红柿是开发的主要方向。对于这种开发，采用了如下方法；抑制乙烯——一种在衰老中扮演重要角色的植物生长素的合成，或降低细胞内乙烯的总量(Klee et al.，Plant Cell，3(11)1187-93，1991；and Picton et al.，Plant Physiol.，103(4)1471-1472，1993)。
此外，在推迟衰老方面的研究主要集中于降解相关基因的操纵，该基因与发生在衰老过程中的生物化学变化十分相关或涉及信号传导系统。与这样的研究相联系的典型的例子包括一种称为“Flavr savr”商业化的西红柿，在该例子中采用反义DNA使参与降解细胞壁的聚半乳糖醛酸酶基因的表达被抑制，从而防止了西红柿的变软，从而提高了西红柿运输和存储方面的性能(Giovannoni et al.，Plant Cell，1(1)53-63，1989)。同样有报道，当通过反义DNA抑制与脂质降解相关的磷脂酶D的表达时，由植物激素造成的衰老被推迟(Fan et al.，PlantCell，9(12)2183-96，1997)。此外，最近在烟草植物中有叶片衰老推迟方面的报道，其中SAG12启动子，和knl(knotted 1)——玉米的同源框基因得到表达(Ori et al.，Plant Cell，11917-927，1999)。
然而，存在一种能更直接调控衰老的方法包括分离衰老相关的突变基因，和分析导致突变的基因。根据现存的报告，已知在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，乙烯受体的表达被控制于水果成熟期或花朵衰老期(Payton S.et al.，Plant Mol.Biol.，31(6)1227-1231，1996)，同时clp基因的表达被控制于叶片衰老期。最近的报道涉及识别与叶片衰老有关的基因研究(Oh S.A.et al.，Plant Mol.Biol.，30(4)739-754，1996)，和从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中分离叶片衰老延迟突变基因的研究(Oh S.A.et al.，The Plant Journal，12(3)527-535，1997)。同时，一突变基因已成功的从叶片衰老延迟突变株的ore9突变体中分离出(Woo H.R.et al.，Plant Cell，131779-1790，2001)。此外，还报道了启动子senl的活性，和一种衰老相关基因(Oh S.A.，et al.，Journal ofPlant Physiology 151339-345，1997)。然而，到目前为止，直接调控衰老的基因及其功能方面的研究还不充分。

发明内容
因此，本发明的目的为提供一种调控植物叶片寿命的基因。
本发明的另一目的为提供一种采用该基因调控植物叶片寿命的方法。
为了达到本发明的目的，本发明提供了ORE7基因用于调控植物叶片的寿命，其核酸序列为SEQ ID NO1。
此外，为了达到本发明的另一目的，本发明还提供了一种调控植物寿命的方法，其中将ORE7基因导入植物并过量表达，从而延迟了植物的衰老。
正如此处所用到的，术语“寿命延长突变体ore7”或“ore7突变体”表示一突变体的ORE7基因通过标记激活方法被激活，从而突变体表现为衰老延迟突变现象。
在下文中，本发明将被进一步详述。
在本发明中，为了调查涉及植物寿命调控的基因，显示寿命延长特性的突变体被选择出。基于此，常常用于植物遗传和分子方面研究主体的拟南芥(Arabidopsis thaliana)被用作测试植物。
一般用于确定基因功能的突变诱导方法被特定的分成如下三种方法(1)通过用化学药品，例如乙基-甲基磺酸(EMS)处理诱导突变的化学方法，(2)通过X-或γ-射线辐射诱导突变的方法，和(3)一种通过土壤细菌Agrobacterium的T-DNA转化诱导突变的方法。如上文所述的通过化学药品处理，X-或γ-射线辐射或T-DNA插入的诱导突变体的方法，破坏了原始基因的一部分或全部，从而使基因原有的功能缺失了。因此，通过上述方法基因的功能能被减除。然而，通过这些方法诱导的突变通常为隐性突变，同时，如果有与被破坏的基因功能相同的其他基因也存在于基因组中，则由于其他类似基因的存在，表型也不会显现出。此外，如果被破坏的基因为关键基因，则缺点在于导致植物死亡。
相反的，在本发明中所采用的标记激活方法的优点在于即使具有双重功能的基因还在拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组的其他位点存在，该方法仍然能诱导表型出现，这是因为T-DNA人为的激活基因在植物中的表达，同时又不破坏基因的核酸序列(Weigel et al.，PlantPhysiology，1221003-1014，2000)。更特别的是，标记激活方法采用了标记激活载体，该载体携带有一选择标记，一在E.coli中复制所必须的复制起点，和一存在于T-DNA内部的氨苄青霉素抗性基因，用于分离周围的DNA，形成T-DNA边界。此外，标记激活载体含有4个35SCaMV增强子，位于T-DNA的右边。因此，当T-DNA插入植物基因组中时，它激活了T-DNA插入位点周围的基因，从而诱导了突变(见图6)。在这种情况下，即使基因组中还存在功能类似的其他基因，由于增强子激活了基因，从而显现出相应的表型。因此，为了确定衰老调控基因而采用标记激活方法时，有很高的可能性调查出新的衰老调控基因，而通常采用缺失功能突变的方式则无法获得。此外，标记激活方法的优点在于其诱导了显性突变，从而预先在一代中观察到了突变表型。因此，本发明人从由标记激活方法产生的拟南芥(Arabidopsisthaliana)突变体中筛选出具有延长叶子寿命的突变体，同时调查涉及延长寿命的突变体基因。
在本发明的一实施例中，为了从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中筛选出延长了叶片寿命的突变体，采用标记激活载体pSKI015来产生突变体。然而，对于成年个体来说，存在较缓慢变黄率的个体是通过裸眼来选择的，被命名为“ore7”。随后，为了验证ore7突变体的寿命延长特性，检验了光合作用活性和叶绿素含量的变化。结果显示，在野生型中，在萌芽后40天(DAG)，光合作用活性和叶绿素含量完全消失，但是在相同时期的寿命延长突变体ore7中，大约保存了100％的光合作用活性和大约78％的叶绿素含量(见

图1B和1C)。
在本发明的另一实施例中，为了验证ore7突变体中寿命的延长不仅从生理水平还从基因水平被影响，通过northern杂交分析检验了各种衰老相关基因的表达形式。结果表明，在野生型中，已知的在衰老阶段表达量增加的SEN4和SAG12基因，在衰老进程中快速的增加，但是在ore7突变体中，这些衰老相关基因的表达量没有显著的增加。相反的，在野生型例子中，在同化作用，例如光合作用中增加的叶绿素a/b结合蛋白基因的表达量随着衰老的进程显著降低，但是在本发明的ore7突变体中，该基因的表达量较小或不发生变化(见图1D)。
同时，虽然叶片的衰老是由遗传因子所注定的，但可以通过暗处理的方式促进衰老的进程(Oh et al.，Plant J.，12527-535，1997)。因此，本发明人通过测量光合作用活性和叶绿素含量的变化来检测暗处理对ore7突变体叶片寿命的影响。在暗处理诱导的衰老进程的实验中，在野生型中，暗处理5天后，叶绿素含量和光合作用活性显著下降，但是在ore7突变体中，它们只分别下降了3％和22％(见图2B和2C)。此外，对衰老的分子标记——SEN4基因表达的分析结果表明，在野生型中的SEN4表达量比ore7突变体中明显增加(见图2D)。
此外，已知可以通过植物激素，例如脱落酸(ABA)，甲基茉莉酮酸酯(MeJA)和乙烯来促进叶片的衰老(Hensel et al.，Plant Cell5553-564，1993)。因此，为了检测通过这些植物激素对ore7突变体的叶片寿命的影响，检测了分别被ABA，MeJA和乙烯处理的ore7突变体叶绿素含量和光合作用活性，从而检测了衰老进程。结果发现，在野生型中由于植物激素的影响，叶绿素含量和光合作用活性显著降低，导致促进衰老。然而，在ore7突变体中，植物激素的影响显著降低，从而即使在有促进衰老激素的处理下，ore7突变体也具有延长的寿命(见图3和4)。此外，对衰老的分子标记——SEN4基因表达的分析结果表明，与ore7突变体相比，SEN4的表达在野生型中显著增加(见图5)。这表明，寿命延长的效果不仅出现在生理水平还出现在分子水平上。
在本发明的另一实施例中，涉及延长植物寿命的基因是通过质粒解救方法从ore7突变体中分离得到的(Weigel et al.，Plant Physiology，1221003-1014，2000)。然后，通过这种质粒解救方法分离的T-DNA插入位点的DNA片段的核酸序列被确定。
在拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组文库中调出该确定序列的核酸片段。结果，发现了一最接近增强子的开放阅读框(ORF)。经确定，该分离的基因存在一单个外显子，由936个核苷酸组成，编码长为311的氨基酸序列。该基因被命名为“ORE7”。ORE7基因的核酸序列见SEQ ID NO1。对由ORE7基因序列推断出的肽段序列进行数据库检索确定表达ORE7基因的蛋白质包含311个氨基酸，具体序列见SEQ ID NO2，同时含有一AT-hook基元序列。已知AT-hook基元序列与目的基因启动子的AT-富含区相结合，因此，它可直接作为转录因子或转录调控因子辅助转录因子与启动子结合，或类似组蛋白参与染色体构建(Aravind et al.，Nucleic Acids Res.26(19)4413-4421，1998)。此外，在ORE7蛋白中还存在富含苷氨酸，组氨酸，谷氨酰氨和谷氨酸这类通常出现在转录调控因子中基元序列(Abraham et al.，Gene，255389-400，2000；and Fujimoto et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，280(1)164-171，2001)。
为了验证ore7突变体中的衰老推迟表型是否由ORE7基因高效表达引起，采用ORE7基因作为探针进行northern杂交分析。结果发现，在野生型中，没有观察到ORE7基因的表达，但在ore7突变体中，观察到ORE7基因的高效表达(见图7)。更进一步将ORE7基因重新导入野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，从而获得高效表达，然后验证是否叶片衰老延迟表型重新产生。此时，虽然已知的用于植物转化的载体可以没有限制的选用，但作为载体的pCAMBIA3301载体被优选的选用。此外，作为转化宿主，虽然所有的Agrobacterium sp.属的微生物可以没有限制的选用，但优选的选用Agrobacterium tumefacienceAGL1株。转化后的Agrobacterium tumefacience株被命名为“pAT-ORE7”，同时于2001年8月8号保藏于韩国物种保藏培养中心(KCTC)，保藏号为KCTC 10032BP。
然后通过浸花的方法(Clough et al.，Plant J.，16(6)735-743，1998)采用pAT-ORE7转化野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Columbia)。在转化后的拟南芥(Arabidopsis thaliana)中发现寿命延长表型重新出现。这表明本发明中的ORE7基因为拟南芥(Arabidopsis thaliana)中抑制叶片衰老的基因。
对本发明中的ORE7基因表达蛋白测序发现，存在于转录因子或转录调控因子中的序列也出现在该蛋白的氨基酸序列中。因此，ORE7基因表达的ORE7蛋白被推测为调控基因在核内表达的转录因子或转录调控因子，本发明人证实了ORE7蛋白是否转运至核内。因此，通过Kain et al.方法构建了含有使本发明中待表达的ORE7基因与绿色荧光蛋白基因(GFP)形成融合蛋白的重组质粒(Kain et al.Biotechniques，19(4)650-655，1995)。通过荧光显微镜观察表示GFP蛋白在核内表达(见图8)。该结果表明ORE7蛋白迁移至核内，并在核内作用。
本发明中的ORE7基因可以具有转录阻遏物的作用，从而具有抑制调控叶片衰老开始的转录因子的作用，同时，也可直接作为负调控子抑制衰老的发生和进程。此外，本发明中的ORE7基因显示出增加激素，例如细胞激动素或植物增长素，衰老抑制激素等的作用，因此能间接抑制衰老。
此外，本发明提供了一种延长植物寿命的方法，该方法将采用使ORE7基因高效表达的载体转化植物。对于生产ORE7基因高效表达的转基因植物的生产方法，可以采用本领域常用的植物转化方法。比如，可以采用Agrobacterium-介导的转化方法，该方法采用植物转化双重载体导入ORE7基因。此外，当采用不含T-DNA区域的载体时，可以采用电穿孔微粒子轰击，聚乙烯乙二醇介导的转化等方式。
通过本发明的方法能延长寿命的植物包括，食用作物稻谷，小麦，大麦，玉米，大豆，马铃薯，印度大豆，燕麦和印度黍；蔬菜作物Arabidopsis sp.，中国卷心菜，萝卜，红辣椒，草莓，西红柿，西瓜，黄瓜，卷心菜，甜瓜，南瓜，威尔士洋葱，洋葱和胡萝卜；特殊作物西洋参，烟草植物，棉花植物，芝麻，产糖甘蔗，产糖甜菜，Perilla sp.，花生和葡萄；果树苹果树，梨树，枣树，桃树，新西兰水果树，葡萄树，柑橘树，柿子树，李子树，杏子树和香蕉树；花卉作物，包括玫瑰，唐菖蒲，非洲菊，康乃馨，菊花，百合和郁金香；和饲料作物，包括黑麦草，红花草，果园草，苜蓿，高阳茅草和多年生黑麦草等。尤其是，当本发明的方法施用于食用绿色蔬菜或水果时，例如西红柿这种薄皮的，从而衰老很容易引起快速腐烂变质的水果，和那些叶片为主要消费对象的植物，该方法能有效的增加植物的存储效率。
更进一步，本发明中的ORE7基因和ORE7蛋白用于研究植物中衰老相关基因或衰老抑制物质。此外，通过研究与本发明中的基因相结合的物质或者研究抑制或促进ORE7基因表达的物质，本发明中的基因能用于研究衰老抑制物质。特别的，可以通过各种传统的方法来开展研究，包括DNA碎片，蛋白质碎片，聚合酶链反应(PCR)，northern杂交分析，southern杂交分析，western杂交分析，酶联免疫吸附实验(ELISA)和2-D凝胶电泳和其类似的方法。
附图简介图1A的照片显示了野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Col)中，寿命延长突变体ore7中叶片的衰老随时间的变化。
图1B的图表显示了野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Col)中，寿命延长突变体ore7中光合作用活性随时间的变化。
图1C的图表显示了野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Col)中，和寿命延长突变体ore7中叶绿素含量随时间的变化。
图1D为northern杂交结果，显示了野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)(Col)中，和寿命延长突变体ore7中衰老相关基因和光合作用相关基因的表型随时间的变化。
SAG12衰老相关基因SEN4衰老相关基因Cab叶绿素a/b结合蛋白基因图2A的照片显示了经暗处理后，野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)(Col)中，和寿命延长突变体ore7中叶片衰老随时间的变化。
图2B的图表显示了经暗处理后，野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)(Col)中，和寿命延长突变体ore7中光合作用活性随时间的变化。
图2C的图表显示了经暗处理后，野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)(Col)中，和寿命延长突变体ore7中叶绿素含量随时间的变化。
图2D为northern杂交结果显示了经暗处理后，野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Col)中，和寿命延长突变体ore7中衰老相关基因(SEN4)表型。
0D暗处理前4D暗处理后第四天图3的图表显示在经过MES缓冲溶液(阴性对照组)(A)，MeJA(B)，ABA(C)和乙烯(D)这些促进衰老激素处理后，在野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Col)，和寿命延长突变体ore7中光合作用活性随时间的变化。
图4的图表显示在经过MES缓冲溶液(阴性对照组)(A)，MeJA(B)，ABA(C)和乙烯(D)这些促进衰老激素处理后，在野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Col)，和寿命延长突变体ore7中叶绿素含量随时间的变化。
图5为northern杂交结果显示了在分别经MeJA，ABA和乙烯这些促进衰老激素处理后第0，3，4，和5天，在野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)(Col)，和寿命延长突变体ore7中衰老相关基因(SEN4)的表型随时间的变化。
C未采用促进衰老激素处理的对照组。
T采用促进衰老激素处理的实验组。
图6的图表显示了标记激活载体pSKI015被插入了寿命延长突变体ore7的基因组内。
E增强子BAR除草剂抗性基因pBS包含E.coli复制起点和氨苄抗性基因的区段图7为northern杂交结果显示了在野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)(Col)，和寿命延长突变体ore7中ORE7基因的表达，其中28S为对照组。
图8的照片显示了在荧光(A和B)和光学显微镜(C和D)下观察，在洋葱表皮细胞中GFP-ORE7融合蛋白向细胞核的迁移。
A35S-GFP的照片(阳性对照组)B35S-ORE7-GFP的照片C35S-GFP的照片(阳性对照组)
D35S-ORE7-GFP的照片采用本发明的最佳实施方式在下文中，将通过具体例子对本发明的内容作进一步的细节描述。但应理解的是，本发明要保护的范围不受该具体例子的限制。
实施例1从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中筛选寿命延长突变体首先，为了在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中诱导突变，pSKI015(Weigel et al.，Plant Physiology，1221003-1014，2000；obtained fromWeigel’s Lab.，USA)，一标记激活载体，通过已知的电转化方法导入Agrobacterium tumefacience ABI株(获自Amasino’s Lab.，USA)中，然后，在含有卡那霉素和羧变青霉素的培养基上培养筛选获得转化子。下一步，通过浸花的方法(Clough et al.，Plant J.，16(6)735-743，1998)采用带有pSKI015插入的Agrobacterium tumefacience ABI株转化野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Columbia)。培植转化后的拟南芥(Arabidopsis thaliana)，从而获得种子，同时从种子中筛选出除草剂抗性的转化子。大约有5000 T1行的植株被种植于温度控制在23℃的温室中，然后通过肉眼观察叶片的变黄，该现象是由于植物年龄依赖衰老引起的叶绿素减少引起的。然后，通过与野生型相比筛选出具有缓慢变黄率的一行突变体。筛选出的突变体被命名为“ore7”。图1A显示了在野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)，和寿命延长突变体ore7中叶片衰老表型随时间的变化。
实施例2寿命延长突变体ORE7中特征表达的实验为了验证ore7突变体的寿命延长特性，肉眼观察了T2代植株中的蔷薇叶片3，在萌芽后20天(DAG)，每隔5天，测量叶绿素含量和光合作用活性。测量结果与野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)比较。本实验中的样本组选自每一植株上的25片单独的叶片。
2-1)叶绿素含量的测量为了测量叶绿素的含量，叶片样品分别在95％的乙醇中80℃下煮沸，从而提取叶绿素。叶绿素含量在648nm和664nm光吸收条件下被测量，并且表示为每叶片鲜重叶绿素的含量(Vermon et al.，Anal.Chem.，321142-1150，1960)。如图1B结果显示，野生型植株在25 DAG后叶绿素含量迅速降低，在40 DAG含量为0％，但在ore7突变体中，即使在40 DAG，叶绿素的含量仍高达最初叶绿素含量的70％以上。
2-2)光合作用活性的测量为了测量光合作用活性，采用Oh et al.(Oh S.A.et al.，Plant Mol.Biol.，30939，1996)的方法。首先，对各自不同DAG下的叶片暗处理15分钟，然后通过植物效率分析器(Hansatech)测量叶绿素荧光。光合作用活性通过叶绿素的荧光性表现为光合作用系统II(PS II)的光化学效率。光化学效率表现为最大可变荧光量(Fv)比最大荧光量(Fm)的比值(Fv/Fm)。当比值增加，光合作用活性增加。如图1C的结果显示，在野生型中，光合作用活性在30 DAGs后开始迅速减少，在40 DAG后几乎完全消失；而在ore7突变体中，由于为非常缓慢衰退型，在40DAG后才开始减少，直到70 DAG还保持了大约60％的活性。
根据上述结果，ore7突变体的表型相对于野生型来说表现为相当延长的叶片寿命。该延长寿命的效应，可以通过如下相应于衰老的生物化学变化现象，表现为叶绿素含量的减少和光合作用活性的降低，发生的晚于野生型的事实来证实。
实施例3在ore7突变体中衰老相关基因的表达实验为了比较衰老相关基因(SAGs)在突变体ore7和野生型中的表达，通过northern杂交分析，确定了在叶片发育过程中，随时间的变化，各自的SAG基因的表达型。采用Tri-试剂(Sigma)从分别来自22，26，30，34和38 DAG的叶片样品中提取总RNA(Woo H.R.et al.，Plant Cell，131779-1790，2001)。每道分别加10μg的RNA样品，分别采用SAG12基因，SEN4基因和Cab基因作为探针。
结果显示了光合作用相关基因的表达，例如叶绿素a/b结合蛋白(Cab)，随时间变化，随着衰老，其含量降低，如图1D所示。但是，在本发明的ore7突变体中，这些基因的表型很少或不发生变化。此外还发现，在野生型中，各种衰老相关基因的表达，例如SAG12和SEN4，随时间变化显著增加；但在ore7突变体中，在同一时间，衰老相关基因的表达量没有显著的增加。这个结果表明，ore7突变体同时从生理水平和分子水平推迟了衰老的发生，从而延长了叶片的寿命。此外，上述结果与其他研究结果光合作用活性和自我修复作用活性这类同化作用活性随叶片的发育活性增加，然后在衰老过程中活性降低(H.G.Nam，Curr.Opin.Biotech.，8200，1997)，相一致。
实施例4经暗处理后，ore7突变体中，叶片寿命变化的实验通过检测光合作用活性和叶绿素含量的变化，在经已知能促进衰老的暗处理后，ore7突变体的叶片寿命变化。
从野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)和ore7突变体的植株中分别分离12片25 DAG的单独的叶片，然后悬浮于2ml的3mM 2-[N-吗啉]-乙基磺酸缓冲液，pH5.8(下文中，称为“MES缓冲液”)。对处理后的叶片保存于22℃暗盒中，每天，采用如实施例2中的方法，测量其光合作用活性和叶绿素含量。结果显示，经暗处理5天后，野生型中光合作用活性下降至60％，而ore7突变体中则保持了原光合作用活性的97％，如图2B所示。此外，发现在经暗处理5天后，在ore7突变体中，与光合作用活性相类似，叶绿素含量降低型变缓，从而ore7突变体中叶绿素含量为75％，为野生型叶绿素含量25％的3倍，如图2C所示。
此外对衰老的分子标记——SEN4基因的表达，采用如实施例3中所述的方法进行研究。结果表示与ore7突变体相比，野生型SEN4基因的表达显著增加，如图2D所示。
实施例5通过植物激素的处理，ore7突变体中叶片寿命的变化此外，在本发明中，通过测量光合作用活性和叶绿素含量的变化，测量经植物激素，例如涉及衰老调控的ABA，MeJA和乙烯处理后，ore7突变体叶片寿命的变化。取25 DAG的12片独立的叶片悬浮于含有50μM ABA或50μM MeJA的2ml的缓冲液中。通过在含有4.5μM的乙烯气体的玻璃罩中培养拟南芥(Arabidopsis thaliana)，对植株进行乙烯处理。阴性对照组采用不含ABA或MeJA的MES缓冲液。采用上述方法进行的处理在22℃条件下连续光照处理3天。采用如实施例2所述的方法测定叶绿素含量和光合作用活性。
结果显示如图3A和4A所示，在阴性对照组中(采用不含ABA或MeJA的MES缓冲液处理)，野生型和ore7突变体中的叶绿素含量和光合作用活性都不发生变化。另一方面如图3B到3D所示，在经ABA，MeJA和乙烯处理后2天，野生型的光合作用活性显著下降，而ore7突变体中光合作用活性仅稍稍下降。此外，如图4B到4D所示，类似于光合作用活性，ore7突变体中的叶绿素降低变缓。这些结果表明，ore7突变体对促进衰老激素不敏感。
实施例6ORE7基因的克隆和测序为了研究T-DNA附近由增强子增强的基因，采用质粒解救方法(Weigel et al.，Plant Physiology，1221003-1014，2000)从ore7突变体中分离出基因。图6的图表显示了标记激活载体pSKI015插入寿命延长突变体ore7的基因组中。首先，通过Dellaporta et al.(Dellaporta et al.，Plant Mol.Biol.Rep.，119-21，1983)描述的方法从ore7突变体中提取总基因组DNA。然后，取5μg基因组DNA用EcoRI限制性内切酶消化，乙醇沉淀纯化，干燥。使消化后的DNA自连，然后转化至DH5α。然后筛选出具有氨苄抗性的转化子克隆。从所选的克隆中提取质粒，并采用在上述质粒解救方法中使用的，基于EcoRI下游区核酸序列构建的寡聚物确定T-DNA右边4.0kb位置的核酸序列。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组文库中调取所确定的核酸序列，从而获得最接近增强子的开放阅读框。所确定的开放阅读框被命名为“ORE7基因”，其核酸序列为SEQ ID NO1。可以发现，ORE7基因表达的蛋白包含311个氨基酸，序列如SEQ ID NO2所示。此外，还可发现AT-hook基元序列位于SEQ ID NO2氨基酸序列的83-94区域，而富含苷氨酸，组氨酸，谷氨酰氨，和谷氨酸的基元序列则位于氨基酸序列的38-52和245-261位。
其后，采用ORE7基因作为探针进行northern杂交分析。根据Wooet al.(Woo H.R.et al.Plant Cell，131779-1790，2001)所述的方法，采用Tri-试剂(Sigma)分别从野生型和ore7突变体中提取总RNA。取每道10μg RNA进行1.2％琼脂糖/甲醛凝胶电泳，分离，然后转移至尼龙膜表面。转移的RNA样品通过3X SSC洗涤5分钟，以除去多余的琼脂糖。然后，为了使RNA样品固定于尼龙膜表面，将其在紫外线下(254nm，0.18J/cm2)照射。然后根据Park et al.(Park et al.，Plant Mol.Biol.，261725-1735，1994)方法，对转移的膜进行预杂交和杂交。
结果显示，在野生型中只有很少或没有ORE7基因的表达，但在ORE7突变体中，ORE7基因以极高的转录量进行表达，如图7所示。
实施例7将ORE7基因导入野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)为了确定突变体中衰老推迟表型的发生是由ORE7基因激活所引起的，进行了将包含增强子和ORE7基因的5.4kb大小的DNA片段导入野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)的实验。
因此，将采用质粒解救方法分离得到的质粒用BamHI和EcoRI消化，然后分离出包含ORE7基因和增强子的DNA片段。消化后的DNA片段插入以BamHI和EcoRI消化的pCAMBIA3301载体中(MRC，USA)。构建的载体被命名为“pORE7/3301”。采用重组载体pORE7/3301转化Agrobacterium tumefacience AGL1株(Lazo G.R.，et al.，Biotechnology，9963-967，1991)(ATCC BAA-101)。转化后的Agrobacterium tumefacience株被命名为“pAT-ORE7”，并于2001年8月8日保藏于韩国菌种保藏中心(KCTC)，保藏编号为KCTC 10032BP。然后通过浸花方法(Clough et al，Plant J.，16(6)735-743，1998)用pAT-ORE7转化野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)(哥伦比亚)。然后培养转化后的拟南芥(Arabidopsis thaliana)，获得种子，并从种子中筛选出除草剂抗性的种子。将转化后的拟南芥(Arabidopsis thaliana)培养于温室中，并检验其衰老延迟表型。结果显示，在ore7突变体中出现的衰老延迟表型又重新出现了。这表明衰老延迟表型是由ORE7基因激活引起的，植物中ORE7基因的激活可诱导植物的衰老推迟。
实施例8GFP-ORE7融合蛋白在洋葱表皮细胞中的表达研究在数据库中检索由实施例6中的ORE7基因核酸序列推导出的多肽序列。结果显示其存在AT-hook基元序列和富含苷氨酸，组氨酸，谷氨酰氨，和谷氨酸的基元序列。这样的基元序列通常位于用于调控基因在核内表达的转录因子或转录调节因子的序列中。因此，本发明的发明人确定了本发明中的ORE7蛋白是否迁移至核内表达。
首先，通过PCR方法扩增编码ORE7全蛋白的基因，引物分别为SEQ ID NO3和SEQ ID NO4。PCR反应的初始温度为95℃下2分钟，然后在如下条件下进行35个循环反应94℃30秒，55℃30秒，和72℃1分钟，最后在72℃扩增10分钟。通过琼脂糖凝胶电泳从PCR产物中分离得到一大小为0.95kb的DNA片段，然后将其插入含有绿色荧光蛋白(GFP)的326GFP-3G质粒(获自In-Hwan教授，PohangUniversity of Science and Technology Foundation，韩国)的Sma I和HindIII位点间，从而构建出pGFP-ORE7质粒。随后采用Varagona et al方法(Varagona et al.，Plant Cell，41213-1227，1992)在洋葱表皮细胞中表达GFP-ORE7融合蛋白。为了将DNA包裹于钨粒子表面，首先采用Qiagen柱纯化表达ORE7-GFP融合蛋白的质粒，然后使2μg的DNA和钨粒子在含有50μl 2.5M的CaCl2和20μl 0.1M的亚精胺溶液中共沉淀。然后采用70％的乙醇洗涤沉淀，再将其悬浮于36μl的100％乙醇中。随后，将洋葱表皮细胞置于含有1/2 B5培养基的培养皿中，使洋葱内表面向上。然后采用1350p.s.i.(Biorad)，使包裹有质粒DNA的M-25钨粒子进行粒子轰击。然后将培养皿用石蜡封口膜包裹，置于22℃培养箱中培养18个小时。18小时后，通过荧光显微镜观察GFP蛋白的表达。
结果显示ORE7-GFP的表达位于核内，如图8所示。这表明ORE7蛋白迁移至核内，并在核内产生功能。
工业实用性如上文所述很明显，ore7突变体的衰老延迟表型是由ORE7基因激活的，ORE7基因的激活可以诱导植物衰老的延迟。根据本发明，可以采用调控植物叶片寿命的ORE7基因转化植物，从而使植物的寿命延长，进而提高植物的产率和存储效率。此外，本发明中的基因和表达的蛋白用于植物中，衰老机理的研究，和衰老相关基因的研究或衰老抑制物的研究。
国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约国际表原始保藏存单至基诺麦因有限公司(GENOMINE，INC.)(Environmental Eng.Bldg.226，Pohang University of Science & Technology，#San31，Hyoja-dong，Nam-ku，Pohang 790-784，Republic of Korea)

序列表<110>基诺麦因有限公司浦项工科大学校<120>控制植物叶片平均寿命的基因和一种采用该基因控制植物平均寿命的方法<130>OP04-1007/PCT/CN<150>KR 2001-50774<151>2001-08-22<160>4<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>936<212>DNA<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1atggaaggcg gttacgagca aggcggtgga gcttctagat acttccataa cctctttaga60ccggagattc accaccaaca gcttcaaccg cagggcggga tcaatcttat cgaccagcat120catcatcagc accagcaaca tcaacaacaa caacaaccgt cggatgattc aagagaatct180gaccattcaa acaaagatca tcatcaacag ggtcgacccg attcagaccc gaatacatca240agctcagcac cgggaaaacg tccacgtgga cgtccaccag gatctaagaa caaagccaag300ccaccgatca tagtaactcg tgatagcccc aacgcgctta gatctcacgt tcttgaagta360tctcctggag ctgacatagt tgagagtgtt tccacgtacg ctaggaggag agggagaggc420gtctccgttt taggaggaaa cggcaccgta tctaacgtca ctctccgtca gccagtcact480cctggaaatg gcggtggtgt gtccggagga ggaggagttg tgactttaca tggaaggttt540gagattcttt cgctaacggg gactgttttg ccacctcctg caccgcctgg tgccggtggt600
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<213>人工序列<220>
<223>ORE7基因PCR的5′端引物<400>3tacccgggca atggaaggcg gttacgagca a 31<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>ORE7基因PCR的3′端引物<400>4cccaagcttt taaaaaggtg gtcttgaagg tgt 3权利要求
1.一种调控叶片寿命的ORE7蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO2。
2.根据权利要求1所述的ORE7蛋白，其中蛋白分离自拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
3.根据权利要求1所述的ORE7蛋白，其中在蛋白氨基酸序列SEQ IDNO2的83-94区域存在一AT-hook基元序列，在氨基酸序列的38-52和245-261区域存在富含苷氨酸，组氨酸，谷氨酰氨，和谷氨酸的基元序列。
4.一调控植物寿命的基因，其编码权利要求1所述的ORE7蛋白。
5.根据权利要求4所述的ORE7基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO1。
6.一重组载体，含有权利要求4所述的基因。
7.根据权利要求6所述的重组载体，其中重组载体pORE7/3301包含权利要求5所述的ORE7基因。
8.一种采用权利要求6所述的重组载体转化的Agrobacterium sp.。
9.根据权利要求8所述的Agrobacterium sp.，为Agrobacteriumtumefacience pAT-ORE7(保藏编号KCTC 10032BP)。
10.一种利用权利要求4中所述基因调控植物寿命的方法。
11.根据权利要求10所述的方法，其中该方法通过将权利要求4所述的基因导入植物并使其高效表达从而推迟了植物的衰老。
12.根据权利要求10所述的方法，其中植物选自，食用作物包括，稻谷，小麦，大麦，玉米，大豆，马铃薯，印度大豆，燕麦和印度黍；蔬菜作物包括，Arabidopsis sp.，中国卷心菜，萝卜，红辣椒，草莓，西红柿，西瓜，黄瓜，卷心菜，甜瓜，南瓜，威尔士洋葱，洋葱和胡萝卜；特殊作物包括，西洋参，烟草植物，棉花植物，芝麻，产糖甘蔗，产糖甜菜，Perilla sp.，花生和葡萄；果树包括，苹果树，梨树，枣树，桃树，新西兰水果树，葡萄树，柑橘树，柿子树，李子树，杏子树和香蕉树；花卉作物包括，玫瑰，唐菖蒲，非洲菊，康乃馨，菊花，百合和郁金香；和饲料作物包括，黑麦草，红花草，果园草，苜蓿，高阳茅草和多年生黑麦草等等。
13.一种利用ORE7基因或ORE7蛋白研究植物衰老调控基因或蛋白的方法。
14.根据权利要求13所述的方法，其中该方法包括DNA片段，蛋白片段，聚合酶链式反应(PCR)，northern杂交分析，southern杂交分析，western杂交分析，酶联免疫吸附实验(ELISA)和2-D凝胶电泳分析。
全文摘要
本发明涉及一种调控植物叶片寿命的基因和一种采用该基因调控植物寿命的方法。更特别的，本发明涉及一种调控植物叶片寿命的ORE7基因，该基因的核酸序列为SEQ ID NO1，以及一种调控植物寿命的方法，其中将ORE7基因导入植物并进行高效表达，从而推迟了植物的衰老。可以采用根据本发明的ORE7基因对植物进行转化，从而延长了植物寿命，从而改善植物生产和储存效率。此外，本发明的ORE7基因和表达的ORE7蛋白用于研究植物的衰老机制，和确定植物衰老相关基因或抑制植物衰老物质。
文档编号C12N15/82GK1547589SQ02816505
公开日2004年11月17日 申请日期2002年8月22日 优先权日2001年8月22日
发明者林平玉, 南洪吉, 赵成环 申请人:基诺麦因有限公司, 浦项工科大学校