预测作用于生长激素受体的制剂的治疗反应的方法

专利名称：预测作用于生长激素受体的制剂的治疗反应的方法
技术领域：
本发明涉及预测受试者对作用于生长激素受体的制剂的治疗反应强度的方法。优选的方面包括增加身材矮小的人类受试者的身高，和治疗肥胖症及肢端肥大症的方法。
背景技术：
大多数身材明显矮小的儿童并非如通常对激发性刺激的生长激素(GH)反应所定义的那样具有生长激素缺陷(GHD)。一旦排除了身材矮小的已知原因，便可将这些受试者可分为各种类型，包括家族性身材矮小、体质性生长迟缓、“特发性”身材矮小(ISS)。对于身材正常的父母生出的矮小孩子称为“宫内发育迟缓”(IUGR)。对于这种出身即矮小的孩子称为“小于胎龄”(SGA)。一些儿童，预计许多这样的儿童不可能达到他们的遗传身高，虽然尚没有大规模纵向研究结果的报道。因为有许多因素影响到正常的生长和发育。ISS、IUGR、SGA患者可能在他们身材矮小的病因学上不相同。尽管不是典型的GH缺乏，但大多数ISS儿童能对GH治疗发生反应，虽然不是所有ISS儿童的反应都相等。
许多学者研究发现这组受试者中存在自发性GH分泌失调。一种假说提出，虽然一些这样的受试者在生理条件下存在内源性GH分泌不足，但如传统GH刺激试验所显示的那样，在对试剂刺激的反应中仍能显示GH升高。此病称为“GH神经分泌失调”，该诊断依赖于在长期采样的血清中出现GH循环模式的异常。许多学者报告了这类研究的结果，发现这种异常只是偶然存在。其他学者推测这些受试者具有“无生物活性的GH”；然而此种结论尚未证实。
克隆GH受体(GHR)时，显示血液中的主要GH结合活性是由于一种与GHR基因相同的基因所产生的蛋白质，该蛋白质能对全长GHR的胞外功能域反应。几乎所有的生长激素不反应性综合征(或Laron综合征)(GHIS)患者的血液都缺乏生长激素受体结合活性，和缺乏GH-结合蛋白(GHBP)活性或非常低。这些受试者的平均身高评分标准差(SDS)约为-5到-6，对GH治疗有耐药性，其GH血清浓度高和胰岛素样生长因子(IGF-I)血清浓度低。他们对用IGF-I治疗有反应。GHR胞外功能域缺乏的受试者中，若循环血液中缺乏GHBP可作为GH不敏感的标志。
用外源性GH治疗ISS患者显示对治疗有不同的反应率。具体说，许多儿童对GH治疗有点反应但不完全。这些患儿的生长速度有所提高但只是具有完全反应儿童的一半左右。疗程结束后这些儿童的身高总增长量不如有完全反应的儿童，取决于治疗时间的长短。改进不完全反应患儿治疗效果的一种方法是增加GH剂量，这可导致生长速度和身高总增长有所改善。然而，增加GH剂量由于其潜在的副作用对所有患儿并不理想。增加GH剂量还导致增加费用。不幸的是目前还没有能在长期治疗和观察期前，鉴定反应可能较差患儿的方法。
因此，该领域需要可用于鉴定对GH治疗反应率显示低下的患儿亚组的方法。也需要开发能治疗对外源性GH反应低下患儿的改进的治疗试剂的方法。该领域还需要可用于鉴定对GH治疗反应率显示提高的患儿亚组的方法，和需要开发能治疗对外源性GH反应增高患儿的改进的治疗试剂的方法。
这类受试者的例子包括身材矮小的个体，或患肥胖症、感染或糖尿病的个体；肢端肥大症或巨人症，或与其相关的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效应；与钠或水滞留相关的症状；代谢综合征；心境和睡眠障碍、癌症、心脏病和高血压。
发明概述本发明依据以下发现携带有含外显子3缺失(GHRd3)的生长激素受体(GHR)等位基因的受试者对于通过GHR通路起作用试剂的治疗阳性反应比不携带GHRd3等位基因的受试者更强。具体说，携带GHRd3等位基因的受试者对用重组生长激素(GH)治疗的阳性反应，比不携带所述GHRd3等位基因的受试者更强。用重组GH治疗疗程结束时，ISS、IUGR或SGA和携带GHRd3的受试者获得的生长速度，大约是GHRf1等位基因纯合子ISS受试者的二倍。他们的总身高变化与试剂作用成比例增加。
如上所述GH受体(GHR)介导了GH的活性。已证明二分子的GHR与一分子的GH相互反应(Cunningham等，1991，Science 254821-825；de Vos等，1992，Science255306-312；Sundstrom等，1996，J.Biol.Chem.27132197-32203；和Clackson等，1998，J.Mol.Biol.2771111-1128)。结合发生在GH上的二个独特GHR结合位点与二个受体的胞外功能域上常见的结合沟槽之间。GH上的位点1亲和力比位点2高，认为受体的二聚化依次发生，一个受体结合GH的位点1，随后使第二个受体与位点2结合。Cnningham等(1991，同上)提出，受体的二聚化是导致信号激活的关键，而GH的结合促使了此二聚化(Ross等，J.Clin.Endocrinol.& Metabolism(2001)86(4)1716-171723)。配体结合时，GHR迅速内化(Maarnra，1999，J.Biol.Chem 27414791-14798；和Harding等，1996，J.Biol.Chem.2716708-7612)，其一部分被再循环送到细胞表面(Roupas等，1987，Endocrinol.1211521-1530)。
最近发现了GHRd3的GHR同工型，它缺失了外显子3(Urbanek等，Mol Endocrinol1992 Feb；6(2)179-87；Godowski等，1989，PNAS USA 868083-8087)。认为这种缺失是交替剪接的结果，导致或保留或排除外显子3，相当于或是全长的GHRf1同工型，或是外显子3缺失的GHRd3同工型。几种相矛盾的结果发生在GHRd3同工型鉴定之后，有报告提出，GHRd3同工型是组织特异性剪接而致，这种表达模式受发育的调节，然而其它报告提出，GHRd3同工型是个体特异性的。另一报告提出，这种剪接是按孟德尔性状和交替剪接转递的遗传多样性而致(Stallings-Mann等，1996，PNASUSA.9412394-12399)。最后，Pantel等，2000，J.Biol.Chem.275(25)18664-18669)对GHR基因座的分析显示，人灯类中GHRd3同工型转录自携带有横跨外显子3的2.7kb基因组缺失的GHR等位基因。Pantel还在只表达GHRf1的个体的基因组DNA样品中鉴定出二个侧接反式元件，但在表达GHRd3个体的DNA中只有一个反式元件，提示外显子3缺失是位于同一个GHRf1等位基因上的二个反式元件同源重组的结果。
HGHRd3蛋白与全长hGHR(GHRf1)不同之处在于，该受体的胞外结构域中缺失了22个氨基酸。GHRd3同工型编码稳定的功能性GHR蛋白(Urbanek等，1993，J.Biol.Chem.268(25)19025-19032)。虽然Urbanek等(1993)报导GHRd3同工型稳定地整合入细胞膜，并能象hGHR一样有效地结合和内化配体，但没能鉴定出与GHRf1同工型在功能上有所差别。
本发明涉及所鉴定的GHR等位基因和同工型，可作为导致对外源性GH阳性反应发生差别的重要因素。因此本发明提供对采用经GHR通路而起作用的化合物(优选能结合GHR的化合物如GH组合物)治疗发生阳性反应的程度的预测方法。这些方法可将受试者分类为优先的，如高反应者或低反应者。这样可使将给予某具体受试者的治疗具有经济的效益和/或可减少副作用(如减少采用适当剂量GH组合物或采用给予受试者后不能显示消除GHR反应的化合物所引起的副作用)。
本发明还证明，GHRd3和GHRf1等位基因杂合子受试者在对GH治疗的反应中，生长速度和身高变化都优于GHRf1等位基因纯合子受试者。因此本发明提供GHRf1等位基因纯合子个体的GHR反应或GHR活性低下的检测和诊断方法。GHR活性低下可能是，例如GHR水平、表达或蛋白质活性低下所致。本发明也提供GHRd3等位基因纯合子或杂合子个体的GHR反应或GHR活性升高的检测和诊断方法。预计检测GHR活性的升高或降低，对采用经GHR通路起作用的治疗试剂来治疗各种可治疾病有用。例子包括治疗身材矮小(如优选ISS、IUGR或SGA受试者)、肥胖症、感染或糖尿病；肢端肥大症或巨人症，或与其相关的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效应；与钠或水滞留相关的症状；代谢综合征；心境和睡眠障碍、癌症、心脏病和高血压。优选的例子包括能结合GHR蛋白，如可作为GHR激动剂或拮抗剂的重组GH组合物的试剂。
因此本发明提供测定或预测GHR介导活性的方法，包括预测GHR对治疗(试剂)的反应的方法，和鉴定处在患此病危险中受试者的方法，或诊断GHR活性低下相关疾病的方法。优选本发明提供预测某受试者对可与GHR多肽相互作用(如结合)的试剂有无反应的方法。
因此，一方面，本发明公开了预测某受试者对能与GHR蛋白结合的试剂有何种反应的方法，该方法包括测定该受试者中是否存在GHR基因的某个等位基因，该等位基因与对所述试剂的阳性反应可能增高或降低相关联，从而鉴定该受试者对用所述试剂治疗的反应可能增高或降低。
本发明也提供预测某受试者，如选自身材矮小(如优选ISS、IUGR或SGA)、肥胖症、感染或糖尿病；肢端肥大症或巨人症，或与其相关的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效应；与钠或水滞留相关的症状；代谢综合征；心境和睡眠障碍、癌症、心脏病和高血压等疾病患者对某试剂有何种反应的方法，所述方法包括测定该受试者中是否存在GHR基因的某个等位基因，该等位基因与对所述试剂的阳性反应可能增高或降低相关联，从而鉴定该受试者对用所述试剂治疗的反应可能增高或降低。在优选方面，本发明提供预测受试者对可提高受试者身高的试剂有何种反应的方法，该方法包括测定该受试者中是否存在GHR基因的某个等位基因，该等位基因与对所述试剂的阳性反应可能增高或降低相关联，从而鉴定该受试者对用所述试剂治疗的反应可能增高或降低。
优选本发明的方法包括测定该受试者的GHR等位基因的外显子3中是否存在一个或多个核酸的缺失、插入或替代，或最优选基本上全部外显子3都缺失。
还提供鉴定某受试者对采用能结合GHR蛋白的试剂来治疗疾病或病症的可能性高或低的方法，所述方法包括a)使存在GHR基因等位基因与受试者对能结合GHR蛋白的试剂的反应相关联；和b)在该受试者中检测步骤a)的等位基因，从而鉴定受试者对用所述试剂治疗的反应可能高或低。在另一方面，包括鉴定与采用能结合GHR蛋白的试剂治疗疾病或病症的可能性增高或降低相关联的GHR基因的等位基因的方法，该方法包括a)测定某受试者中是否存在GHR基因的等位基因；和b)将步骤a)所述等位基因的存在与用能结合GHR蛋白的试剂治疗疾病可能性的高或低相关联，从而鉴定出与用所述试剂治疗的反应可能增高或降低相关的等位基因。
所述的疾病或病症可选自身材矮小(如优选ISS、IUGR或SGA)、肥胖症、感染或糖尿病；肢端肥大症或巨人症，或与其相关的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效应；与钠或水滞留相关的症状；代谢综合征；心境和睡眠障碍、癌症、心脏病和高血压。
最优选，本发明的方法包括测定受试者GHR基因外显子3的基因型，当存在外显子3时，表示所述受试者患有GHR反应低下的相关疾病，或患此类疾病的危险性高；或当缺失外显子3时，表示所述受试者患GHR反应低下疾病的危险性低。
本发明的方法可特别有利地用于治疗方法中。所述基因型优选能表明所述治疗(试剂)的功效或治疗益处。在一实施例中，采用本发明方法来确定给予受试者的试剂剂量。在另一实施例中，用本方法评估临床试验中受试者的治疗反应，或为临床试验选择受试者。例如，本发明的方法可包括测定受试者GHR基因外显子3的基因型，其中所述基因型可将所述受试者分成临床试验亚组，或临床试验所包括的亚组。
本发明也提供治疗受试者的方法，该方法包括(a)测定该受试者中是否存在GHR基因的等位基因，将该等位基因与对能结合GHR蛋白的试剂或通过GHR通路起作用的试剂的阳性反应可能增高或降低相关联；和(b)选择或确定给予所述受试者的所述试剂的有效量。
本发明任一方法所述的能结合GHR蛋白，或通过GHR通路起作用的任何试剂，优选在治疗选自身材矮小(如优选ISS、IUGR或SGA)、肥胖症、感染或糖尿病；肢端肥大症或巨人症，或与其相关的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效应；与钠或水滞留相关的症状；代谢综合征；心境和睡眠障碍、癌症、心脏病和高血压等疾病中有效的任何试剂。
特别地，本发明提供治疗受试者的方法包括(a)测定受试者中是否存在GHR基因的等位基因，将该等位基因与对能治疗选自身材矮小(如优选ISS、IUGR或SGA)、肥胖症、感染或糖尿病；肢端肥大症或巨人症，或与其相关的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效应；与钠或水滞留相关的症状；代谢综合征；心境和睡眠障碍、癌症、心脏病和高血压等疾病的试剂的阳性反应可能增高或降低相关联；和(b)选择或确定给予所述受试者的所述试剂的有效量。
在特别优选的实施方案中，本发明公开了促进受试者生长的方法，该方法包括(a)测定受试者中是否存在GHR基因的等位基因，将该等位基因与对能促进受试者生长的试剂的阳性反应的可能性高或低相关联；和(b)选择或确定给予所述受试者的所述试剂的有效量。
在一优选方面，本发明公开了加快人类受试者生长的方法，该方法包括(a)检测该受试者的身高是否低于同年龄和同性别正常人的不到大约一个标准差，或更优选不到大约二个标准差，(b)检测该受试者的DNA是否编码GHRd3多肽；和(c)给予该受试者有效量的GH，以提高该受试者的生长速度。优选该受试者不是患Laron综合征的受试者。
所述治疗人类受试者的方法优选包括给予GHRf1等位基因纯合子受试者的试剂有效剂量，宜高于给予其DNA编码GHRd3蛋白的同种受试者的有效剂量。
在优选方面，所述试剂是GH分子。给予受试者的GH有效量宜在约0.001-0.2mg/kg/天之间，更优选GH的有效量在约0.01-0.1mg/kg/天之间。在其它方面，给予受试者的GH有效量至少为约0.2mg/kg/天。在另一方面，GH的有效量至少为约0.25mg/kg天。在另一方面，GH的有效量至少为约0.3mg/kg天。GH宜每天给药一次。GH宜皮下注射给药。最优选配制该生长激素的pH约为7.4-7.8。
本发明另一方面涉及使用药物的方法，该方法包括获得受试者的DNA样品，测定该DNA样品是否含有与对该药物的阳性反应增强相关联的GHR基因的等位基因和/或该DNA样品是否含有与对该试剂的阳性反应低下相关联的GHR基因的等位基因；如果该DNA样品含有与对该药物的阳性反应增强相关联的GHR基因的等位基因和/或该DNA样品缺乏与对该药物的阳性反应低下相关联的GHR基因的等位基因，则给予该受试者有效量的该药物。
另一方面，本发明包括治疗对外源性GH反应低下的受试者。在此方面，本发明提供利用药物治疗的方法，该方法包括获得受试者的DNA样品；测定该DNA样品是否含有与对该药物的阳性反应增强相关联的GHR基因的等位基因和/或该DNA样品是否含有与对该药物的阳性反应低下相关联的GHR基因的等位基因；和如果该DNA样品含有与对该药物的阳性反应增强相关联的GHR基因的等位基因和/或该DNA样品缺乏与对该药物的阳性反应低下相关联的GHR基因的等位基因，则给予该受试者有效量的该药物。
如上述，这些方法包括测定该受试者的GHR等位基因外显子3中是否存在有一个或多个核酸缺失、插入或替代，或更优选基本上缺失全部外显子3。对药物阳性反应增强相关联的GHR基因的等位基因是缺失外显子3的GHR等位基因，优选GHRd3等位基因。对药物阳性反应低下相关联的GHR基因的等位基因优选含有外显子3的GHR等位基因(GHRf1)(当受试者是该等位基因的纯合子时)。
本发明还涉及药物的临床测试方法，该方法包括以下步骤—给予一受试者群体某种药物；和—从所述受试者群中鉴定出受试者的DNA编码GHRd3多肽同工型的第一亚群，和受试者的DNA不编码GHRd3多肽同工型的第二亚群。
所述方法还包括(a)评估所述第一亚群受试者对所述药物的反应；和/或(b)评估所述第二亚群受试者对所述药物的反应。宜同时评估所述第一和第二亚群受试者对所述药物的反应。宜分别评估所述第一和第二亚群受试者对所述药物的反应。评估对所述药物的反应宜包括测定受试者身高的变化。
本发明还涉及试剂的临床测试方法，该方法包括以下步骤—鉴定出其DNA编码GHRd3多肽的第一群受试者，和其DNA不编码GHRd3多肽的第二群受试者；—给予所述第一群和/或所述第二群受试者某种药物。在一这施方案中，给予所述第一群受试者此药物但不给予所述第二群受试者。在一实施方案中，给予所述第二群受试者此药物但不给予所述第一群受试者。在另一实施方案中，同时给予所述第一和所述第二群受试者药物。
上述方法中的药物优选是用于治疗身材矮小、肥胖症、感染或糖尿病；肢端肥大症或巨人症，或与其相关的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效应；与钠或水滞留相关的症状；代谢综合征；心境和睡眠障碍、癌症、心脏病和高血压的药物。
本发明的一优选方面涉及一种药物，优选能加快受试者生长的药物的临床测试方法。该方法包括以下步骤—给予一受试者群某一种药物，优选能加快受试者生长的药物；和—从所述受试者群中鉴定出受试者的DNA编码GHRd3多肽同工型的第一亚群受试者，和受试者的DNA不编码GHRd3多肽同工型的第二亚群受试者。
另一优选方面涉及一种药物，优选能加快受试者生长或能改善ISS、IUGR或SGA的药物的临床测试方法。该方法包括以下步骤—鉴定受试者的DNA编码GHRd3多肽同工型的第一亚群受试者，和受试者的DNA不编码GHRd3多肽同工型的第二亚群受试者。
—给予所述第一和/或第二群受试者，优选能加快受试者生长或能改善ISS、IUGR或SGA的药物。在一实施方案中，给予所述第一群受试者此药物但不给予所述第二群受试者。在一实施方案中，给予所述第二群受试者此试剂但不给予所述第一群受试者。在另一实施方案中，同时给予所述第一和所述第二群受试者药物。
评估对于能加快受试者生长或能改善ISS、IUGR或SGA的药物的反应，包括评估受试者身高的变化。提高受试者的生长速度不仅包括该受试者获得了与用GH治疗的GH缺陷受试者(即诊断为GHD的受试者)至少相同的最终身高情况，而且指该受试者获得了与用GH治疗的GH缺陷受试者在身高上相同的生长速度，或达到了成人的在目标身高范围内的身高情况，即最终身高与他们的遗传潜力相一致的身高，如用中等身高父母亲的目标身高测决定的那样。
本发明方法之一的某一方面中，测定受试者的DNA是否编码某特定的GHR多肽同工型的步骤，可采用能特异性结合GHR核酸分子的核酸分子进行。另一方面，测定受试者的DNA是否编码某GHR多肽同工型的步骤，采用能特异性结合GHR核酸分子的核酸分子进行。本发明的方法宜包括测定某受试者的DNA是否编码GHRd3蛋白或多肽。这可能包括测定某受试者的基因组DNA是否含有GHRd3等位基因，获自某受试者的mRNA是否编码GHRd3多肽，或该受试者是否表达GHRd3多肽。
例如，在上述任一实施方案中，测定受试者的DNA是否编码GHRd3多肽包括以下步骤a)提供生物样品；b)使所述生物样品接触ii)能在严谨条件下与GHR，优GHRd3核酸杂交的多核苷酸；或iii)能选择性结合GHR，优选GHRd3多肽的可检测多肽；和c)检测所述样品中所述多核苷酸与RNA种类之间是否发生杂交，或所述可检测多肽与所述样品中的多肽是否发生结合。
优选使生物样品接触能在严谨条件下与GHRd3核酸杂交的多核苷酸，或接触能选择性结合GHRd3多肽的可检测多肽，其中，检测到所述杂交或所述结合，表明所述样品中表达有所述GHRd3蛋白。
所述多核苷酸优选是引物，其中通过检测含有所述引物序列的扩增产物的存在，来检测所述的杂交。所述可检测的多肽优选是抗体。可采用适当的方法来检测GHRd3和GHRf1多肽或核酸。例如，可评估GHRd3或GHRf1的胞外功能域(如高亲和力GH结合蛋白)的血清水平。能与GHRd3基因组或cDNA序列特异性杂交的寡核苷酸探针或引物也是本发明的一部分，以及采用所述引物和探针的DNA扩增和检测方法。
本发明还涉及GHRd3多肽候选调节剂的方法。这些方法可包括，例如鉴定能在GHRd3等位基因的纯合子或杂合子个体中起作用的GHR激动剂或抑制剂的方法。可利用这些方法来鉴定已知的GH组合物，如GENOTROPINTM、PROTROPINTM、NUTROPINTM、SOMAVERTTM(培维索孟)中的化合物，来鉴定治疗最有效的化合物。这些方法可用来鉴定能加快受试者生长，能改善肥胖症、感染或糖尿病；肢端肥大症或巨人症，或与其相关的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效应；与钠或水滞留相关的症状；代谢综合征；心境和睡眠障碍、癌症、心脏病和高血压的试剂。
在一方面，本发明涉及鉴定GHRd3多肽候选调节剂的方法，所述方法包括a)提供GHRd3多肽；b)使所述混合物与测试化合物接触；和c)测定所述化合物是否能选择性结合于所述GHRd3多肽；其中检测到所述化合物结合了所述多肽，表明所述化合物是所述GHRd3多肽的候选调节剂。该测试化合物宜是GH多肽或其一部分或变体。测试化合物可以是GHRd3多肽的激动剂或抑制剂。在优选实施方案中，将所述GHRd3多肽掺入到膜中。
本发明也提供鉴定GHRd3多肽候选调节剂的方法，所述方法包括a)提供GHRd3多肽；b)使所述混合物与测试化合物接触；和c)测定所述化合物是否能选择性调节GHR的活性；其中检测到所述化合物选择性调节了GHR的活性，表明所述化合物是GHRd3多肽活性的候选调节剂。该测试化合物宜是GH多肽或其一部分或变体。测试化合物可以是GHRd3多肽的激动剂或抑制剂。测到该测试化合物能刺激GHR活性，表明该测试化合物是候选的激动剂。测到该测试化合物能抑制GHR活性，表明该测试化合物是候选的抑制剂在优选实施方案中，将所述GHRd3多肽掺入到膜中。
本发明还提供鉴定GHRd3多肽候选调节剂的方法，所述方法包括a)提供含有GHRd3多肽的细胞；b)使所述细胞接触测试化合物；和c)测定所述化合物是否能选择性调节GHR的活性；
其中检测到所述化合物选择性调节了GHR的活性，表明所述化合物是GHRd3多肽活性的候选调节剂。该测试化合物宜是GH多肽或其一部分或变体。测试化合物可以是GHRd3多肽的激动剂或抑制剂。测到该测试化合物能刺激GHR活性，表明该测试化合物是候选的激动剂。测到该测试化合物能抑制GHR活性，表明该测试化合物是候选的抑制剂所述细胞宜为人293细胞。在所述方法的另一方面，该细胞是非洲爪蟾卵母细胞，步骤(a)包括将GHRd3cRNA导入到所述细胞中。
本发明还提供可能以GHRd3和GHRf1异质双体多肽存在的GHR。因此另一方面，本发明也涉及鉴定GHR异质双体(GHRd3/f1)多肽的候选调节剂的方法。这些方法可包括，例如鉴定GHR激动剂或抑制剂的方法。这些方法也包括鉴定能加快受试者生长，能改善肥胖症、感染或糖尿病；肢端肥大症或巨人症，或与其相关的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效应；与钠或水滞留相关的症状；代谢综合征；心境和睡眠障碍、癌症、心脏病和高血压的试剂的方法。
一方面，本发明涉及鉴定GHR异质双体多肽候选调节剂的方法，所述方法包括a)混合GHRf1和GHRd3多肽；b)使所述混合物接触测试化合物；和c)测定所述化合物是否能选择性调节GHR的活性；其中检测到所述化合物选择性调节了GHR的活性，表明所述化合物是GHR异质双体活性的候选调节剂。该测试化合物宜是GH多肽或其一部分或变体。测试化合物可以是GHR异质双体的激动剂或抑制剂。测到该测试化合物能刺激GHR活性，表明该测试化合物是候选的激动剂。测到该测试化合物能抑制GHR活性，表明该测试化合物是候选的抑制剂。在优选实施方案中，将所述GHRf1和GHRd3多肽掺入到膜中。
本发明还提供鉴定GHR异质双体多肽候选调节剂的方法，所述方法包括a)提供含有GHRf1和GHRd3多肽的细胞；b)使所述细胞接触测试化合物；和c)测定所述化合物是否能选择性调节GHR的活性；其中检测到所述化合物选择性调节了GHR的活性，表明所述化合物是GHR异质双体活性的候选调节剂。该测试化合物宜是GH多肽或其一部分或变体。测试化合物可以是GHR异质双体的激动剂或抑制剂。测到该测试化合物能刺激GHR活性，表明该测试化合物是候选的激动剂。测到该测试化合物能抑制GHR活性，表明该测试化合物是候选的抑制剂。所述细胞宜为人293细胞。在所述方法的另一方面，该细胞是非洲爪蟾卵母细胞，步骤(a)包括将GHRd3cRNA导入到所述细胞中。
细胞宜是表达GHRf1和GHRd3多肽的细胞。在优选方面，步骤(a)包括在所述细胞中导入含GHRd3核苷酸序列的核酸和含GHRf1核苷酸序列的核酸。在其它方面，步骤(a)包括在表达GHRf1核酸的细胞中，导入含GHRd3核苷酸序列的核酸。另外的其它方面，步骤(a)包括在表达GHRd3核酸的细胞中导入含GHRf1核苷酸序列的核酸。
本发明也提供含GHRd3和GHRf1的编码多核苷酸的重组载体。还包括宿主细胞含本发明的重组载体。本发明也提供一组至少二个重组载体，其包含具有GHRd3多核苷酸的第一重组载体，和具有GHRf1多核苷酸的第二重组载体。本发明也提供含所述第一和所述第二重组载体的宿主细胞，以及含有所述重组载体的非人宿主动物或哺乳动物。
本发明也提供含有的GHR基因由于同源重组而敲除了含GHRd3多核苷酸载体而遭到破坏的宿主细胞。本发明也提供含有的GHR基因由于同源重组而敲除了含GHRd3多核苷酸载体而遭到破坏的非人哺乳动物宿主。
如上所述，将会明白，进行上述试验的所述方法、鉴定GHR异质双体调节剂的方法、重组的载体、宿主细胞和非人哺乳动物宿主，均可利用基本上全部外显子3都缺失的GHRd3等位基因，或可利用外显子3中含有一个或多个核酸缺失、插入或替代的GHR核酸所编码的合适GHR等位基因或同工型。
附图简述

图1显示编码GHRf1同工型的cDNA序列(SEQ ID NO1)。
图2显示GHRf1同工型号的氨基酸序列(SEQ ID NO2和3)。
图3显示围绕人GHR基因外显子3的基因组DNA序列(SEQ ID NO4)。
图4显示围绕人GHR基因GHRd3等位基因缺失的外显子3的基因组DNA序列(SEQID NO6)(Genbank登录号AF210633)。
发明详述对用重组GH治疗试验中注册的97名特发性身材矮小儿童，检查了常见的GHR外显子3变异和生长速度对GH治疗反应的关系。47名病儿中存在GHRd3等位基因，其中3人是GHRd3/d3纯合子，44人是GHRd3/f1杂合子。判定年龄、性别、GH剂量后，发现携带GHRd3变体的儿童当用GH治疗时生长速度最高。GHRd3/f1或GHRd3/d3基因型的儿童治疗第一年的生长速度为9.0±0.3cm/年，第二年为7.8±0.2cm/年，与之相比，GHRf1/f1基因型儿童分别为7.4±0.2和6.5±0.2cm/年(P＜0.0001)。该基因型分类与其它医学和治疗特征相当。因此认为GHR基因组的变异与rGH治疗效果的显著差异有关。
如上所述，本发明涉及药理遗传学和预测医学领域，该领域中采用诊断试验、预后试验和监测性临床试验来预测受试者治疗的结果。因此，本发明一方面涉及用于测定生物样品(如血液、血清、细胞、组织)中的GHR蛋白和/或核酸表达的诊断试验，来确定个体的GHR反应，具体是对用外源性GH组合物治疗起反应的性质。此试验也可用于检测个体是否患有GHR反应或活性低下的相关疾病或病症，或有发生这类疾病的危险。涉及GHR活性的疾病或病症包括身材矮小、肥胖症、感染或糖尿病；肢端肥大症或巨人症，或与其相关的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效应；与钠或水滞留相关的症状；代谢综合征；心境和睡眠障碍、癌症、心脏病和高血压。本发明也提供判定某个体是否处在发生与GHR蛋白活性有关的疾病危险中的预后(或预测)性试验。例如可测定生物样品中的GHRd3和GHRf1同工型。这种试验可用于预后或预测目的，从而可在GHR反应低下为特征的或相关的疾病发生之前，对个体进行预防性治疗，例如通过给予有效量的GH使受试者获得的最终身高与他们的遗传潜力相一致。在其它方面，本发明检测能调节GHRd3/GHRf1异质双体活性试剂的方法。这些试剂可用来治疗上述涉及GHR活性的疾病或病症。
定义术语“试剂”本文用于指化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子，优选肽或蛋白质、或从生物物质舅细菌、植物、真菌或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织制备的提取物。
本文中，对试剂或制剂的“阳性反应”或“阳性治疗反应”可定义为包括疾病或病症相关症状的减轻。例如，阳性反应可以是给予某试剂后身高或生长速度增加。本文中，对试剂的“阴性反应”可定义为包括缺乏对该试剂的阳性反应，或在给予试剂后观察到其引起的副作用。
术语“多肽”指氨基酸的聚合物，不论该聚合物的长度，因此，肽、寡肽和蛋白质都包括在多肽的定义中。此术语也不特指或排除多肽的表达后修饰。例如，包括共价结合糖基、酰基、磷酸基、脂基团等的多肽都包括在该术语多肽中。该定义也包括含有一个或多个氨基酸同类物(包括例如，非天然产生的氨基酸，只天然产生于无关生物体系中的氨基酸，哺乳动物系统的修饰氨基酸等)的多肽，含取代连接键的多肽，及本领域已知的其它修饰的多肽，天然产生的和非天然产生的多肽。
“分离的”或“纯化的”蛋白质或其生物活性部分，指基本上无来自产生该蛋白质的细胞或组织的细胞物质或其它污染性蛋白，或基本上无化学合成时的化学前体物质或其它化学物质。词语“基本上无细胞物质”包括GH或GHR蛋白制品中，该蛋白质已与产生该蛋白的细胞的细胞组分相分离，或是重组产生的。在一实施方案中，词语“基本上无细胞物质”包括GH或GHR蛋白制品中含有的非GH或非GHR蛋白(本文也称为“污染蛋白”)不到约30％(干重)，更优选非GH或非GHR蛋白不到约20％，还要优选非GH或非GHR蛋白不到约19％，最优选非GH或非GHR蛋白不到约5％。当用重组方法纪产生GH功GHR蛋白或它们的生物活性部分时，也宜基本上无细胞培养基成分，即培养基成分不到该蛋白质制品的约20％，更优选不到约10％，最优选不到约5％。
词语“基本上无化学前体物质或其它化学物质”包括GH或GHR蛋白制品中，该蛋白质已与其合成时加入的化学前体物质或其它化学物质相分离。在一实施方案中，词语“基本上无化学前体物质或其它化学物质”包括GH或GHR蛋白制品中，化学前体物质或非GH或非GHR化学物质不超过约30％(干重)，更优选化学前体物质或非GH或非GHR化学物质不超过约20％，还要优选化学前体物质或非GH或非GHR化学物质不超过约10％，最优化学前体物质或非GH或非GHR化学物质不超过约5％。
术语“重组多肽”本文用于指经人工设计的含有在它们的原始天然环境中没发现为连续多肽序列的至少二条多肽序列的多肽，或指由重组多核苷酸表达的多肽。
某核酸当将其置于与另一核酸序列功能上相关的位置上时称为“操作性相连接”。例如，将启动子或增强子操作性连接于一编码序列，使其能影响该序列的转录。关于转录调控序列，操作性连接意味着被连接的DNA序列是毗连的，当必须连接二个蛋白质编码区时，应毗连和读框内连接。
术语“引物”指一种特殊的寡核苷酸序列，它与靶核苷酸序列互补，用来与该靶核苷酸序列杂交。引物的作用是DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶催化的核苷酸聚合反应的引发点。
术语“探针”指一种确定的核酸区段(或核苷酸同类物区段，如本文定义的多核苷酸)，可用来鉴定样品中存在的特定多核苷酸序列，所述核酸区段包含与待鉴定的特定多聚核酸互补的核苷酸序列。
“测试样品”本文用于指获自感兴趣受试者的生物样品。例如，测试样品可以是生物液(如血清)、细胞样品或组织。
术语“性状”或“表型”在本文中可互换使用，指某生物体任何临床上可鉴别的、可检测的可测量的性质，如疾病的症状或易感性。术语“性状”或“表型”本文常用于指个体对作用于GHR试剂的反应。
术语“基因型”本文用于指个体或样品中存在的等位基因的鉴定。本文中基因型宜指个体或样品中存在的等位基因的说明。术语给样品或个体的等位基因作“基因分型”包括测定该个体所携带的特定等位基因。
术语“等位基因”本文用于指核苷酸序列的变体。例如，GHR核苷酸序列的等位基因包括GHRd3和GHRf1。
如本文所用，“同工型”和“GHR同工型”指由GHR基因的至少一个外显子编码的多肽。GHR同工型的例子包括GHRd3和GHRf1多肽。
术语“多态性”本文用于指在不同的基因组或个体之间发生了二种或多种交互的基因组序列。“多态性的”指在一群体中可能发现某特定基因组序列有二种或多种变体。“多态性位点”是发生变体的基因座。多态性可包括一个或多个核苷酸的替代、缺失或插入。单一核苷酸多态性是一个碱基对台戏改变。
如本文所用，“外显子”指存某间断基因的任何区段，它在于成熟的RNA产物中。
如本文所用，“内含子”指成熟RNA产物中不存在的某间断基因的片段。内含子是原始核转录物的一部分，但被剪掉而产生mRNA，mRNA然后转运到胞质中。
如本文所用，“生长激素”功“GH”指生长激素的天然序列或变体形式，可来自任何来源，天然的、合成的或重组的。例子包括但不限于人生长激素(hGH)，它是含人天然序列的天然或重组GH(如GENOTROPINTMTM，生长激素(somatotropin)或促生长激素(somatropin))；和重组生长激素(rGH)，其指通过重组DNA技术产生的任何GH或GH变体，包括人蛋氨生长素、生长激素、促生长激素、培维索孟(pegvisomant)。GH分子可以是GHR的激动剂或拮抗剂。
如本文所用，“生长激素受体”或“GHR”指生长激素受体的天然序列或变体形式，可得自任何来源，天然的、合成的或重组的。术语“GHR”包括GHRd3和GHRf1同工型。例子包括人生长激素受体(hGHR)，是为含人天然序列的天然或重组的GHR。如本文所用，“GHRd3”指外显子3缺失的GHR同工型。术语“GHRf1”指含有外显子3的GHR同工型。术语GHRd3包括但不限于Urbanek M等，Mol Endocrine 1992 Feb；6(2)279-87(纳入本文作参考)中所述的多肽。术语GHRf1包括但不限于Leung等，Nature.330537-543(1987)中所述的多肽(纳入本文作参考)。
术语“GHR基因”本文包括编码GHR蛋白的基因组mRNA和cDNA序列，包括基因组DNA中的不被翻译的调节区。术语“GHR基因”也包括GHR基因的等位基因，如GHRd3等位基因和GHRf1等位基因。
人GHR基因和蛋白质人GHR基因是一种单拷贝基因，横跨5p13-12染色体区的90kb。这含有9个编码外显子(编号2-10)和几个不被翻译的外显子外显子2编码信号肽，外显子3-7编码胞外结构域，外显子8编码跨膜结构域，外显子9和10编码胞质结构域。如上所述，hGHRd3蛋白不同于肝脏hGHR之处在于该受体的胞外结构域中缺失了22个氨基酸(Godowski等，1989)。纳入本文作参考的Genbank登录号AF155912所公开的序列提供了GHR基因外显子周围基因组DNA区域的核苷酸序列(如GHRf1等位基因)。这个6.8bp片段包含外显子3和内含子2和3的一部分，还包含二个251bp重复元件。这些重复元件侧接外显子3的5’和3’端，二重复元件位于该外显子的上游577bp和下游1821bp处。此二元件含有属于HERV-P家族的人内源性逆转录病毒的171bp长末端重复(LTR)片段(Boeke，J.D.和Stoye，J.P.(1997)，选自Retroviruses(Coffin，J.M.，Hughes，S.H.和Varmus，H.E.编，pp.343-435，Coid Spring HarborLaborator，Cold Spring Harbor，NY)。该LTR之后是80bp的中等重复频率NER-4型序列(Smit，A.F.(1996)Curr.Opin.Genet.Dev.6743-748)。此二个长251bp拷贝的序列称为5’和3’重复序列，有99％的相同性，只在该序列的14、245和246处有三个核苷酸不同。特别是，Pantel等(2000)报告说，位于外显粒子3上游的该元件在14位是胞嘧啶，245和246位是胸腺嘧啶；而位于外显子3下游的该元件这些位置是鸟嘌呤、胞嘧啶和腺嘌呤。此外，发现有病毒来源的其它序列侧接外显子3。
GHRd3等位基因记功有外显子3和内含子2和3周围部分的缺失。与GHRf1等位基因不同，GHRd3等位基因含有一个251bpLTR，它在序列上与GHRf1上鉴定出的3’拷贝LTR元件相同。GHRd3等位基因的基因组DNA序列缺失了外显子3区，见Genbank登录号AF210633所公开的序列(纳入本文作参考)。根据GHRd3和GHRf1序列，可利用检测GHR核酸或多肽的已知方法来测定某个体是否带有GHRd3等位基因。
含外显子3缺失的GHRd3蛋白与全长hGHR(GHRf1)不同在于该受体的胞外结构域中缺失了22个氨基酸。因此可用任何已知方法来检测GHRd3或GHRf1的存在。也可检测到GHRd3和GHRf1的截短形式，或截短形式如“高亲和力的生长激素结合蛋白”、“高亲和力的GHBP”或“GHBP”，指存在于几种生物循环血液中的具有GHBP功能的GHR的胞外功能域(Ymer和Herington，1985.Mol Crll Endocrinol.41153；Smith和Talamantes，1988.Endocrinology，1231489-1494；Emtner和Roos，ActaEndocrinologica(Copenh.)，122296-302，1990.包括人。Baumann等，J ClinEndocrinol Metab.，62134-141，1986；EP 366，710；Herington等，J Clin Invest.，771817-1823，1986；Leung等，Nature.330537-543，1987)。已有测定血清中功能性GHBP的各种方法，优选的方法是美国专利5,210,017中所述的配体介导的免疫功能试验(LIFA)和本文所述的其它试验。
GHRd3在诊断学、治疗和试剂遗传学中的用途在优选实施方案中，本发明涉及测定受试者是否表达与对治疗的反应增高或降低相关的，或与GHR活性升高或降低相关的GHR等位基因。可通过检测GHR蛋白或核酸来测定某受试者是否表达GHR等位基因。
治疗、诊断功评估受试者的方法宜包括评估或测定受试者是否表达GHRd3和/或GHRf1等位基因，如测定受试者是否为GHRf1等位基因工程的纯合子(GHRf1/f1)，GHRd3等位基因的纯合子(GHRd3/d3)或杂合子(GHRd3/f1)。因此本发明优选包括测定生物样品中是否表达GHRd3，测定步骤包括a)使所述生物样品接触i)能在严谨条件下与GHRd3核酸杂交的多核苷酸；或ii)能选择性结合GHRd3多肽的可检测性多肽；和b)检测所述多核苷酸与所述样品中的RNA种类之间是否发生杂交，或所述可检测性多肽是否能结合样品中的多肽。检测到所述杂交或所述结合，表明所述样品中表达有所述GHRd3等位基因或同工型。所述多核苷酸优选是引物，其中，通过检测含有所述引物序列的扩增产物的存在，而检测所述杂交的发生，或可检测性多肽是抗体。
也考虑测定哺乳动物(优选人)的GHRd3表达水平是否增高或降低的方法，该方法包括a)提供所述哺乳动物的生物生物样品；和b)比较所述样品中GHRd3多肽的量，或编码GHRd3多肽的GHRd3 RNA的量与对照样品所检测到的水平或期望水平。所述生物样品中所述GHRd3多肽或所述GHRd3 RNA的量，与所述对照样品所检测到的水平或期望水平相比若高，表明所述哺乳动物的GHRd3表达水平高；所述生物样品中所述GHRd3多肽或所述GHRd3 RNA的量，与所述对照样品所检测到的水平或期望水平相比若低，表明所述哺乳动物的GHRd3表达水平降低。
检测生物样品中是否存在GHRd3蛋白或核酸的示范性方法包括获得测试受试者的生物样品，使该生物样品接触能检测GHRd3蛋白或编码GHRd3蛋白的核酸(如mRNA，基因组DNA)的化合物或试剂，以检测生物样品中GHRd3蛋白或核酸的存在。检测GHRd3 mRNA或基因组的优选试剂，是能与GHRd3 mRNA或基因组DNA杂交的标记的核酸探针。该核酸探针可以是，例如人的核酸或及一部分，如长至少15、30、50、100、250或500个核苷酸并能在严谨条件下与GHRd3 mRNA或基因组DNA充分杂交的核酸探针。用于本发明诊断试验的其它探针如本文所述。
检测GHRd3蛋白的优选试剂是能结合GHRd3蛋白的抗体，优选带可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆抗体，更优选单克隆抗体。可采用完整抗体或及片段(如Fab或F(ab’)2)。术语“标记的”探针或抗体指通过偶联(即物理性连接)一可检测物质于该探针或抗体来直接标记，及通过与另一直接标记的试剂反应来间接标记该探针或抗体。间接标记的例子包括用荧光标记的第二抗体和末端标记了生物素的DNA探针(可用荧光标记的链霉亲和素检测)来检测第一抗体，术语“生物样品”包括分离自受试者的组织、细胞和体液。即可用本发明的检测方法检测体外及体内的生物样品中的候选mRNA、蛋白质或基因组DNA。例如，体外检测候选蛋白质的技术包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印迹、免疫沉淀和免疫荧光。体外检测候选基因组DNA的技术包括Southern杂交。另外，体内检测GHRd3蛋白质的技术包括将标记的抗抗体导入受试者体内。例如可用放射活性标志标记抗体，然后用标准的成象技术检测受试者体内该抗体的存在位置。
在一实施方案中，生物样品含有受试者的蛋白质分子。或者，生物样品可含有受试者的mRNA分子或受试者的基因组DNA分子。优选的生物样品是用常规方法分离自受试者的积血清样品。
本发明也包括检测生物样品中存在的GHRd3蛋白、mRNA或基因组DNA的试剂盒。例如，该试剂盒可装有能检测生物样品中的GHRd3蛋白或mRNA的标记的化合物或试剂；测定样品中GHRd3蛋白或mRNA量的试剂；将样品中的GHRd3蛋白、mRNA或基因组DNA与标准品作比较的试剂。所述化合物或试剂可装在适当的容器中。该试剂盒还或包括此试剂盒检测GHRd3蛋白或核酸的用法说明书。
最优选地，可利用本文所述的试验，如上面的诊断试验或后面的试验，来鉴定受试者是否具有GHR反应低下或有发生此病的危险。具体说，鉴定出受试者为GHRf1纯合子就有GHR反应低下或有发生此病的危险。其它方面，可利用本文所述的诊断方法鉴定受试者具有此病或有发生此病、有发生反常的或更具体说GHR水平低下相关疾病或性状的危险。例如可利用本文所述的试验，如上面的诊断试验或后面的试验，来鉴定受试者是否具有或有发生GHR水平、表达或活性低下相关症状的危险。在另一实施例中，可利用本文所述的试验，来鉴定受试者是否具有或有发生GHR水平、表达或活性低下的危险。如上所述，预计GHRd3/f1杂合子的GHR反应性或GHR活性比GHRf1/f1纯合子要高。
可用本文所述的预后试验来测定是否按照那个给药方案给予受试者通过GHR通路发挥作用的制剂来治疗疾病或病症。因此，本发明提供测定某受试者是否能扩通过学习GHR通路发挥作用的试剂有效治疗的方法，在该法中获得测试样品，并测定GHRd3蛋白或核酸的表达式或活性。如上所述预计显示了GHRd3蛋白或核酸表达的受试者对所述试剂的阳性反应，比不显示GHRd3或核酸表达的受试者要高。
大部分情况下，由于给予通过GHR介导的通路而发挥作用的试剂可能适合于对该试剂的反应增高或降低的受试者，因而检测个体对GHR活性低下的易感性非常重要。所述试剂不一定必须直接作用于GHR蛋白，也可作用于GHR蛋白的上游，例如作用于最终能与GHR蛋白相互反应的另一分子。在优选实施方案中，该试剂是直接作用于GHR蛋白的试剂。更优选该试剂是结合GHR蛋白起激动剂或拮抗剂作用的试剂。在其它实施方案中，该试剂是能结合但不能激活GHR蛋白的GH蛋白。
涉及GHR的疾病包括，例如身材矮小、肥胖症、感染或糖尿病；肢端肥大症或巨人症，或与其相关的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效应；与钠或水滞留相关的症状；代谢综合征；心境和睡眠障碍、癌症、心脏病和高血压。因此，可利用本发明的方法来预测对用于这些疾病任何一种的治疗试剂的反应。
如上所述，本发明公开了治疗选自患有身材矮小、肥胖症、感染或糖尿病；肢端肥大症或巨人症，或与其相关的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效应；与钠或水滞留相关的症状；代谢综合征；心境和睡眠障碍、癌症、心脏病和高血压疾病的受试者的方法，该方法包括(a)测定该受试者中是否存在GHR基因的等位基因，所述的该等位基因与具有对能改善所述疾病的试剂治疗反应高或低的可能性相关连；和(b)选择或确定给予所述受试者的所述试剂的有效量。
因此，本发明也涉及治疗哺乳动物优选人的方法，该方法包括以下步骤—任选地测定某个体的DNA是否编码GHRd3蛋白；—选出其DNA不编码GHRd3蛋白的个体；—随访所述个体有无GHR反应低下相关症状表现；和—在适当时期给予所述个体有效量的针对GHR反应低下或针对其症状的治疗性试剂。
本发明另一实施方案包括治疗哺乳动物优选伯方法，该方法包括以下步骤—任选地测定某个体的DNA是否编码GHRd3蛋白；—选出其DNA不编码GHRd3蛋白的受试者；—给予所述个体针对GHR反应低下的预防性治疗试剂。
在另一实施方案中，本发明涉及治疗哺乳，动物优选人，的方法，该方法包括以下步骤—任选地测定某个体的DNA是否编码GHRd3蛋白；—选出其DNA不编码GHRd3蛋白的个体；—随访所述个体有无GHR反应低下相关症状的表现和发展；和任选地—在适当时期给予所述个体针对GHR反应低下或针对其症状的治疗性试剂。
为了用于确定个体治疗的过程，本发明还涉及的治疗方法包括以下步骤—选出其DNA编码与GHR反应、活性或表达低下相关的，或与其症状相关的蛋白质的个体—给予所述个体针对GHR反应低下或其症状的治疗有效量试剂。在优选实施方案中，所述与GHR反应低下或与其症状相关的蛋白质是GHR蛋白，更优选GHRf1蛋白。最优选的个体是GHRf1/f1同工型纯合子。
本发明方法所述个体可以是患以下疾病的个体身材矮小(如优选ISS)、肥胖症、感染或糖尿病；肢端肥大症或巨人症，或与其相关的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效应；与钠或水滞留相关的症状；代谢综合征；心境和睡眠障碍、癌症、心脏病和高血压。
GHR反应低下，宜为对能通过GHR通路发挥作用的，或更宜为对能结合GHR蛋白的试剂的治疗反应低下。这类试剂的优选例子包括治疗身材矮小、肥胖症、感染或糖尿病；肢端肥大症或巨人症，或与其相关的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效应；与钠或水滞留相关的症状；代谢综合征；心境和睡眠障碍、癌症、心脏病和高血压病的试剂。
对于GHR反应低下或其症状的有效治疗，可能在某适当方面与对不具有GHR反应低下个体的治疗有所不同。一个方面，这种治疗在给予的试剂剂量上不相同。另一方面，这种治疗在试剂配方上不相同。另一方面，该方法在给予组合物的时间上不相同。还有一方面，用于有效治疗GHR反应低下或其症状的试剂在结构上与用于治疗所述疾病(如身材矮小、肥胖)的试剂不同。在一优选方面，给予GHRf1纯合子个体的含有GH蛋白、其变体或片段的组合物在剂量上，比给予其DNA编码GHRd3蛋白的个体要高。
优选所述试剂是GH多肽或其片段，更优选重组GH多肽或其片段，它们的例子将在本文中进一步讨论。重组GH多肽可以是GHR激动剂(如用于提高生长率或治疗肥胖)或GHR拮抗剂(如治疗肢端肥大或巨人症)。将在本文作进一步讨论的所述反应，可以是身高或生长速度的变化，肥胖症状(如体重指数BMI)、感染或糖尿病症状的改善；肢端肥大症或巨人症的改善；或钠或水滞留、代谢综合征、心境和睡眠障碍、癌症、心脏病和高血压相关症状的改善。
一方面，所述个体可以是已经患有或怀疑患有疾病的个体，和可以是已经过治疗，可以是正将治疗的个体，或可以是进一步治疗的候选者。最优选所述个体是患有或怀疑患有选自身材矮小、肥胖症、感染或糖尿病；肢端肥大症或巨人症，或与其相关的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效应；与钠或水滞留相关的症状；代谢综合征；心境和睡眠障碍、癌症、心脏病和高血压疾病的个体。在优选方面，本发明提供治疗患有一种或多种所述疾病的方法。本发明可给予这些具有上述GH反应低下的受试者具体的治疗方法。
获得待治疗个体的DNA样品以测定该DNA是否编码GHRd3蛋白。分析该DNA样品以确定它是否含有GHRd3序列或该个体是否为GHRf1同工型的纯合子。DNA若编码GHRd3蛋白将会对该试剂治疗有更强的阳性反应，DNA缺乏编码GHRd3的等位基因的个体与GHRd3个体相比，阳性反应将低下。
本发明方法也可用于评估和进行药物的临床试验。所述方法包括鉴定对所述药物有阳性反应的第一群个体，和对所述药物为阴性反应、可其对所述药物阳性反应比所述第一群个体低下的第二群个体。在一实施方案中，给予临床试验中的受试者药物，如果其DNA样品含有对该药物治疗阳性反应相关的一种或多种等位基因，和/或如果其DNA样品缺乏与对该药物治疗为阴性或低下阳性反应相关的一种或多种等位基因。另一方面，给予临床试验中的受试者药物，如果其DNA样品含有对该药物治疗为阴性或低下阳性反应相关的一种或多种等位基因，和/或如果其DNA样品缺乏与对该药物治疗为阳性反应或阳性反应增强相关的一种或多种等位基因。
因此可采用本发明方法通过考虑药的临床试验对象中GHR反应的差异来评估药物的效率。如果需要，评价药物效率的试验可在包含基本上对该药物具有有利反应的个体人群中进行，或在包含基本上对该药物的反应不如另一人群的个体人群中进行。例如，可在GHRd3个体人群可在GHRf1/f1个体中人群中评价含GH蛋白的组合物。另一方面，设计用来治疗GH反应低下个体的药物可优选在GHRf1/f1个体人群中评价。
检测GHRd3和GHRf1考虑可按照本发明通过检测具体核酸中核苷酸的变化来鉴定GHR基因的其它突变(美国专利4,988,617，纳入本文作参考)。为此考虑可采用的各种不同试验包括但不限于原位杂交荧光检测(FISH美国专利5,633,365和5,665,549，各自内容纳入本文作参考)，直接DNA测序，PFGE分析、Southern或Northern印迹，单链构型分析(SSCA)，RNA酶保护试验，等位基因特异性寡核苷酸(ASO，如美国专利5,639,611)，斑点印迹分析变性梯度凝胶电泳(如美国专利5,190,856，纳入本文作参考)，RFLP(如美国专利5,324,631，纳入本文作参考)和PCR-SSCP。检测和定量生物液体事的基因序列的方法风美国专利5,496,699中所述，其内容纳入本文作参考。
引物和探针术语引物在这里定义为包括能在模板-依赖性过程中引导巢式核酸合成的任何核酸。通常引物是长10-20个碱基对的寡核苷酸，但可采用更长的序列。引物以双链或单链形式提供，虽然优选单链形式。探针有不同定义，虽然它们也可作为引物。探针虽然也可引导，但设计用于结合靶DNA或RNA，在扩增过程中不需要使用。
图3和4分别提供了围绕GHR基因中外显子3或缺失外显子3位点的基因组DNA序列SEQ ID NO1显示了GHRf1 cDNA。本发明可利用GHRd3和GHRf1等位基因之间核苷酸序列的任何一个差别来检测和鉴别个体中的具体GHR等位基因。为鉴定GHRf1基因组DNA或cDNA分子，可设计能与外显子3核酸杂交的引物。为鉴定GHRd3基因组DNA，可设计跨越GHR基因的内含子2和3连接区的引物或探针，如在GHRd3等位基因工程的基因组DNA中所见那样，从而可鉴别含外显子3的GHRf1等位基因与不含外显子3的GHRd3等位基因。在另一实施例中，可设计跨越外显子2和4连接区的引物或探针来鉴定GHRd3cDNA分子，从而鉴别含外显子3的GHRf1cDNA分子与不含外显子3的GHRd3cDNA分子。检测GHRd3的合适引物的其它例子见Pantel等(同上)和以下实施1中的列表。
本发明包括用于本发明方法中推辞为引物和探针的多核苷酸。这些多核苷酸由，基本上由，或含有本文提供的任何序列的连续核苷酸序列，及其互补序列组成。“连续序列”可以至少长25、35、40、50、70、80、100、250、500或1000个核苷酸，这样长度的连续序列与特定序列ID的长度相一致。应注意本发明的多核苷酸不限于具有围绕感兴趣靶序列(见序列表中的编号)的精确的侧接序列。而是，应知道多态性周围的侧接序列，或任何一个距标志更远的本发明的探针引物，可长于或短于与它们的用途相容的任何长度，本发明特别考虑这样的序列。将会明白本文所指的多核苷酸可以是与它们用途相容的任何长度。连续序列外的侧接区域不需要与受试者真实产生的天然侧接序列同源。其它要特别考虑的是任何一种核苷酸序列应与该核苷酸的用途相容。优选的多核苷酸可由，基本上由，或含有SEQ ID NO1、4或6序列的，或与其相互补序列的连续核苷酸序列。该“连续序列”至少长8、10、12、15、50、70、80、100、250、500或1000个核苷酸。
可从本领域已知的任何方法所公开的序列，具体是能测试本文公开的特定序列或标记的方法，设计本发明的探针。可以用本领域已知的任何方式设计用于本发明杂交试验的优选探针组，使它们能选择性结合多态性的一个等位基因，但在具体的试验条件下不结合其它基因。
如果需要，可标记本发明的任何时候一种多核苷酸，即加入可被分光光度法、光化学法、生物化学方法、免疫化学法或化学方法检测的标记。例如，有用的标记包括放射活性物质、荧光染料和生物素。优选在多核苷酸的3’和5’端标记。也可利用标记来捕捉引物，以促进引物，或引物延伸产物如扩增的DNA，固定在固相支持物上附着于引物或探针的捕捉标记可以是能与固相试剂的一特异性结合成员(如生物素)形成结合对的另一特异性结合成员(如链霉亲和素)。因此取决于多核苷酸或探针所带的标记类型，可用一捕捉或检测靶DNA。另外，将会理解本文所提供的多核苷酸、引物或探针本身可作为捕捉标记。例如，就一固相试剂的结合成员是一核酸序列而言，可选择该成员能结合引物或探针的互补部分，从而可将该引物或探针固定在固相上。当多核苷酸探针本身作为结合成员，本领域技术人员知道该探针含有不与靶序列互补的序列或“尾”。当多核苷酸引物本身作为捕捉标记时，该引物的至少一部分将不与固相上的核酸杂交。DNA标记技术是本领域技术人员熟知的。
可将本发明的任何多核苷酸、引物和探针方便地固定在固相支持物上。固相支持物是本领域技术人员知道的，包括反应盘的壁或孔、试管、聚乙烯珠、磁珠、硝酸纤维条、膜、微粒如乳胶颗粒、绵羊(或其它动物)的红细胞、duracyte等。固相支持物不是关键可由本领域技术人员选择。因此，乳胶颗粒、微粒、磁性或非磁性小珠、膜、塑料试管、微滴板孔的壁、玻璃或硅芯片、绵羊(或其它动物)的红细胞、duracyte等都是适当的例子。将核本固定到固相上的合适方法包括离子性、疏水性、共价反应等。要文所用的固有相支持物指不溶性材料，或可通过后续反应变成不溶性的材料。可选择天生能结合和固定捕捉试剂的固相支持物。或者，可在固相上保留能结合和固定捕捉试剂的其它受体。该其它受体可包括一带电物质其电荷与捕捉试剂自身的电荷相反，从而可结合该捕捉试剂。或者，该受体分子可以是固定(结合)在固相支持物上的一种特异性结合成员，能通过特异性结合反应来固定该捕捉试剂。该受体分子能在试验前或试验期间将捕捉试剂间接结合于固相支持物/固相支持物可以是塑料、衍生化塑料、磁性或非磁性金属、试管的玻璃或硅表面、微滴板孔、纸、珠、微粒、芯片、绵羊(或其它动物)的红细胞、duracytes和本领域普通技术人员已知的其它构型。本了明的多核苷酸可单独或将本发明的至少2、5、8、10、12、15、20或25个不同多核苷酸组合结合或固定于一个固相支持物上。此外，可将本发明之外的多核苷酸，如同本发明的一个或多个多核苷酸那样，结合于同一个固相支持物上。
本文提供的任一多核苷酸可附着于固相支持物上的重叠区域或随机部位。或者，本发明的多核苷酸可附着在编号的阵列中，在阵列中每个多核苷酸附着在与任何其它多核苷酸附着点不相重叠的固相支持物的独特区域。这种有序的多核苷酸阵列称为“可寻址”阵列，其中各特定部位都有记录并可作为试验程序的一部分进入。可寻址的多核苷酸阵列包含有众多不同的寡核苷酸探针，它们与各不同的已知部位基底表面相偶联。知道各多核苷酸的精确部位使这些“可寻址”阵列特别有用于杂交试验。可采用本发明的多核苷酸和该领域已知的任何可寻址阵列技术。已知的这些多核苷酸阵列的一个具体实施方案是Genechip，在美国专利5,143,854；和PCT出版物WO 90/15070和92/10092中有所描述。这些阵列通常可用机械合成方法或光指导的合成方法，加光刻蚀法和和固相寡核苷酸合成的组合方法产生(Fodor等，Science，251767-777，1991)。寡核苷酸阵列固定在固相支持物上赋予了开发通常鉴定为“非常大规模固定的聚合物”(VLSIPS)技术的可能性，此法中，探针通常固定在芯片固相表面上的向密度阵列中。美国专利5,143,854和5,412,087和PTC出版物WO 90/15070\WO 92/10092和WO 95/11995中提供了VLSIPS技术的例子，描述了通过例如光指导合成技术形成寡核苷酸阵列的方法。设计的策略目的是提供固定在固相支持物上的核苷酸阵列，进一步开发了目前的策略在芯片上排列和展示寡核苷酸阵列以图获得最高的杂交模式和序列信息。目前策略的例子见PTC出版物WO94/12305、WO 94/11530、WO 97/29212和WO 97/31256中所述。
模板依赖性扩增方法模板的数量取决于用于扩增某给定模板样品中标记序列的方法。一种最为熟悉的扩增方法是聚合酶链式反应，详见美国专利4,683,195、4,683,202和4,800,159以及Innis等，PCR Protocols，Academic Press，Inc.San Diego Caiif.，1990中所述，它们的内容纳入本文作参考。
简言之，在PCR中，制备二条与标记序列相反互补链上的区域相互补的引物。在反应混合物中加入过量的脱氧核苷酸三磷酸的DNA聚合酶，如Taq聚合酶。如果样品中存在有标记序列，引物将与其结合，而聚合酶将沿该标记序列添加核苷酸导致引物延伸。通过升高和降低反应混合物的温度使延伸的引物从标记物上解离下来形成反应产物，过量的引物将结合标记物和反应产物，重复此过程。
可进行逆转录酶OCR扩增以定量检测扩增的mRNA量。将RNA逆转录为cDNA的方法是熟知的，见Sambrook等，选自Molecular Cloning.A Laboratory Manual第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor.N.Y.，1989。其它逆转录方法利用耐温的RNA-依赖性DNA聚合酶。这些方法风WO 90/07641中的描述。聚合酶链式反应的方法是本领域熟知的。
另一种扩增方法是连接酶链式反应(“LCR”美国专利5,494,810、5,484,699和欧洲专利320,308，各自内容纳入本文作参考)在LCR中，制备二对互补的探针，每对可结合它们紧邻的靶序列的相反互补链。存在连接酶时，该二对探针相连接形成一个单元。
通过温度的循环变化，PCR中相连的单元从靶上解离下来，可作为过量的探险针对的“靶序列”。美国专利4,883,750描述了一种类似于LCR的使探针对与靶序列结合的方法。
Qbeta复制酶、RNA-指导的RNA聚合酶也是可用于本发明的另一种扩增方法。此法中，将具有与靶序列相互补区域的复制性RNA序列加入到存在RNA聚合酶的样品中。该聚合酶将拷贝可被检测的该复制性序列。其内容纳入本文作参考的美国专利4,786,600也描述了类似方法，是关于用RNA指导的RNA聚合酶合成互补性单链分子时，可作为模板的重组RNA分子。这样形成的产物分子可作为合成原初重组RNA分子其它拷贝的模板。
一种等温扩增方法中，采用限制性内切核酸酶来扩增靶分子，其在一条链中含有核苷酸5’-[α-硫代]-三磷酸限制性位点，也可用于扩增本发明的核酸(Walker等，1992，Pro Natl Acad Sci USA.89392-396；美国专利5,270,184，纳入本文作参考)。美国专利5,747,255(纳入本文作参考)描述了采用可切割寡核苷酸进行等温扩增作多核苷酸检测。在本文所述方法中，提供含有彼此相互补的序列的不同群寡核苷酸，当它们至少含有一个可被切断的可剪切连接键，当适宜的匹配双链体形成时含有此连接键。当靶多核苷酸接触第一寡核苷酸时，发生切割，产生的第一片段可与第二寡核苷酸杂交。发生这种杂交时，第二寡核苷酸被切断释放出第二片段，该第二片段进而以类似于靶多核苷酸的方式与第一寡核苷酸杂交。
标准置换式扩增(SDA)是进行核酸等温扩增的另一种方法，该方法包括多轮标准置换和合成，即缺口翻译(如美国专利5,744,311、5,733,752、5,733,733、5,712,124)。一种类似方法称为修补链式反应(RCR)，其包括在扩增的靶区域中使若干探险针退火，然后进行的修补反应中4个碱基只存在2个碱基，每次检测时其它2个碱基作为生物素化衍生物加入。在SDA中采用了类似方法。也可用循环(CPR)检测靶特异性序列。在CPR中，具有非特异性DNA的3’和5’序列及特异性RNA的中间序列的探针，与样品中存在的DNA杂交。杂交后用RNA酶H处理反应物，鉴定探针的产物，经消化后释放成为特定性产物。使最初的模板与另一循环探险针退火并重复此反应。
其内容纳入本文作参考的GB专利申请2,202,328和PCT专利申请PCT/US89/01025中还描述了另一种扩增方法可用于本发明。在前一申请中，“修饰”的引物用于PCR样的模板和酶依赖的合成中。所述引物采用可捕获分子(如生物素)和/或可检测分子(如酶)作标记进行修饰。在后一申请中，将过量的探针加入样品中。存在靶序列时，探针结合并被催化而切断。切断后完整释放出的靶序列被过量探针结合。切下的标记的探针表明存在有靶序列。
其它核酸扩增技术包括基于转录的扩增系统(TAS)，包括核酸序列为基础的扩增(NASBA)和3SR(Kwok等，1989，Pro Natl Acad Sci USA.861173；和WO 88/10315，其内容纳入本文作参考)。在NASBA中，可通过标准的苯酚/氯仿抽提法、临床临床样品热变性、用裂解液和微离心柱分离DNA和RNA、或氯化胍提取RNA来制备用于扩增的核酸。这些扩增技术包括退火具有靶特异性序列的引物。聚合反应后，用RNA酶H消化DNA/RNA杂交体，同时再加热变性双链DNA分子。在此二种情况下，通过加入第二靶特异性引物然后聚合，将单链DNA制成完整的双链。然后用RNA聚合酶，如T7或SP6多重转录该双链DNA分子。在等温循环反应中，RNA被逆转录为单链DNA，其再转变为双链DNA，然后再用RNA酶如T7或SP6转录一次。所得产物无论是截短的或完整的，显示了靶特异性序列。
Davey等在欧洲专利329,822(其内容纳入本文作参考)中公开的核酸扩增方法包括循环合成单链RNA(“ssRNA”)、ssDNA；和双链DNA(dsDNA)，可用于本发明。该ssRNA是第一引物寡核苷酸有模板，可通过逆转录酶(RNA依赖的DNA聚合酶)延伸。然后通过核糖核酸酶H(RNA酶H，一种使RNA与DNA或RNA形成双链体的特异性RNA酶)的作用从获得的DNA:RNA双链体中去除RNA。产生的ssDNA作为第二引物的模板，也含有其5’端与该模板同源的RNA聚合酶启动子(示范性的如T7 RNA聚合酶)的序列。然后用DNA聚合酶(示范性的如大肠杆菌DNA聚合酶I的大“Klenow”片段)延伸该引物，产生的双链DNA分子(“dsDNA”)具有与二引物之间初始RNA相同的序列和在一端附加的启动子序列。该启动子序列通过适当的RNA酶可用于制备该DNA的许多拷贝。然后让这些拷贝再进入循环导致极其迅速的扩增。用适当选择的酶，可在等温下进行扩增而无须在每轮中加入酶。因为此方法的循环性质，可选择DNA或RNA形式的起始序列。
PCT申请WO 89/06700(其内容纳入本文作参考)分开了一种核酸序列扩增方案，依据启动子/引物序列与单链靶DNA(“ssDNA”)杂交，然后将此序列转录成许多RNA拷贝。此方案不是循环性的，即新模板不产生自得到的RNA转录物。其它扩增方法包括“RACE”和“一侧PCR”(Frohman，选自PCR Protocols.A Guide To Methodsana Applications Academic Press N.Y.，1990；O’hara等，1989.Pro Natl AcadSci USA.，865673-5677；各自内容纳入本文作参考)。
在本发明的扩增步骤中也可采用基于二条(或多条)寡核苷酸在存在具有所得“双-寡核苷酸”序列的核酸时，相连接，从而扩增该双-寡核苷酸(Wu等，1989，Genomics，4560，纳入本文作参考)。
Southern/Northern印迹印迹技术是本领域技术人员熟知的。Southern印迹涉及采用DNA作靶子，而Northern印迹用RNA作靶子。各自提供不同类型的信息，虽然cDNA印迹在许多方面与RNA型印迹相类同。
简言之，采用的探针可靶向已固定在适当基质(常用硝酸纤维滤膜)上的DNA或RNA。不同的核酸应分开固定以有利于分析。常用核酸凝胶电泳分离然后“印制”到滤膜上。
随后将印制的靶分子在能促进变性和重杂交的条件下与探针(常作标记)一起培育，由于设计的探针与靶序列碱基相配，在复性条件下探针将结合靶序列的一部分。除去未结合的探针，如上所述进行检测。
分离方法通常希望在一个阶段或另一阶段，将扩增产物与模板和过量的引物分开，目的是确定是否发生的特异性扩增。在一实施方案中，用标准方法通过琼脂糖、琼脂糖-丙烯酰胺或聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离扩增产物。见Sambrook等，1989。
或者，可采用层析技术来有效分离。有许多类型的层析技术可用于本发明吸附、分相、离子交换和分子筛；使用它们的许多志门化技术包括柱子、纸、薄层和气相色谱(Freifelder.Physical Biochemistry Applications to Biochemistry andMolecular Biology，第二版，Wm，Freeman and Co.，New York，N.Y.1982。
检测方法可观察产物以证实扩增了标记序列。一种典型的观察方法涉及用溴乙锭染色在紫外线灯下观察。或者，如果可使扩增产物暴光X线胶片，在适当的激发光谱下观察，然后分离。
在一实施方案中，进行间接观察。分离扩增产物后，使标记的探针与扩增的标志序列接触。宜将该探针与生色基团相偶联而不是放射标记。在另一实施方案中，使探针与结合伴侣，如抗体或生物素相偶联，该结合对的另一成员携带有可检测基团。在一实施方案中，用标记的探针作检测。涉及的技术是本领域技术人员熟知的，在许多分子方案的标准教课书中可以找到。见Sambrook等，1989。例如在扩增期间或之后鉴定生色团、放射标记探针或引物。
纳入本文作参考的美国专利5,279,721描述了一个例子，分开了自动化电泳和核酸转移的装置和方法。其装置可进行电泳和印迹，无须过多凝胶操作，很理想地适合进行本发明的方法。
此外，可采用标准的序列分析技术，对上述扩增产物进行序列分析以鉴定特定种类的变体。在某些方法中，采用为最优测序设计的引物组作序列分析进行基因的大量分析(Pignon等，1994，Hum Mutat，3126-132)。本发明提供的方法可采用所有这些类型的分析。采用本文公开的序列，可设计寡核苷酸引物来扩增整个GHR基因的序列，然后用直接测序分析。
各种测序反应是本领域知道的，可通过比较样品的序列与相应的野生型(对照)序列直接测定GHR基因的序列。测序反应的例子包括Maxam and Gilbert((1977)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74560)或Sanger((1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463)所发展的技术。当进行诊断性试验时也考虑可采用各种自动化测序方法之一种。
试剂盒组分检测和测序GHR及其变体需要的所有必须材料和试剂可一起装在试剂盒中，这通常包括预先选择的探针，也包括适合扩增核酸的酶，包括各种聚合酶(RT、Taq、SequenaseTM等)，脱氧核苷酸，以提供扩增所必须的反应混合物。这种试剂盒通过包括适合方式的各试剂和酶及各个引物或探针的不同容器。
相关的定量测定RT-PCRTM的设计和滴度倒数考虑可采用将RNA逆转录(RT)为cDNA然后进行相关的定量测定PCR(RT-PCR)，来测定分离自受试者的特异性mRNA的相对浓度。通过测定特特性mRNA的浓度变化，显示编码该特异性MRNA的基因有差异必表达。例如可用定量PCR来检查待用通过GHR通路起作用的试剂治疗的受试者，怀疑患GHR活性低下或优选患有39-15。。的受试者中GHRd3和GHRf1 mRNA的相对水平。
在PCR中，扩增的靶DNA分子的数目在反应每轮循环中以接近2的因数增加，直到某些试剂变得有限。因此扩增速率递增性降低直到二轮之间被扩增的靶序列不再增加。如果制作的点状图中，X轴为循环轮次，Y轴为扩增的靶DNA浓度的对数，连接各点形成具有特征性形状的曲线。从第一轮开始，该曲线的斜率是阳性和恒定的，即是说这是该曲线的线性部分。在某试剂变得有限后，此曲线的斜率开始下降并最终变成零。在此点，扩增的靶DNA浓度变成接近某固定值的渐进线。即是说这是该曲线的平台部分。
在反应开始之前，PCR扩增线性部分靶DNA的浓度与该靶序列的起始浓度成正比。通过测定完成了相同轮次PCR反应时靶DNA扩增产物的浓度在它们的线性范围内，可能测出原初DNA混合物中特异性靶序列的浓度。如果该DNA混合物是从分离自不同组织或细胞的RNA所合成的cDNA，即可测定各组织或细胞衍生的靶序列所产生的特异性mRNA的相对丰度。PCR产物浓度与相对mRNA丰度之间的正比关系只在PCR反应堆线性范围内才如此。
通过测定反应混合物中试剂的利用度(不取决于靶DNA的原初浓度)可测得该曲线平台部分靶DNA的最终浓度。因此，在用RT-PCR测定RNA群体收集物的mRNA种类相对丰度之前必须满足的第一条件是，当PCR反应处在其曲线的线性部分时必须采样测定PCR扩增产物的浓度。
RT-PCR实验能成功测定mRNA种类的相对丰度必须满足的第二条件是，必须将可扩增的cDNA相对浓度归一化至某种独立的标准量。RT-PCR实验的目的是测定样品中相对于所有mRNA种类平均丰度的某特定mRNA种类的丰度。在下述实验中，可采用GHRf1的mRNA作为比较GHRd3 mRNA相对丰度的标准品。
大多数竞争性PCR方案利用差不多与靶序列相同丰度的内部PCR标准物。如果在PCR线性范围时采样品测定扩增产物这些策略是有效的。如果当反应达到平台时产品取样，那么丰度较低的产物会相对高于实际情况。对许多不同RNA产物作相对丰度比较，如当检查RNA样品的不同表达时将会被歪曲，从而产生RNA相对丰度看来不如它们真实数值的差异。如果内部标准物丰度比靶序列高得多这不是严重问题。如果内部标准物比靶序列丰富，可在RNA样品之间进行直接线性比较。
以上讨论从理论上分析了临床材料的RT-PCR试验。临床样品的固有问题是它们在数量上不同(使归一化成问题)和它们在质量上不同(必须同时扩增可靠的内部对照物，或许长度比靶序列更大)。如果进行的RT-PCR是采用内部标准物的相对定量性RT-PCR，而内部标准物是比靶cDNA片断大的可扩增cDNA片断，编码该内部标准物的mRNA丰度比编码靶序列的mRNA丰度高5-100倍，即可克服这二个问题。此试验测定的是各mRNA种类的相对丰度并非绝对丰度。
可采用更方便的相对定量性RT-PCR试验和外部标准方案进行其它研究。这些试验采取扩增曲线线性部分的PCR产物样品。对于每种靶cDNA片断必须凭经验来确定取样的最佳PCR轮次。此外，必须小心地将分离自不同组织样品的每群RNA的逆转录产物归一化到可扩增cDNA的相等浓度。这种考虑非常重要，因为该试验测定的是绝对mRNA丰度。绝对化mRNA丰度只可用作归一化样品中不同基因表达的一种衡量。虽然凭经验确定扩增曲线的线性范围和归一化cDNA制品是费力费时的过程，但RT-PCR试验的结果优于采用内部标准物的相对定量性RT-PCR试验的结果。
这种优点的一个理由是无需内部标准物/竞争物，在扩增曲线的性范围内所有的试剂都可转变成单一的PCR产物，从而提高了该试验的灵敏度。另一理由是，只有一种PCR产物，在电泳凝胶上显示该当产物或其它显示方法就不会复杂，本底低而易于解释。
芯片技术本发明特别考虑以芯片为基础的DNA技术，如Hacia等，(1996，Nature Genetics，14441-447)和Shoemaker等，(1998，Nature Genetics，14450-456)所述。简言之，这些技术涉及快速和精确分析大量基因的定量方法。通过用寡核苷酸标记基因或用固定的探针阵列，可采用芯片技术来分隔靶分子成为高密度阵列和以杂交为基础筛检这些分子。也见Pease等((1994)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA，915022-5026)；Fodor等((1991)Science.251767-773)。
检测GHRd3或GHRf1蛋白的方法可利用抗体通过例如ELISA和免疫印迹技术来特征鉴定健康和患病组织中的GHRd3和/或GHRf1成分。获得GHRd3和GHRf1多肽的方法本文将进一步描述，可用已知方法进行。同样，制备能选择性GHRd3和GHRf1同工型抗体的方法本文将作进一步描述。
一实施例中，考虑不能鉴别GHRd3和GHRf1的GHR抗体，包括GHRd3、GHRf1和GHR抗体可用于ELISA试验中。例如，将抗-GHR抗体固定在所选表面上，宜为对蛋白质有亲和力的表面如聚苯乙烯微滴板的孔。洗去未完全吸附的物质后，需要用已知在抗原性上与测试血清为中性的非特异性蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或奶粉溶液结合或包被试验平板。这得以封闭固定表面上的非特异性吸附位点，从而降低抗原非特异性结合该表面所产生的本底。
抗体结合在孔上后，用非反应性物质包被以减少本底，洗去未结合物质使该固定表面接触待测样品形成免疫复合物(抗原/抗体)。
在测试样品与结合的抗体之间形成特异性免疫复合物后洗涤，使之接触不同于第一抗体的对GHR有特异性的第二抗体，来检测该免疫复合物的形成和量。适合的条件宜包括用稀释液如BSA、牛γ球蛋白(BGG)和磷酸盐(PBS)缓冲液/吐温，稀释样品。这些加入的试剂也有助于降低非特异性本底。然后层叠加入抗血清培育2-4小时，温度宜为约25-27℃。培育后洗涤抗血清接触过的表面以去除非免疫复合性物质。优选的洗涤方法包括用PBS/吐温或碳酸缓冲液溶液洗涤。
为了提供检测工具，第二抗体宜与酶偶联，这样当其与适当的生色物质一起培育时可产生颜色。例如，需要在有利于免疫复合物形成的条件下(如室在含PBS的溶液如PBS/吐温)中培育2小时)使结合第二抗体的表面秘脲酶或过氧化物酶偶联的抗人-IgG接触和培育一段时间。
与酶标第二抗体培育后，再经洗涤去除未结合物质，与生色底物如脲素和溴甲酚紫，或当酶标记物是过氧化物酶时用2’2’-重氮-二(3-乙基-甲苯噻唑啉)-6-硫酸酯(ABTS)和H2O2，培育定量检测标记物的量。通过检测显色程度，如用可见光分光光度计进行定量检测。
可先使样品与测试板结合改变上述试验方式，然后用第一抗体培育测试板，接着用对第一抗体具有特异的标记第二抗体检测结合的第一抗体。
各种其它可用的免疫检测方法的步骤在科学文献中有所描述，如Nakamura等，选自Handbook of Experimental Immunology(第4版)Weir E，，Herzenberg，L.A，Blackwell，C.，Herzenberg L编，第1卷27章，Blackwell Scientific Publ，Oxford，1987纳入本文作参考)。免疫试验就其最简单和直接的含意而言是结合试验。某些优选的免疫试验是各种类型的放射免疫试验(RIA)和免疫珠捕捉试验。采用组织切片的免疫组化检测也特别有用。然而不难懂得，检测不局限于这些技术，免疫印迹、斑点印迹、FACS分析等也可结合用于本发明。
一优选实施例中，可用上述方法以GHRd3特异性抗体检测GHRd3水平。在其它方法中，不区分GHRd3和GHRf1而测定GHR的总量和测定GHRf1的量。不区分的GHR量与GHRf1量的差别表明是GHRd3存在的量。
宜用这些方法检测循环中的GHBP(如GHRd3或GHRf1的胞外部分)。该方法的优选例子可以检测不区分的GHR(如从不区分的GHR总量减GHRd3，与GHRf1相比较)、检测GHRd3和/或检测GHRf1。这类方法包括ELISA试验、配体介导的免疫功能试验(LIFA)的放射免疫试验(RIA)。
检测不区分的(如GHRd3或GHRf1)GHR的LIFA可用Pflaum等，1993，Exp ClinEndocrino1.101(Suppl.1)44和Kratzsch等，2001.Clin Endocrinol.54；61-68所述方法进行。简言之，在一实施例中，用单克隆抗rGHBP抗体包被微滴板来检测不区分的GHR。将血清2清或糖化rGHBP标准品与10ng/孔的hGH一起培育，抗hGH单克隆抗体为生物素化的示踪剂。用铕标记的链霉亲和素系统扩增信号，用荧光计检测。另一实施例中，进行放射性免疫试验来检测不区分的GHBP，如Kratsch等，1995，Eur J Endocrinal.132306-312所述，用抗-rhGHBP抗体、rhGHBP标准品和125I-rhGHBP作标记抗原。
在Kratsch等，2001.Clin Endocrinal.5461-68中所述的另一实施例中，用100微升能在hGH结合位点之外GHBP的溶于50mM磷酸钠缓冲液pH9.6的单克隆抗体10B8(rOWLINSON等，1999)包被微滴板检测不区分的GHBP。洗涤步骤后，加入25微升样品或标准品，溶于75微升试验缓冲液(50mM Tris-(羟甲基)-氨基甲烷、150mMNaCl、0.05％NaN3、0.01％Tween 40、0.5％BSA、0.05％牛γ球蛋白、20μMdiethylenetriaminepenta乙酸盐)中的50纳克生物素标记的抗GHBP mAb 5C6(其能结合hGH结合位点内的GHBP，Rowlinson等，1999)，培养过夜。然后用含外显子3的GHBP f1型特异性抗体检测GHRf1的量。简言之，检测不区分的GHBP时将mAb 10B8固定在微滴板上。洗涤后加入25微升样品或标准品，和75微升Kratzsch等，(2001)所述的兔抗GHRd3多肽多克隆抗体(1∶10000稀释)培育过夜。加入20纳克生物素化鼠抗兔IgG培育2小时然后反复淋洗。用铕标记的链霉亲和素系统扩增信号，用荧光计检测。重组的非糖基化hGHBP以绵羊血清稀释用作标准品。
可用已知方法获得用于本发明的GHRd3特异性抗体。分离的GHRd3蛋白或其一部分或片段可作为免疫原，用标准的多克隆和单克隆抗体制备技术来产生能结合GHRd3的抗体。可用GHRd3蛋白，或者本发明提供的GHRd3抗原性肽片段作为免疫原。
可用已知方法从获自个体的生物样品中纯化制备GHRd3多肽，或更优选重组的多肽。GHRf1的氨基酸序列显示在SEQ ID NOS2和3中，GHRd3与其不同处为缺失了外显子3编码的22个氨基酸。GHRd3抗原肽宜含有SEQ ID NOS2和3所示氨基酸序列的至少8个残基，其中至少一个氨基酸在所述外显子3编码氨基酸残基之外。所述抗原性肽含有GHRd3的一个表位，因而产生的抗该肽抗体可与GHRd3形成特异性免疫复合物。抗体宜选择性或优先与GHRd3结合而基本上不结合GHRf1。该抗原肽宜含至少10个氨基酸残基，优选至少15个氨基破残基，甚至更优选区至少20个氮基酸残基，最优选至少30个氨基酸残基。
该抗原性肽的优选表位是位于该蛋白表面的区域，如亲水性区域。
GHRd3免疫原通常用于免疫适当的动物(如兔、羊、小鼠或其它动物)来制备抗体。合适的免疫原性制品可包括，例如重组表达的GHRd3蛋白或化学合成的GHRd3多肽。该制品也可包括佐剂，如弗氏完全或不完全佐剂，或类似的免疫刺激剂。用免疫原性GHRd3制品免疫合适的动物可诱导多克隆抗-GHRd3抗体应答。
因此，本发明另一方面涉及抗GHRd3抗体。术语“抗体”本文用于指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有能特异性结合抗原如GHRd3，的抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的例子包括F(ab)和F(ab’)片段，可用酶如胃蛋白酶处理该抗体产生。本发明提供GHRd3的多克隆和单克隆抗体。术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”本文用于指只含有能与GHRd3某特定表位起免疫反应的一种抗原结合位点的抗体分子群。一种单克隆抗体组合物因而通常显示对与其起免疫反应的特定GHRd3蛋白的单一亲和力。
本发明涉及的抗体组合物为多克隆或单克隆，能选择性结合含有表位的多肽。该多肽包含SEQ ID NO2和3的连续跨越的至少6个氨基酸，优选至少8-10个氨基酸，更优选至少12、15、20、25、30、40、50或100个氨基酸，所述连续跨越宜包括GHR基因外显子3所编码22个氨基酸以外的至少一个氨基酸。
可如上述用GHRd3免疫原免疫合适的动物制备抗GHRd3多克隆抗体。免疫动物中的抗GHRd3抗体滴度可用标准技术，如酶联免疫吸附试验(ELISA)，采用固定的GHRd3随时监测。如需要，可从哺乳动物(如血液)中分离并用熟知的技术，如蛋白A层析法获得IgG组分进一步纯化得到抗GHRd3抗体分子。在免疫后的适当时间，如当抗-GHRd3抗体滴度最高时，获得动物的抗体产生细胞，用标准方法如最初由Kohler和Milstein(1975)Nature.256495-497所述的杂交瘤技术(也参见Brown等，1981.JImmunol.127539-46；Brown等，1980，J.Biol.Chem.2554980-83；Yeh等，1976.PNAS 762927-31；和Yeh等，1982，Int.J.Cancer.29269-75).最近的人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983.Immunol Today.472)，EBV-杂交瘤技术(Cole等，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R Liss Inc.，pp.77-96)或三杂交瘤技术制备单克隆抗体。产生单克隆抗体杂交瘤的技术是熟知的(风R HKenneth，选自Monoclonal AntibodiesA New Dimension In Biological Analyses，Plenum Publishing Corp.，New York，N.Y.(1980)；E A Lerner.，1981.Yale J BiolMed.，54387-402；M L Gefter等，1977，Somatic Cell Genet.3231-36)。简言之，将不死的细胞系(通常为骨髓瘤)与用上述GHRd3免疫原免疫的哺乳动物的淋巴细胞(通常为脾细胞)融合，对得到的杂交瘤细胞培养上清液进行筛选。鉴定出能产生结合GHRd3单克隆抗体的杂交瘤。
可将用于融合淋巴细胞与不死细胞系的许多熟知方法之一应用于产生抗GHRd3单克隆抗体的目的(见例如G Galfre等，1977.nature.26655052；Gefter等，SomaticCell Genet.，同上；Lerner，Yale J Biol Med，同上；Kenneth，.MonoclonalAntibodies，同上)。然而普通技术人员会懂得这类方法的许多变化也是有用的。通常上述的不死细胞系(如骨髓瘤细胞系)衍生自与淋巴细胞相同种类的哺乳动物。例如，可用本发明的免疫原性制品免疫小鼠的淋巴细胞与不死的小鼠细胞系融合来制备小鼠杂交瘤。优选的不死细胞系是对含有次黄嘌呤、氨基喋啶和胸腺嘧啶的培养液(“HAT”培养液)敏感的小鼠杂交瘤细胞系。可用作标准技术的融合伙伴的许多骨髓瘤细胞系例如有P3-NS1/1-Ag4-1，P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤细胞系。这些骨髓瘤细胞系可从AYCC处得到。通常采用聚乙二醇(“PEG”)将HAT-敏感的小鼠骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞融合，用HAT培养液选择融合所产生的杂交瘤细胞，该培养液能杀伤未融合的和不能产生融合的骨髓瘤细胞(未能融合的脾细胞因未被转化于几天后死亡)。通过例如用标准的ELISA试验，筛选杂交瘤培养上清液中的能GHRd3的抗体，检测能产生本发明单克隆抗体的杂交瘤。
制备单抗分泌性杂交瘤的另一种方法，通过用GHRd3筛检组成型重组免疫球蛋白库(如抗体的噬菌体展示文库)来分离能结合GHRd3的免疫球蛋白文库成员，鉴定抗GHRd3单抗。产生和筛检噬菌体展示文库的试剂盒可从市场上购买到(如PharmaciaRecombinant Phage Antibody System，目录编号27-9400-01；和Stratagene SurfZAP.TM.Phage Display Kit，目录编号240612)。此外，特别适合用于产生和筛检抗体展示文库的方法和试剂可在以下文献中寻找，如Ladner等，美国专利5,223,409；Kang等，国际出版物WO 92/18619；Dower等，国际出版物WO 91/17271；Wintr等，国际出版物WO 92/20791；Markland等，国际出版物WO 92/15679；Breitling等，国际出版物WO 93/01288；McCafferty等，国际出版物WO 92/01047；Garrard等，国际出版物WO 92/09690；Ladner等，国际出版物WO 90/02809；Fucha等，1991.Bio/Technology.91370-1372；Hay等，1992.Hum Antibod Hybridomas.381-85；Husa等，1989.Science.2461275-1281；Griffiths等，1993.ENBO J.12725-734；Hawkins等，1992.JMol Biol.226889-896；Clarkson等，1991.Nature.352624-628；Gram等，1992.Nuc Acid Res.194133-4137；Barbas等，1991.PNAS.887978-7982；和McCafferty等，Nature.1990.348552-554。
可用标准技术如亲和层析或免疫疫沉淀，用抗-GHRd3抗体(如单抗)来分离GHRd3。抗HGRd3抗体可有利于细胞的天然GHRd3和宿主细胞表达重组产生的HGRd3的纯化。而且可用抗GHRd3抗体来检测细胞裂解液可细胞上清液中的GHRd3，以评价GHRd3蛋白表达的丰度和模式。诊断上可利用抗GHRd3抗体来监测组织中的蛋白水平作为临床测试程序的一部分，如测定某给定治疗方案的效果。将该抗体结合(物理性连接)于一可检测标记物有利于此种检测。可检测标记物的例子包括各种酶、互补基团、荧光物质、发光物质、生物发光物质、和放射活性物质。合适的酶例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的互补基团复合物例子包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；适合的荧光物质的例子包括7-羟基香豆素、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子包括鲁米诺；生物发光物质的例子包括荧光素酶、荧光素和水母蛋白；合适的放射活性物质的例子包括125I、131I、35S或3H。
在一优选实施例中，获得基本纯的GHRd3蛋白或多肽。例如在Amicon过滤装置上浓缩来调节最终产品中的蛋白质浓度至每毫升几毫克水平。然后可如下制备抗该蛋白的单克隆或多克隆抗体按照Kohler和Milstein(Nature，256495，1975)的经典方法或从其衍生的方法(见Harlow等Lane，Antibodies A Laboratory Manual，Cold Spring，Harbor Laboratory，pp.53-242，1988)从小鼠杂交瘤制备针对GHRd3可其一部分表位的杂交瘤融合产生的单克隆抗体。
简言之，给小鼠多次接种几毫克的GHRd3或其一部分数周时间。然后处死小鼠分离得到抗体产生细胞。用聚乙二醇融合脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞，在含氨基喋呤的选择性培养基(HAT培养基)中培养该系统破坏过量的未融合细胞。稀释成功融合的细胞并将稀释等份置于微滴板孔中继续培养。采用免疫试验如ELISA(最初由EngvallE，Meth Enzymol。70419(1980)报导)检测各孔上清液中的抗体来鉴定抗体产生克隆。选出阳性克隆扩增，收集它们产生的单克隆抗体应用。单克隆抗体生产的详细程序见Davis L.等，Basic Methods in Molecular Biology Elsevier，New York.第21-2章中所述。
本发明的抗体组合物将在名疫印迹或Western印迹分析中有很大用途。这些抗体可用作鉴定固定于固相支持基质，如硝纤膜或尼龙膜或其组合上蛋白质的高亲和力主要试剂。与免疫沉淀法联用然后作凝胶电泳中，这些抗体可用作第一步的试剂来检测第二试剂针对的抗原，该抗原可能引起不良背景。与Western印迹相结合的免疫检测方法包括然对毒性分子的酶标记、放射标记和荧光标记的第二抗体，在关于这类标记的美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241中描述了其具体的应用，各专利内容纳入本文作参考。当然，如该领域所知，发现通过采用第二结合配体，如第二抗体或生物素/亲和素配体结合对有另外的好处。
GH组合物的给药本发明所用的GH可以是天然序列形式，或天然的、合成的或重组来源的变体形式。例子包括具有人的天然序列的天然或重组的人生长激素(hGH)(GENOTROPINTM、生长激素或促生长激素)，和用重组DNA技术生产的称为GH或GH变体的重组生长激素(rGH)，包括人蛋氨生长素、生长激素和促生长激素。人用时优选其N-末端有或没有甲硫氨酸的重组的天然序列的成熟人GH。最优选重组的人GH多肽GENOTROPINTM(Pharmacia，USA)。也优选如1988年6月5日注册的美国专利4,755,465和Goeddael等，Nature.282544(1979)中所述大肠杆菌生产的甲硫酰化人生长激素(met-hGH)。销售产品PROTROPINTM(Genetech Inc.USA)的met-hGH除了存在一个N-末端甲硫氨酸外，与天然多肽相同。另一例子是销售产品NUTROPINTM(Genetech Inc.USA)的重组hGH。后面的hGH缺乏此甲硫氨酸残基，其氨基酸序列与天然激素相同。见Gray等，Biotechnology.2161(1984)。另一GH例子是具有纯的促生长而非泌乳活性的胎盘型hGH变体，见美国专利4,670,393。也包括GH变体，例如WO 90/04780和WO 92/09690中所述的变体。其它例子包括起GHR拮抗剂作用的GH组合物，如培维索孟(SOMAVERTTM，Pharmacia，USA)，可用于治疗肢端肥大症。
可通过适当技术直接给予受试者GH，包括肠胃道外、鼻内、肺内、口服或透皮吸收。可局部或全身给予。肠胃道外给药的例子包括皮下、肌肉内、静脉内、动脉内和腹膜内给药。优选每日皮下注射给药。
治疗用的GH的配制和剂量以优秀医学实施(GMP)相一致的方式进行，要考虑受试者个体的临床情况(特别是单用GH治疗时的副作用)GH组合物递送的部位、给药的方法、给药的时间表和医师知道的其它因素。用于本目的各组分的“有效量”应由这些考虑所确定，这个量应能提高受试者的生长速度。
对于GH，宜采用约0.2mg/kg/周以上的剂量，更优选约0.25mg/kg/周以上的剂量，甚至更优选约0.3mg/kg/周以上的剂量。在一实施方案中，GH的剂量范围约0.3-1.0mg/kg/，在另一实施方案中为0.35-1.0mg/kg/周。
GH宜每天皮下一次给予。优选方面，GH的剂量范围约0.001-0.2mg/kg/天，更优选GH剂量为0.010-0.10mg/kg/天。
如上所述，预期GHRd3等位基因纯合子或杂合子端正人对GH治疗比GHRf1纯合子受试者有更强的阳性反应。在优选方面，给予GHRf1纯合子受试者的剂量将比给予GHRd3纯合子或杂合子受试者的更高。
GH适合在特定时间(如每天一次)以特定剂量的注射形式连续或不连续给药，注射时GH的血浆浓度升高，然后其血浆浓度下降直到下一次注射。其它不连续给药方法是采用可卖到的PLGA微球和许多植入装置，它们可提供活性成分的不连续释放，例如先是暴发性释放，然后是活性成分的缓慢释放，见美国专利4,767,628。
也可给予GH使其在给药期间在血液中持续存在。最好的办法是通过例如微型泵(如渗透微型泵)连续灌注，或者采用频繁注射GH(每天一次以上，如每天二次或三次)适当地进行。
另一实施方案中，采用长效GH剂型给予GH，该剂型可延缓GH从血中清除或导致GH从注射部位缓慢释放。延长GH血浆清除率的长效剂型可以是GH复合物形式，或将其共价偶联于(通过可逆性或不可逆性结合)大分子，如其一种或多种结合蛋白质(WO 92/08985)或选自PEG和聚乙二醇单聚体和聚氧乙烯聚醇的水溶性聚合物，即可在室温溶于水的聚合物。或者可将GH与能提高其循环半衰期的聚合物复合或结合。可用于此目的的聚乙烯醇和聚氧乙烯醇的例子包括聚氧乙烯甘油、聚乙二醇、聚氧乙烯山梨醇、聚氧乙烯葡萄糖等。聚氧乙烯甘油的甘油骨架与动物和人类中的单、双和三甘油脂骨架相同。不需要特定分子量的该聚合物，但优选分子量在约3500-100000之间，更优选在5000-40000之间。优选PEG单体是不取代的，但也可在一端被烷基取代。优选该烷基是C1-C4烷基，最优选甲基。该聚合物最优选未取代的PEG单体、单甲基取代的PEG单体(mPEG)或分子量约5000-40000的聚氧乙烯甘油(POG)。
通过GH的一个或多个氨基酸残基将GH与该聚合物的末端反应基团共价结合，主要取决于反应条件、聚合物的分子量等。本文设计的带有反应基团的聚合物是为活化的聚合物。该反应基团可选择性地与GH上的氨基或其它反应基反应。然而，将会理解要获得最佳结果，所选反应基团的类型和数量，及所用聚合物的类型将取决于所用的具体GH，以避免该反应基团与GH上过多的具体活性基团反应。因为这不可能完全避免，通常根据蛋白质浓度推荐每分子活化聚合物约0.1-1000，优选2-200个分子的蛋白质。每分子活化聚合物的蛋白质最终量是能维持该蛋白质最佳活性，同时如果可能最佳的循环半衰期平衡的量。
虽然所述残基可以是该蛋白质上的任何反应性氨基酸，如一个或多个半胱氨酸或N-端氨基酸，但优选的反应性氨基酸是可通过其游离的ε氨基连接于活化聚合物反应基团的赖氨酸，或可通过酰胺键连接该聚合物的谷氨酸或天冬氨酸。
可采用常用的能使生物活性物质与椭性聚合物反应的任何适当方法，进行共价修饰，如果GH上的反应基团是赖氨酸，宜在约pH5-9。更宜在pH7-9时进行。通常，该过程包括制备活化的聚合物(含至少一个末端羟基)，制备该聚合物的活性底物，和使GH与该活性底物反应以产生配方所适合的GH。上述修饰反应可用几种方法进行，包括一个或多个步骤。可用于在一步反应中产生活化聚合物的修饰试剂的例子包括氰尿酸氯(2，4，6-三氯-S-三嗪)和氰尿酸氟。
在一实施方案中，该修饰反应分二步进行，其中该聚合物先与酸酐如琥珀酸酐或戊酸酐反应，形成羧酸，然后羧酸与一化合物反应，该化合物能与该羧酸反应形成带活性酯基团能与GH反应的活化聚合物。这类化合物的例子包括N-羟基琥珀酰亚胺或4-羟基-3-硝基苯磺酸等。优选采用N-羟基琥珀酰亚胺或4-羟基-3-硝基苯磺酸。例如，单甲基取代的PEG可在温度升高时反应，优选在约100-110℃与戊酸酐反应4小时。然后在存在碳三亚胺试剂如二环已基或异丙基碳二亚胺时使产生的单甲基PEG戊酸与N-羟基琥珀酰亚胺反应，产生活化的聚合物甲氧基聚乙二醇-N-琥珀酰亚胺戊二酸酯，其然后能与GH反应。此方法在Abuchowski等，Cancer Biochem Biophys.7175-186.1984中有详细说明。另一例子，该单甲基取代的PEG可与戊酸酐反应，存在二环己基碳二亚胺时再与4-羟基-3-硝基苯磺酸(HNSA)反应，产生活化的聚合物。在Bhatnagar等，PeptidesSyethese-Structure-Function，Proccedings of rheSeventh American Peptide Symposium，Rich等编(Pierce Chemical Co.，Rockford，III，1981)，p.97-100和Nitecki等，High-Technology Route to Virus Vaccines(American Society For Microbiology1986)，题为“Novel Agent for CouplingSynthetic Peptides to Carriers and Its Applications”中描述了HNSA。
产生偶联PEG的GH的具体方法包括关于PEG-GH的美国专利4,179,337和美国专利4,93,465中描述的方法，它们说明了PEG能可逆地但共价地连接GH。
GH也适合通过缓释系统给药。本文可用的缓释组合物的例子包括成形物体形式的半透过聚合物基质，如膜或微球。缓释基质包括聚交酯(美国专利3,773,919，欧洲专利58,481)、L-谷氨酸和L-谷氨酸-γ-乙酯的共聚物(Sidnab等，Biopolymers，22547-556，1983)、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)(Langer等，J.Biomed Mater Res，15167-277.1981；Langer，Chem Tech，1298-105，1982)、醋酸乙烯乙酯(Langer等，同上)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP133,988)、或PLGA微球。
缓释GH组合物也包括脂质体包裹的GH。含GH的化质体可用以下文献所述方法制备DE3，218，121；Epstein等，Proc Natl Acad Sci USA.823688-3692，1985；Hwang等，Proc Natl Acad Sci USA.774031-4034，1980；EP52,322；EP36,676；EP88,046；EP142,949；EP142,641；日本专利申请83-118008；专利美国专利4,485,045和4,544,545及EP102,324。通常脂质体是小单室型(约200-800埃)肥质体，其脂质成分大于约30mol百分比的脂固醇，最佳治疗时需调节所选择的比例。此外，可从共价连接于活化多糖的GH加合物制备生物活性缓释制剂，见美国专利4,857,505中所述。另外，美国专利4,837,381描述了一种缓释用的含脂肪或蜡质或它们的混合物与GH的微球组合物。
在另一实施方案中，以上鉴定的受试者也用有效量的IGF-I治疗。作为通用比例，肠胃道外给药的IGF-I总的药学有效量，每日剂量范围是受试者体重约50-240微克/公斤/天，优选100-200微克/公斤/天，虽然如上所述，这个剂量还要考虑许多治疗情况。IGF-I也宜每天给药1或2次，皮下注射。在另一实施方案中，IGF-I和GH可以各自的有效量，或联用时以有效的亚适剂量一起给予受试者。优选约0.001-0.2毫克/公斤/天，或更优选0.01-0.1毫克/公斤/天给予GH。IGF-I和GH二者宜注射给药，采用静脉内或皮下注射。更优选IGF-I和GH二者皮下注射给药，最优选每天注射。
医师在设计IGF-I和GH二者的剂量时应注意考虑已知的这些激素治疗的副作用。对于GH，副作用包括钠滞留和细胞外间隙的膨胀(Ikkos等，ActaEndocrinol.(Copenhagen)，32341-361，1959；Biglieri等，J Clin EndocrinolMetab，21361-370.1961)及高胰岛素血症和高血糖。IGF-I的主要副作用表现为低血糖(Guler等，Proc Natl Acad Sci USA.862868-2872.1989)。事实上，IGF-I和GH联用可导致此二试剂不良副作用(如IGF-I引起的低血糖和GH引起的高胰岛素血症)的减少。
对于肠胃道外给药，在一实施方案中，通常将所需纯度的GH与药学上可接受的载体(即对接受者无毒性、所用剂量和浓度与该制剂的其它成分相容)相混合来制备GH。例如，该制剂不宜包含已知可能损害多肽的氧化剂和其它化合物。通常使GH接触运载的液体或细分的固体载体或二者来制备此制剂。如果需要，可将产品制成所需制剂的形状。载体宜为肠胃道外运载仃，更优选运载液体与接受者血液等到渗。这类载体的例子包括水、盐水、林格氏液和葡聚糖液。非水性载体如固定油和油酸乙酯及脂质体也可用。
该载体宜含有微量添加剂，如能提高渗透性和化学稳定性的物质。这类物质在所用的剂量和浓度时应对接受者无毒性，包括缓冲剂，如磷酸、柠檬酸、琥珀酸、醋酸和其它有机酸或它们的盐；抗氧化剂如抗坏血酸；低分子量(如不到10个残基)多肽如聚精氨酸或三肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖的其它碳水化合物，包括纤维素及其衍生物、葡萄糖、甘露糖和葡聚糖；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；抗衡离子如钠；和/或非离子表面活性剂如聚山梨醇酯、波洛沙姆或PEG。
GH通常单独配制在这类载体中，浓度约0.1-100mg/ml，优选1-10mg/ml，pH约4.5-8。GH的pH宜为7.4-7.8。将会理解，采用上述赋形剂、载体或稳定剂可导致形成GH的盐。
虽然可用任何合适的方法配制GH，但优选的GH制剂如下对于优选的hGH(GENOTROPINTM)，含重组促生长激素0.2mg、0.4mg、0.6mg、0.8mg、1.0mg、1.2mg、1.4mg、1.6mg、1.8mg或2.0mg的单剂量针筒。所述GENOTROPINTM针筒也含有0.21mg甘油、12.5mg甘露醇、0.045mg单三磷酸(monoatriumphosphate)、0.025mg磷酸氢二钠和水加到0.25ml。
对于met-GH(PROTROPINTM)，预先冻干的溶液含2.0mg/ml的GH、18.0mg/ml甘露醇、0.14mg/ml磷酸钠和1.6mg/ml磷酸钠(一价一水合物)，pH7.8。wet-GH的5mg小瓶装有5mg met-GH、40mg甘露醇、和1.7mg总磷酸钠(干重，无水氢二钠)pH7.8。10-mg小瓶装有10mg wet-GH、80mg甘露醇和3.4mg总磷酸钠(干重，无水氢二钠)，pH7.8。
对于metless-GH(NUTROPINTM)，预先冻干的溶液含2.0mg/ml的GH、18.0mg/ml甘露醇、0.68mg/ml甘氨酸、0.45mg/ml磷酸钠和1.3mg/ml的磷酸二氢钠一水，pH7.4。5mg小瓶装有5mg GH、45mg甘露醇、1.7mg/ml甘氨酸和1.7mg总磷酸钠(干重，无水氢二钠)pH7.4。10-mg小瓶装有10mg GH、90mg甘露醇、3.4mg/ml甘氨酸和3.4mg总磷酸钠(干重，无水氢二钠)。
或者，可采用NUTROPINTMhGH的液体制剂，例如5.0±0.5mg/ml rhGH、8.8±0.9mg/ml的氯化钠、2.0±0.2mg/ml的聚山梨醇酯20、2.5±0.3mg/ml的苯酚、2.68±0.3mg/ml的柠檬酸钠二水、和0.17±0.02mg/ml的无水柠檬酸(总的无水柠檬酸钠/柠檬酸是2.5mg/ml或10mM)、pH6.0±0.3。此制剂适合放在10-mg小瓶中，该小瓶在3-cc玻璃瓶中可装2.0ml上述制剂。或者，可将含上述制剂的10-mg(2.0ml)针芯装在注射笔中，给受试者注射液体GH。
用于治疗给药的GH组合物应是除菌的。通过无菌过滤膜(如0.2微米孔膜)过滤不难进行除菌。治疗性GH组合物一般装在具有无菌出入口的容器中，例如静脉输液袋，或具有皮下注射针头瓶塞的小瓶。
GH通常贮存在单剂或多剂容器中，例如密封的安瓿或小瓶中，为水溶液或可重建的冻干制剂。作为冻干制剂的例子，将小瓶装上无菌过滤的GH水溶液(w/v)，然后冻干所产生的混合物。用除菌注射用水重建冻干的GH制成灌注液。
试剂筛选试验携带GHRd3等位基因的个体，现GHRf1等位基因纯合子个体相比，对通过GHR通路起作用的试剂治疗阳性反应强度提高这一发现，提供了可用于评价通过GHR通路起作用的治疗试剂的试验方法。例如，基于GHRd3的筛检试验中，对GHR活性或GHRd3的能力评估，可用于鉴定治疗表达GHRd3等位基因个体最有用的试剂。如以下进一步描述，可测试的试剂包括可用来治疗该病的试剂，如GH组合物，包括生长激素或促生长激素，优选GENOTROPINTM或PROTROPINTM、NUTROPINTM或培维索孟，优选SOMAVERTTM或尚不知可用于治疗该病的试剂。
一方面，本发明提供细胞为基础的试验，在此试验中，使GHRd3蛋白或其生物活性部分与测试化合物接触，测定该测试化合物调节GHR活性的能力。可通过监测GHR多肽的活性进行测试化合物调节(刺激或抑制)GHR活性的测定。检测GHR的活性包括评估适当的可检测活性，包括例如测试化合物所诱导的细胞增殖、GHR的内化和/或信号转导，见以下所述。
在优选实施方案中，本发明提供鉴定候选GH调节剂(激动剂或拮抗剂)的方法，所述方法包括a)提供含有GHRd3多肽的细胞；b)使所述细胞与测试化合物接触；和c)测定所述化合物是否选择性激活或抑制了GHR的活性。在一实施方案中，该方法包括a)提供一种人细胞(优选293细胞)；b)在所述细胞中导入含GHRd3多肽编码核酸序列的载体；和c)使所述细胞与测试化合物接触；和d)检测GHR活性。检测到所述化合物能抑制GHR活性，表明所述化合物是候选的GHRd3抑制剂。检测到所述化合物能激发GHR活性，表明所述化合物是候选的GHRd3激动剂。在另一实施例中，该方法包括a)提供非洲爪蟾卵母细胞；b)在所述卵母细胞中导入GHRd3cRNA；c)使所述卵母细胞接触某测试化合物；和d)检测所述卵细胞中的GHR活性。检测到所述化合物能激发GHR活性，表明所述化合物是候选的GHRd3激动剂。检测到所述化合物能抑制GHR活性，表明所述化合物是候选的GHRd3拮抗剂。在本文GHRd3/f1异二聚体有关内容中还详细说明了筛选试验。
GHRd3/GHRf1异二聚体评估GHRd3/f1异二聚体活性的方法如上所述，本发明提供的GHRd3多肽可以是天然存在的与GHRf1多肽形成的异二聚体。因此本发明提供评估GHRd3多肽活性的方法。在优选方面，本发明包括检测含有GHRd3多肽和GHRf1多肽的多肽复合物的活性。本发明为此提供评估含有GHRd3多肽和GHRf1多肽的多肽复合物活性的方法。优选该复合物是含有GHRd3多肽、GHRf1多肽和GH多肽的复合物。
本发明还提供检测GHRd3核苷酸序列功能性变体活性或获得它们的方法，包括提供GHRd3核酸变体或修饰物，及评估它们所编码的多肽是否显示了GHR活性的方法。评估GHRd3多肽功能的这类方法包括a)提供GHRd3多肽和GHRf1多肽；和b)评估GHR活性。可采用任何合适的形式，包括无细胞(如以膜为基础)、基于细胞和体内试验形式。例如所述试验可包括在某宿主细胞中表达GHRd3和GHRf1核酸，和观察所述细胞中的GHR活性。在另一实施例中，将GHRd3和GHRF1多肽导入某细胞中并观察GHR活性。在另一实施例中，将GHRd3多肽导入表达GHRF1多肽的某细胞中并观察GHR活性。
在优选实施方案中，检测GHR活性可包括检测GHR蛋白进而调节某下游因子(如GHR-介导信号转导通路组分)活性的能力。例如可测定该效应分子对适当靶物质的活性，或如上所述可测定该效应分子与某适当靶物质的结合。优选评估jak-2/Stat-5信号传递。在其它优选实施方案中，检测GHR活性还可包括评估任何适当的可检测活性，包括GHR配体诱导的细胞增殖、GHR与GHR配体的结合、GHR和/或配体的内化。最优选所述GHR配体是GH多肽。这些方法可测定由GHRd3和GHRf1多肽所组成的GHR异质双体的活性。
评估GHRd3活性的方法可用于特征鉴定修饰的GHRd3多肽。例如，可特征鉴定在必须或非必须氨基酸残基上含突变的GHRd3多肽。可在GHRd3的序列中制造导致“非必须氨基酸残基”中氨基酸取代的核苷酸取代。“非必须”氨基酸残基是野生型GHRd3多肽序列中发生改变但不改变其生物活性的残基。而“必须”氨基酸残基是生物活性所需要的残基。例如本发明GHRd3蛋白中保守的氨基酸残基预计不能忍受这种改变。此外，其它保守性残基可以是本发明GHRd3蛋白中保守的氨基酸。其它实施例中，人群中可能存在GHRd3序列的天然等位基因变体，可在GHRd3核酸的核苷酸序列中导入突变引起变化。从而导致编码的GHRd3蛋白质氨基酸序列的变化，而不改变GHRd3蛋白的功能活性。
药物筛选试验本发明提供鉴定和/或评估GHR激动剂和拮抗剂，即能通过GHR通路起作用的候选药物或测试化合物或药物(如优选多肽，但也可以是肽、拟肽、小分子功其它药物)的方法。GHR激动剂和拮抗剂宜为能结合GHRd3和GHRf1蛋白的化合物，从而可形成含有GHRd3多肽、GHRf1多肽和所述化合物的复合物。试验可以是细胞或非细胞试验。优选的非细胞试验是膜试验。这些试验本文中也指“筛选试验”。筛选试验可以是结合试验，或基于已知的合适的GHR活性试验的其它功能性试验。
一方面，在细胞试验中，使表达GHRd3蛋白和GHRf1蛋白，或它们的生物活性部分的细胞接触测试化合物，测定该测试化合物调节GHR活性的能力。可通过监测GHR多肽(如含有GHRd3和GHRf1蛋白的GHR多肽复合物)的活性，来测定测试化合物调节(如激活或抑制)GHR活性的能力。检测GHR活性可包括评估任何可适当检测的活性，如包括测试化合物诱导的细胞增殖、GHR的内化和/或信号转导。
在优选实施方案中，本发明提供鉴定GHR候选调节剂(如激动剂或拮抗剂)的方法，所述方法包括a)提供含有GHRd3和GHRf1多肽的细胞；b)使所述细胞与测试化合物接触；和c)测定所述化合物是否选择性激活或抑制了GHR的活性。在一实施方案中，该方法包括a)提供一种人细胞(优选293细胞)；b)在所述细胞中导入含GHRd3多肽编码核酸序列的载体，并任选导入含编码GHRf1多肽核酸序列的载体；和c)使所述细胞与测试化合物接触；和d)检测GHR活性。检测到所述化合物能抑制GHR活性，表明所述化合物是候选的GHRd3/GHRf1异质双体抑制剂。检测到所述化合物能激发GHR活性，表明所述化合物是候选的GHRd3/GHRf1异质双体激动剂。在另一实施例中，该方法包括a)提供非洲爪蟾卵母细胞；b)在所述卵母细胞中导入GHRd3cRNA和任选的GHRf1 cRNA；c)使所述卵母细胞接触某测试化合物；和d)检测所述卵母细胞中的GHR活性。检测到所述化合物能激发GHR活性，表明所述化合物是候选的GHRd3/GHRf1异质双体激动剂。检测到所述化合物能抑制GHR活性，表明所述化合物是候选的GHRd3/GHRf1异质双体拮抗剂。
检测GHR活性可包括评估任何合适的可检测活性，包括细胞增殖、GHR与GHR配体(如GH多肽)的结合、GHR和/或GHR配体的内化、和/或GHR介导的信号转导。
在293细胞内GHR介导的jak2-Stat5信号转导的GHR功能试验例子见Maarnra等，1999.J.Biol.Chem.27414791-14798，中所述，其内容纳入本文作参考。在非洲爪蟾卵母细胞中的GHR功能试验例子见Urbanek等，1993，J.Biol.Chem.268(25)19025-19032中所述，其内容纳入本文作参考。产生cDNA模板、体外转录和翻译、卵母细胞注射、注射的mRNA稳定性的分析、测定GH与GHR的结合和受体内化分析的方法，基本上可按Urbanek等(1993)中所述进行。
在另一优选方面，一种试验是细胞结合试验，其中，使表达GHRd3蛋白和GHRf1蛋白或它们生物活性部分的细胞与测试化合物接触，检测该测试化合物结合GHR多肽的能力。另一方面，一种试验是非细胞结合试验，其中，使含有GHRd3蛋白和GHRf1蛋白或它们生物活性部分的膜与测试化合物接触，检测该测试化合物结合GHR多肽的能力。可用已知方法测定测试化合物结合GHR(如GHRd3或GHRf1)多肽的能力。
结合试验例如，可包括a)提供含有GHRd3和GHRf1多肽的细胞；b)使所述细胞与测试化合物接触；和c)测定所述化合物是否选择性结合了GHR多肽。在一实施方案中，该方法包括a)提供一种人细胞(优选293细胞)；b)在所述细胞中导入含GHRd3多肽编码核酸序列的载体，并任选导入含编码GHRf1多肽核酸序列的载体；和c)使所述细胞与测试化合物接触；和d)检测所述化合物是否选择性结合了GHR多肽。检测到所述化合物结合了GHR多肽，表明所述化合物是候选的GHRd3/GHRf1异质双体调节剂。在另一实施例中，该方法包括a)提供非洲爪蟾卵母细胞；b)在所述卵母细胞中导入GHRd3cRNA和任选的GHRf1 cRNA；c)使所述卵母细胞接触某测试化合物；和d)检测所述所述化合物是否选择性结合了GHR多肽。检测到所述化合物能结合GHR多肽，表明所述化合物是候选的GHRd3/GHRf1异质双体激动剂。
基于293细胞的GHR结合试验的例子见Ross等，2001.J Clin Endocrinol Metabol.86(4)1716-1723中所述，其内容纳入本文作参考。
用于上述试验的细胞优选能表达GHRf1多肽的293细胞。表达GHR的293细胞见Maarnra等，1999，J.Biol.Chem.27414791-14798，中所述，其内容纳入本文作参考。
这些试验对测定GH多肽或其片段或变体特别有用。特别优选的是经修饰，例如通过连接聚乙二醇分子而具有较长血循环时间的GH多肽。其它实施方案中，GH多肽可以是GHR拮抗剂，如能结合GHR蛋白(如优选能形成含GHRd3和GHRf1蛋白的复合物)但不激发GHR活性的GH多肽。
在其它实施方案中，该试验包括使表达GHRd3蛋白和GHRf1蛋白或它们生物活性部分的细胞与GHR配体接触形成试验混合物，使该试验混合物与测试化合物接触，检测GHR活性。该方法宜包括测试化合物激发或抑制GHR蛋白(如含GHRd3和GHRf1蛋白或它们生物活性部分的的GHR双体)活性的能力，其中测定测试化合物抑制GHR蛋白活性的能力，包括测定该测试化合物抑制GHRd3和GHRF1表达细胞生物活性的能力(如测定测试化合物抑制信号转导或蛋白质蛋白质相互反应的能力)。
测定GHR蛋白结合或与GHR配体相互反应的能力，或上述测定直接结合的方法之一进行。其它实施方案中，测定GHRd3蛋白或含GHRd3蛋白的复合物结合或与GHR配体分子相互反应的能力，可通过检测其诱导的靶细胞第二信使(即胞内Ca2+、二酰甘油、IP3等)、检测对相应底物的催化/酶促活性、检测诱导的报告基因(包括操作性连接编码某可检测标记如荧光素酶的反应性调节元件)、或检测GHR调节的细胞应答，如信号转导或蛋白质蛋白质相互反应。
另一实施方案中，本发明的试验是无细胞试验，其中GHRd3蛋和GHRf1蛋白或它们的生物活性部分提供在一种膜上，使GHR蛋白或该膜接触测试化合物，测定测试化合物结合GHR蛋白(如GHRd3和/或GHRf1蛋白)或它们生物活性部分的能力。可如上所述直接或间接测定测试化合物与GHRd3蛋白的结合。在优选实施方案中，该试验包括使GHR蛋白(如GHR异质双体)或其生物活性部分与某已知化合物，如能结合GHR的GH多肽接触，形成试验混合物，使该试验混合物与某测试化合物接触，测定该测试化合物GHR蛋白相互反应的能力，其中，测定该测试化合物与GHR异质双体相互反应的能力，包括测定该测试化合物与该已知化合物相比，优先结合GHR蛋白或其生物活性部分的能力。
在另一实施方案中，所述试验无细胞试验，其中GHRd3蛋和GHRf1蛋白或它们的生物活性部分提供在一种膜上，使GHR多肽或该膜接触测试化合物，测定测试化合物调节(如激发或抑制)GHR蛋白或它们生物活性部分活性的能力。测定该测试化合物调节GHR活性的能力，可例如通过评估任何合适的可检测活性，包括细胞增殖、GHR与GHR配体(如GH多肽)的结合、GHR和/或GHR配体的内化、和/或GHR介导的信号转导来检测。
也可通过例如将某测试化合物，如GH蛋白分子或其一部分或衍生物与放射性同位素或酶标记物偶联，不检测测试化合物抑制GHR活性的能力，这样GH分子结合GHR异质双体可通过检测复合物中标记的GH蛋白或其生物活生部分来测定。例如可用125I、35S、14C或3H直接或间接标记化合物(如GH蛋白或其生物活性部分)，通过直接计数放射发散光或液闪计数检测放射性同位。或者，可用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶标记化合物，通过检测相应底物转变为产物来测定酶标记。
本发明的范围还包括测定化合物(如GH蛋白或其一部分或片段)与GHR多肽(如GHRd3/GHRf1异质双体)的相互反应而不标记任何中间产物(interactant)。例如，可利用微观物理学计量仪(microphysiometer)来检测某化合物与其本着靶分子的相互反应而无须标记该化合物或该受体(McConnll，H.M.等，1992，Science.2571906-1912)。微观物理学计量仪如细胞传感器是一种采用光可寻址电位传感器(LAPS)的分析仪器，能测量细胞酸化其周围环境的速率。这种酸化速率的变化可作为化合物和受体之间相互反应的指标。
测定GHR蛋白结合GHR配体或测试化合物的能力，也可用实时生物分子相互反应分析(BIA)技术来测定(Sjolander，S.等，Uebaniczky C.，1991.Anal Chem.632338-2345和Szabo等，1995.Curr Opin Struct Biol.5699-705)。如本文所用“BIA”是实时研究生物特异性相互反应的一种技术，无须标记任何反应中间物(如BIAcore)。可利用表面质子共振(SPR)光学现象的变化作为生物分子之间实时反应的指标。
测试化合物‘候选的’或“测试的”化合物或“试剂”(如测试的GHR激动剂和拮抗剂)可以是任何适当形式，包括多肽、肽、拟肽、小分子和其它试剂。所述化合物功试剂包括那些已知可用于治疗疾病的试剂，或尚不知可用于治疗疾病的试剂。
在一优选实施方案中，测试化合物是GH多肽。优选的GH可以是天然序列或变体形式，可得自任何来源天然的、合成的或重组的。例子包括含人天然序列的天然或重组的人生长激素(hGH)和用重组DNA技术产生的任何GH或GH变体的重组生长激素(rGH)。一方面，该GH应能激活GHR受体，例子包括生长激素或促生长激素，优选GENOTROPINTM或PROTROPINTM、NUTROPINTM。
另一方面，GH多肽是能起GHR拮抗剂作用的GH变体。GHR拮抗剂是一类能结合GHR多肽而阻抑GHR功能的试剂。GHR拮抗剂的一个例子见Ross等，2001.J ClinEndocrinol Metabol.86(4)1716-1723中所述。Ross等公开的此种GHR拮抗剂称为B2036-PEG，是一种PEG化的GH变体，含有的1位突变提高了GHR结合能力，而2位突变阻断了GHRd3/GHRf1异质双体受体的二聚化。优选的GHR拮抗剂或抑制剂是PEG化生长激素(培维索孟)，优选SOMAVERTTM。GHR拮抗剂可用于治疗肢端肥大症，一种常因脑垂体腺瘤过量分泌GH所致的疾病。
本发明的测试化合物可用本领域已知的组合文库方法中的许多办法之一获得，包括生物文库、分选可寻址平行固相或液相文库、需要去卷积的合成文库方法、一珠一化合物文库方法、和采用亲和层析选择的合成文库方法。采用肽文库的生物文库方法，虽然其它4种方法也可应用于肽、非肽寡聚物可小分子化合物文库(Lam KS.1997.Anticancer Drug Des，12145)。
合成分子文库方法的例子可在以下文献中找到例如DeWitt等，.1993.Proc NatlAcad Sci USA.906909；Erb等，1994.Proc Natl Acad Sci USA.9111422；Zuckermann等，1994.J Med Chem.372678；Cho等，1993.Science.2611303；Carrell等，1994.Angew Chem Int Ed Engl.332059；Carell等，1994.Angew Chem Int Ed Engl.332061；和Gallop等，1994.J Med Chem.371233。
化合物文库可提供在液体中(如Houghten，1992.Biotechniques.13412-421)，或小珠上(Lam.1991.Nature.35482-84)，芯片上(Fodor.1993.Nature.364555-556)，细菌上(ladner 5,223,409)，芽孢上(Ladner 5,223,409)，质粒上(Cull等，1992.Pro Natl Acad Sci USA.891865-1869)或噬菌体上(Scott和Smith.1990.Science.249386-290)；(Devin.1990.Science.249404-406)；(Cwirla等，1990.Proc Natl Acad Sci.876378-6382)；(Felici.1990.J Med Biol.222301-310)；(Ladner，同上)。
本发明也涉及用上述筛选试验鉴定的新试剂和用这些试验产生这类试剂的方法。因此在一实施方案中，本发明包括用含有上述筛选试验之一(如细胞试验或无试验)的步骤获得的化合物或试剂。所述化合物或试剂宜含有GH多肽或其一部分或变体。
因此，在本发明范围内还包括在适当的动物模型中使用上述鉴定的试剂。例如，可在动物模型中采用本文所述的试剂(如GHR调节剂，如GH多肽或其一部分或变体，反义GHRd3核酸分子，GHRd3特异性抗体或GHRd3结合伴侣)，以测定用这种试剂治疗的效果、毒性或副作用。或者，可在动物模型中采用本文所述鉴定的试剂来测定这种试剂的作用机制。另外，本发明涉及上述筛选试验鉴定的新的试剂来进行所述的治疗。
本发明也涉及上述筛选试验鉴定的新的试剂用于诊断、预后主如上所述的治疗。因此，属于本发明范围的还有在设计、配制、合成、制造和/或生产用于诊断、预后或上述治疗中使用的试剂。例如，在一实施方案中，本发明包括参照上述筛选试验之一获得的化合物结构和/或性能，合成或产生试剂或试剂组合物的方法。例如可根据在表达GHRd3和GHRf1多肽的细胞与测试化合物接触，并测定测试化合物结合或调节GHR多肽(优选含GHRd3和GHRF1多肽的复合物)的能力的方法中获得的化合物的结构和/或性能，合成试剂或试剂组合物。在另一示范性实施方案中，本发明包括根据在GHRd3蛋白或其生物活性部分与测试化合物接触，并测定该测试化合物与GHR蛋白，优选含GHRD3和GHRF1蛋白的GHR双体或其生物活性部分相结合，或调节(如激活或抑制)其活性的方法中获得的化合物的结构和/或性能，合成或产生试剂或试剂组合物的方法。
GHRd3核酸和蛋白质如本文所述，本发明涉及GHRd3核酸和多肽的用途在优选实施方案中，GHRd3蛋白含苞欲放毗连跨越的至少6个氨基酸，优选至少8-10个氨基酸，更优选至少12、15、20、25、30、40、50、100、200、300、400、500、或600个氨基酸。在其它优选实施方案中，该毗连氨基酸的长度中含突变的或功能性突变的位点，包括GHRd3蛋白序列中氨基酸的缺失、添加、替换或截短。于本发明也可利用的是GHRd3蛋白的生物活性部分，此肽部分含有的氨基酸序列与GHRd3蛋白的氨基酸序列足够同源或从其衍生，包括的氨基酸序列长度不到GHRd3的全长，显示了GHR蛋白的至少一种活性。在其它实施方案中，GHRd3蛋白基本上与天然GHRd3序列同源并保留了天然GHRd3蛋白的功能活性，但由于天然的等位基因差异或诱变在氨基酸序列上有所不同。因此在加一实施方案中，GHRd3蛋白质是所含有氨基酸序列至少与(Urbanek等，1992)中所述的氨基酸序列有约60％同源性，并保留了GHRd3蛋白的各种功能活性。该蛋白优选与Urbanek等(1992)的有至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或99.8％的同源性。
为了确定二条氨基酸或二条核酸序列的同源性性百分比，可将二序列排列对比作最佳比较(如在第一条氨基酸或核酸序列中导入空格，与第二条氨基酸或核酸序列作最佳排列对比，或比较时可不顾非同源性序列)。在一优选实施方案中，作排列比较的参比序列的至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，还要优选至少70％、80％、90％或95％的长度作比较(如当排列对比第二条序列与GHRd3的氨基酸序列时，至少对比100个，优选至少200个氨基酸残基)。然后比较相应氨基酸位点或核酸位点的氨基酸或核苷酸。当第一条序列的某位点占据的是与第二条序列相应位点相同的氨基酸残基或核苷酸时，那么二分子在该位点同源(即如本文所用，氨基酸或核酸的“相同性”等同于氨基酸或核酸的“同源性”)。二序列之间的同源性百分比是相同之处位点数除以序列长度的函数(即％同源性＝相同位点数/位点总数×100)。
可采用数学算法进行二序列之间的序列比较和同源性百分比测定。一个用于序列比较的优选的非限制性数学算法的例子是Karlin和Altschul.1993.Proc Natl AcadSci USA.872264-68的算法，Kalin和Altschul.1993.Proc natl Acad SciUSA.905873-77作了修改。将这一算法加入到Altschul等，1990.J Mol Biol.215403-10的NBLAST T XBLAST程序中(第二版)。可用NBLAST程序进行BLAST核苷酸检索，评分＝100，字度＝12可获得本发明GHRd3核酸分子的核苷酸序列同源性。可用XBLAST程序进行BLAST蛋白质检索，评分＝50，字长＝3可获得本发明GHRd3蛋白分子的氨基酸序列同源性。可采用Altschul等，1997.nucleic Acids Research.25(17)3389-3402所述的空格BLAST。当采用BLAST和空格BLAST程序时，可采用各程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数。见http//www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列比较落后的另一优选非限制性数学算法的例子是Myers和Miller，CABIOS(1989)的算法。将此算法加入GCG序列对比软件包一部分的ALIGN程序(第二版)中。当利用该ALIGN程序比较氨基酸序列时，可采用PAM120权重残基表，空格长度罚分12和空格罚分4。
重组表达载体和宿主细胞可用任何适当的方法制备含GHRd3蛋白编码核酸的载体，优选表达载体，同样，在优选方面，也可制备含GHRF1蛋白(或其一部分)编码核酸的表达载体。任选地表达载体含有编码GHRd3蛋白的核酸及编码GHRf1蛋白的核酸。如本文所用，术语“载体”指能转运与其相连的另一核酸的核酸分子。一种种类型的载体是“质粒”，是一种可连接其它DNA区段的双链环状DNA。另一类载体是病毒载体，此载体中其它的DNA区段连接于病毒基因组中。某些载体能在其导入的宿主细胞中自身复制(如具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)其它在导入宿主细胞时整合入宿主细胞基因组中的载体(如非游离型哺乳动物载体)能与宿主基因组一起复制。然而，某些载体能指导与它们操作性相连的基因表达。这种载体本文称作“表达载体”。一般用于DNA重组技术中的载体常为质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用形式的载体。然而本发明还包括功能相当的其它形式的表达载体，如病毒载体(如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
本发明的重组表达载体包含适合在宿主细胞中表达的核酸形式的GHRd3和GHRf1核酸，意味着该重组表达载体包含根据宿主细胞选择的用于表达的一个或多个调节序列，它们操作性连接于待表达的核酸序列。在重组表达载体中，“操作性连接”指感兴趣核苷酸序列以能使该核苷酸序列表达的方式，连接于该调节序列(如当该载体导入宿主细胞时处在体外转录/翻译系统中或宿主细胞内)。术语“调节序列”指启动子、增强子和其它表达调控元件(如聚腺苷酸化信号)这些调控序列可见例如GoeddelGene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，AcademicPress，San Diego，Calf.1990所述。调控序列包括能指导核苷酸序列在许多类型宿主细胞中表达的序列，和能指导该核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的序列(如组织特异性调控序列)。本领域技术人员知道可根据一些因素，如所选的待转化细胞，所需的蛋白质表达水平等来设计表达载体。可将该表达载体导入宿主细胞中来产生蛋白质或肽。
可设计能在原核或真核细胞中表达GHRd3蛋白的本发明重组表达载体。例如，可在细菌，如大肠杆菌、昆虫细胞(利用杆状病毒载体)、酵母菌细胞或哺乳动物细胞中表达GHRd3蛋白。适合的宿主细胞见GoeddelGene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calf.1990所述。或者，可用T7启动子调控序列的T7聚合酶体外转录和翻译该重组表达载体。
最常用含有能指导融合或非融合蛋白表达的组成型或可诱导型启动子的载体，在原核细胞中进行蛋白质的表达。融合载体常在重组蛋白的氨基末端将氨基酸逐个加入到编码蛋白中。这类融合载体目的有三1)提高重组蛋白的表达；2)提高重组蛋白的可溶性；3)通过与配体的作用在亲和纯化中邦助重组蛋白的纯化。常在融合表达载体中融合部分与重组蛋白连接处，导入一蛋白水解切割位点，使得能够分离重组蛋白与融合部分，然后纯化该融合蛋白。这类酶和它们相应的识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEXT(Pharmacia Biotech Inc.；Smith D B和Johnson K S，1988，Gene，6731-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，Mass)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，N.J.)，它们可将谷胱苷肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、或蛋白分别融合于靶重组蛋白。
适合的可诱导型非融合大肠杆菌表达载体的例子，包括pTrc(Amann等，1988，Gene，69301-315)和pET 11d(Studier等，Gene Expression TechnologyMethodsin Enzymology 185，Academic Pree，San Diego，Calf.1990.60-89)。pTrc载体的靶基因表达依赖于宿主RNA聚合酶对杂交性trp-lac融合启动子的转录。pET 11d载体的靶基因表达，依赖于共表达的病毒RNA聚合酶(T7 gn 1)介导的对T7 gn10-lac融合启动子的转录。此病毒聚合酶由寄居在宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)的含有T7 gn 1基因的原噬菌体在lacUV5启动子转录控制下提供。
在大肠杆菌中最大程度表达重组蛋白的一种策略，是在蛋白水解切割重且蛋白能力减弱的宿主细菌中表达该蛋白(Gottesman S.，Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Pree，San Diego，Calf.1990.119-128)。另一策略是改变被插入表达载体中核酸的核酸序列，使每个氨基酸的个别密码子为大肠杆菌所偏爱的(Wada等，1992.Nucleic Acid Res.20 2111-2118)。可用标准DNA合成技术进行本发明核酸序列的这种改变。
另一实施方案中，GHRd3表达载体是酵母菌表达载体。酿酒酵母表达载体的例子包括pYepSec 1(Baldari等，1987.Embo J.6229-234)，pMFa(Kurjan和Herskowitz，1982.Cell.30933-943)，pJRY88(Schultz等，1987.Gene.54113-123)，pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，Calf.)pieZ(Invitrogen Corp，San Diego，Calf.)或者，GHRd3蛋白可用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达。可得到能在培养的昆虫细胞(如Sf9细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体，包括pAc系列(Smith等，1983.Mol Cell Biol.32156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers.1989.Virology.17031-39)。在特别优选的实施方案中，按Kaeniki等，Am J Physiol.1998.275F79-87所述表达GHRd3蛋白。
另一实施方案中，利用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达本发明的核酸。哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8(Seed B.，1987.Nature.329840)和pMT2PC(Kaufman等，1987.EMBO J.6187-195)。当用于哺乳动物细胞时，该表达载体的调控功能常由病毒调节元件所提供。例如，常用多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和仙台病毒40衍生的启动子。原核和真核细胞的其它合适表达系统见SambrookJ.，Fritsh E F和Maniatis T.，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratoryu，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor.N.Y.，1989中的16和17章。
本发明其它方面涉及在其中导入了本发明重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应理解此术语不仅指特定的主体细胞，也指此细胞的子代或潜在的子代。因为某些修饰由于突变或环境影响可能发生在后代中，其子代事实上不可能与亲代细胞相同，这也包括在本文所用此术语的范围内。
可通过常规的转化或转染技术将载体DNA导入原核或真核细胞中。如本文所用，“转化”和“转染”意指本领域熟知的将外源核酸(如DNA)导入宿主细胞中的技术，包括磷酸钙和氯化钙共沉淀、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质转染或电穿孔。转化或转染宿主细胞的合适方法可在Sambrook等，(Molecular CloningA LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratoryu，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)和其它实验室手册中找到。
对于哺乳细胞的稳定转染，已知取决于所用的表达载体和转染技术，只有少数的细胞可整合外源DNA到其基因组中。为了鉴定和选择这些整合的细胞，通常可将编码一种可选择标记(如抗菌素抗性)的基因与感兴趣基因一起导入宿主细胞中。优选的可选择标记包括能赋予对试剂，如G418、潮霉素和氨甲喋呤抗性的标记。编码可选择性标记的核酸可在与编码GHRd3蛋白的同一载体中的导入宿主细胞，或在不同的载体中导入。稳定转染了导入核酸的细胞可通过试剂选择鉴定(如掺入了可选择性标记基因的细胞能存活，而其它细胞死亡)。
可利用培养的本发明宿主细胞，如原核或真核宿主细胞来生产(即表达)GHRd3蛋白。因此，本发明还提供用本发明宿主细胞生产GHRd3蛋白的方法。一实施方案中，该方法包括；在适合的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中导入了编码GHRD3蛋白的重组表达载体)来生产GHRd3蛋白。
也可利用本发明的宿主细胞来产生非人转基因动物GHRd3等位基因的纯合子和杂合子。例如，一实施方案中，本发明的宿主细胞是其中已导入了GHRd3编码序列的受精卵母细胞或胚胎干细胞。楞利用这种细胞来产生其基因组中已导入了外源性GHRd3序列的非人转基因动物，或其内源性GHRf1序列已改变的同源重组动物。这种动物可用来研究GHRd3的功能和/或活性，和鉴定和/或评价GHRd3活性调节剂。如本文所用“转基因动物”是一种非人动物，优选哺乳动物，更优选啮齿类如大鼠或小鼠。此种动物的一个或多个细胞中含有转基因。转基因动物的其它例子包括非人灵长动物、绵羊、狗、母牛、山羊、鸡、两栖动物等。转基因是外源性DNA，其整合入细胞的基因组中，从该细胞可产生转基因动物，而转基因仍留在成熟动物的基因组中，因而能指导其编码的基因产物在该转基因动物的一种或多种类型细胞或组织中表达。如本文所用“同源性重组动物”是非人动物，优选哺乳动物，更优选小鼠，该动物中的内源性GHR基因(如GHRf1等位基因)已被内源基因与导入该动物细胞(如该动物的胚胎细胞)中的外源DNA分子之间的同源重组所改变，然后产生了该动物。
可通过显微注射、逆转录病毒感染将GHRd3编码核酸导入受精卵母细胞的母体前核中，或让该卵母细胞在假孕代孕母动物子宫中发育，产生本发明的转基因动物。GHRd3 DNA序列可作为转基因导入非人动物的基因组中。也可在该转基因中包含内含子序列和聚腺苷酸信号来提高该转基因的表达效率。可将组织特异性调控序列操作性连接于GHRd3转基因以指导GHRd3蛋白在特定细胞中的表达。通过胚胎操作和显微注射产生转基因动物，具体动物如小鼠的方法在该领域已成常规，其描述见例如Leder等的美国专利4,736,866和4,870,009；Wagner等，的美国专利4,873,191和Hogan B.，Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。可用类似方法来产生其它转基因动物。可根据动物基因组中存在的GHRd3转基因和/或其组织或细胞表达的GHRd3 mRNA，鉴定转基因奠基者动物。然后可利用该转基因奠基者动物来繁殖其它携带该转基因的动物。而且。，可进一步使携带编码GHRd3蛋白转基因的转基因动物与携带其它转基因的其它转基因动物交配。
为了产生同源重组动物，需制备含GHRd3核酸至少一部分的载体从而改变内源性GHR(GHRf1)基因。GHRd3基因可以是人基因，或人GHR基因的非人同源基因(如通过与衍生自SEQ ID NO1，4和6的核酸序列严谨性杂交分离得到的cDNA)。优选通过修饰非人GHR序列而缺失外显子3核酸产生该非人同源基因。由于小鼠中没有发现GHRD3等位基因，可用已知方法制备小鼠GHRd3核酸。因此在某些方面，可可适当的同源重组载体中合成的小鼠GHRd3基因来改变小鼠基因组中的内源性GHR基因。在一优选实施方案中，根据同源重组设计的该载体中，内源GHR基因被GHRd3基因取代，而所述GHRd3基因编码功能性GHRd3蛋白(如可改变其上游调控区从而改变内源GHRd3蛋白的表达)。在该同源重组载体中，GHRd3基因的5’和3’端侧接有GHR基因的其它核酸序列，使得能在胚胎干细胞中该载体携带的外源GHRd3基因与内源GHR基因之间发生同源重组。其它侧接的GHR核酸序列应足够长才能与内源基因成功同源重组。通常载体中包含的侧接DNA长几千个碱基(5’和3’二端)(见例如Thomas KR和Capecchi M R.，1987.Cell.51503，描述了同源重组载体)。将该载体导入胚胎干细胞系(如通过电穿孔)，选择导入的GHRd3基因与内源GHR基因同源重组的细胞(见例如Li E等，1992.Cell.69915)。将选出的细胞注射到动物(如小鼠)的胚泡中形成侵入性嵌合体(见例如Bradley A.，Teratocarcinomas and EmbryonicStem Cells.A Practical Approach，E J Robertson编，(IRL，Oxford，1987)113-152页)。然后将嵌合性胚胎植入合适的假孕代孕母动物子宫中，使胚胎成为胚芽。可利用其生殖细胞中携带该同源重组DNA的子代动物来繁殖后代动物，该后代动物的所有细胞通过该转基因的生殖系转移而含有该同源重组载体。构建同源重组载体和同源重组动物的方法见Bralet A，1991.Current Opinion in Biotechnology.2823-829和Le Mouellec等的PCT国际出版物WO 90/11354；Smithies等，的WO91/01140；Zijlstra等的WO 92/0968；Berns等的WO 93/64168。
另一实施方案中，可产生含有能调节表达该转基因的选择系统的非人转基因动物。这种系统的一个例子是噬菌体P1的cre/loxP重组酶系统。cre/loxP重组酶系统的说明可见例如Lakso等，1992，PNAS.896232-6236。重组酶系统的另一例子是酿酒酵母的FLP重组酶系统(O’Gorman等，1991.Science.2511351-1355。如果用cre/loxP重组酶系统来调节该转基因的表达，需要含编码Cre重组酶和所选蛋白二者转基因的动物。可通过构建“双重”转基因动物，如使二种转基因动物交配，一种含编码所选蛋白的转基因与另一种含编码重组酶的转基因动物交配，来产生这种动物。
实施例实施例1GHRd3和GHRf1的PCR RFLP基因分型PCR RFLP在96孔微滴板(Perkin Elmer)中进行PCR扩增，各孔含有的50μl反应混合物中含200ng DNA、1.5mM MgCl2、5μl 10X反应缓冲液(Perkin Elmer)、0.2mM各dNTP、0.2μM各引物、1.25U Taq聚合酶(Perkin Elmer)。
用9700 Perkin Elmer温度循环仪进行35轮PCR。在琼脂糖凝胶上检测PCR产物。
实施例2检测与GH反应相关的GHRd3等位基因检查了在重组GH治疗试验中注册的97名患特发性身材矮小(ISSO儿童，常见的GHR外显子3变异与对GH治疗生长速率反应的关系。47名患儿中存在GHRd3等位基因，其中3名为GHRd3/d3纯合子，44名为GHRd3/f1杂合子，见表1所示。
表1高加索人个体中GHR基因型的分布
包括正常的矮小身材的受试者。不包括生长激素“确实”有缺陷(GHD)的受试者，具有CNS肿瘤的受试者，具有GHR基因突变的受试者，具有其它激素缺陷的受试者，具有特纳综合征、PHP、季肋发育不良或其它骨发育不良、Laron综合征患者或其它疾病患者。最后，这些受试者包括在GH治疗二年结束后不能表现出青春期体征(乳腺、睾丸)。
关于其它医学和治疗学特征进行基因型分组比较。受试者的特征包括年龄、性别、rGH的剂量、出生时大小和父母身高都要考虑(表2、3和4)。
表2要考虑的临床和生物学表型
表2
图2表示由实施例2得到的含水量＜19％且≥17％的新结晶形式的式(1)化合物的粉末X-射线衍射图案。
本发明也涉及含水量＜17％且≥13％的新结晶形式的式(1)化合物，特征在于其粉末X-射线衍射图案在大约21.8、11.7、11.0、7.30、5.77、5.51、4.93和3.65d-间距单位处存在峰。
特别地，含水量＜17％且≥13％的新结晶形式的式(1)化合物的特征在于其粉末X-射线衍射图案在大约21.8、11.6、11.0、9.2、7.3、7.2、5.77、5.51、4.93、4.49、3.86和3.65d-间距单位处存在峰。
表3表示了由实施例3得到的含水量＜17％且≥13％的新结晶形式的式(1)化合物的以Angstrm单位[A]表示的由d指示的晶格平面之间的特征间隔，及其对应的特征相对强度(很弱(vw)、弱(w)、中等(m)、强(s)或很强(vs))。
结果显示，具有GHR外显子3缺失(GHRd3)的受试者的生长速度，在共变量判定后，高于含全长GHR同工型(GHRf1)的纯合子受试者。相关性矩阵显示，此作用独立于其它共变量。
表6各种参数的线性回归模式
序列表<110>辉瑞健康股份公司(Bougneres，Pierre)<120>预测作用于生长激素受体的制剂的治疗反应的方法<130>10806-211<150>60/434,861<151>2002-12-19<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>4414<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(44)..(1960)<220>
<221>misc_feature<222>(488)..(742)<223>FNS；区域纤连蛋白3型结构域<220>
<221>misc_feature<222>(524)..(775)<223>FNS；区域纤连蛋白III型结构域<220>
<221>variation<222>(579)..(579)<223>等位基因＝A；等位基因＝G<220>
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<221>variation
<222>(729)..(729)<223>等位基因＝A；等位基因＝G<220>
<221>variation<222>(1167)..(1167)<223>在GHR.501中G是U<220>
<221>variation<222>(1362)..(1362)<223>等位基因＝G；等位基因＝T<220>
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<221>variation<222>(1526)..(1526)<223>等位基因＝A；等位基因＝C<220>
<221>variation<222>(1673)..(1673)<223>等位基因＝A；等位基因＝C<220>
<221>variation<222>(1778)..(1778)<223>等位基因＝A；等位基因＝C<220>
<221>variation<222>(2260)..(2260)<223>补体-等位基因＝C；等位基因＝T<220>
<221>variation<222>(2479)..(2479)<223>在GHR.110中C在U<220>
<221>variation<222>(3751)..(3751)<223>等位基因＝A；等位基因＝G<220>
<221>polyA_signal<222>(3751)..(3751)<220>
<221>polyA_site<222>(4414)..(4414)<400>1ccgcgctctc tgatcagagg cgaagctcgg aggtcctaca ggt atg gat ctc tgg 55Met Asp Leu Trp1cag ctg ctg ttg acc ttg gca ctg gca gga tca agt gat gct ttt tct103Gln Leu Leu Leu Thr Leu Ala Leu Ala Gly Ser Ser Asp Ala Phe Ser5 10 15 20gga agt gag gcc aca gca gct atc ctt agc aga gca ccc tgg agt ctg151Gly Ser Glu Ala Thr Ala Ala Ile Leu Ser Arg Ala Pro Trp Ser Leu25 30 35caa agt gtt aat cca ggc cta aag aca aat tct tct aag gag cct aaa199Gln Ser Val Asn Pro Gly Leu Lys Thr Asn Ser Ser Lys Glu Pro Lys40 45 50ttc acc aag tgc cgt tca cct gag cga gag act ttt tca tgc cac tgg247Phe Thr Lys Cys Arg Ser Pro Glu Arg Glu Thr Phe Ser Cys His Trp55 60 65aca gat gag gtt cat cat ggt aca aag aac cta gga ccc ata cag ctg295Thr Asp Glu Val His His Gly Thr Lys Asn Leu Gly Pro Ile Gln Leu70 75 80ttc tat acc aga agg aac act caa gaa tgg act caa gaa tgg aaa gaa343Phe Tyr Thr Arg Arg Asn Thr Gln Glu Trp Thr Gln Glu Trp Lys Glu85 90 95 100tgc cct gat tat gtt tct gct ggg gaa aac agc tgt tac ttt aat tca391Cys Pro Asp Tyr Val Ser Ala Gly Glu Asn Ser Cys Tyr Phe Asn Ser105 110 115tcg ttt acc tcc atc tgg ata cct tat tgt atc aag cta act agc aat439Ser Phe Thr Ser Ile Trp Ile Pro Tyr Cys Ile Lys Leu Thr Ser Asn120 125 130ggt ggt aca gtg gat gaa aag tgt ttc tct gtt gat gaa ata gtg caa487Gly Gly Thr Val Asp Glu Lys Cys Phe Ser Val Asp Glu Ile Val Gln135 140 145cca gat cca ccc att gcc ctc aac tgg act tta ctg aac gtc agt tta535Pro Asp Pro Pro Ile Ala Leu Asn Trp Thr Leu Leu Asn Val Ser Leu150 155 160act ggg att cat gca gat atc caa gtg aga tgg gaa gca cca cgc aat583Thr Gly Ile His Ala Asp Ile Gln Val Arg Trp Glu Ala Pro Arg Asn165 170 175 180gca gat att cag aaa gga tgg atg gtt ctg gag tat gaa ctt caa tac631Ala Asp Ile Gln Lys Gly Trp Met Val Leu Glu Tyr Glu Leu Gln Tyr185 190 195aaa gaa gta aat gaa act aaa tgg aaa atg atg gac cct ata ttg aca679Lys Glu Val Asn Glu Thr Lys Trp Lys Met Met Asp Pro Ile Leu Thr
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caa gct gcc cat att cag cta agc aat cca agt tca ctg tca aac atc1495Gln Ala Ala His Ile Gln Leu Ser Asn Pro Ser Ser Leu Ser Asn Ile470 475 480gac ttt tat gcc cag gtg agc gac att aca cca gca ggt agt gtg gtc1543Asp Phe Tyr Ala Gln Val Ser Asp Ile Thr Pro Ala Gly Ser Val Val485 490 495 500ctt tcc ccg ggc caa aag aat aag gca ggg atg tcc caa tgt gac atg1591Leu Ser Pro Gly Gln Lys Asn Lys Ala Gly Met Ser Gln Cys Asp Met505 5l0 515cac ccg gaa atg gtc tca ctc tgc caa gaa aac ttc ctt atg gac aat1639His Pro Glu Met Val Ser Leu Cys Gln Glu Asn Phe Leu Met Asp Asn520 525 530gcc tac ttc tgt gag gca gat gcc aaa aag tgc atc cct gtg gct cct1687Ala Tyr Phe Cys Glu Ala Asp Ala Lys Lys Cys Ile Pro Val Ala Pro535 540 545cac atc aag gtt gaa tca cac ata cag cca agc tta aac caa gag gac1735His Ile Lys Val Glu Ser His Ile Gln Pro Ser Leu Asn Gln Glu Asp550 555 560att tac atc acc aca gaa agc ctt acc act gct gct ggg agg cct ggg1783Ile Tyr Ile Thr Thr Glu Ser Leu Thr Thr Ala Ala Gly Arg Pro Gly565 570 575 580aca gga gaa cat gtt cca ggt tct gag atg cct gtc cca gac tat acc1831Thr Gly Glu His Val Pro Gly Ser Glu Met Pro Val Pro Asp Tyr Thr585 590 595tcc att cat ata gta cag tcc cca cag ggc ctc ata ctc aat gcg act1879Ser Ile His Ile Val Gln Ser Pro Gln Glv Leu Ile Leu Asn Ala Thr600 605 610gcc ttg ccc ttg cct gac aaa gag ttt ctc tca tca tgt ggc tat gtg1927Ala Leu Pro Leu Pro Asp Lys Glu Phe Leu Ser Ser Cys Gly Tyr Val615 620 625agc aca gac caa ctg aac aaa atc atg cct tag cctttctttg gtttcccaag 1980Ser Thr Asp Gln Leu Asn Lys Ile Met Pro630 635agctacgtat ttaatagcaa agaattgact ggggcaataa cgtttaagcc aaaacaatgt 2040ttaaaccttt tttgggggag tgacaggatg gggtatggat tctaaaatgc cttttcccaa 2100aatgttgaaa tatgatgtta aaaaaataag aagaatgctt aatcagatag atattcctat 2160tgtgcaatgt aaatatttta aagaattgtg tcagactgtt tagtagcagt gattgtctta 2220atattgtggg tgttaatttt tgatactaag cattgaatgg ctatgttttt aatgtatagt 2280aaatcacgct ttttgaaaaa gcgaaaaaat caggtggctt ttgcggttca ggaaaattga 2340atgcaaacca tagcacaggc taattttttg ttgtttctta aataagaaac ttttttattt 2400aaaaaactaa aaactagagg tgagaaattt aaactataag caagaaggca aaaatagttt 2460ggatatgtaa aacatttact ttgacataaa gttgataaag attttttaat aatttagact 2520tcaagcatgg ctattttata ttacactaca cactgtgtac tgcagttggt atgacccctc 2580taaggagtgt agcaactaca gtctaaagct ggtttaatgt tttggccaat gcacctaaag 2640aaaaacaaac tcgtttttta caaagccctt ttatacctcc ccagactcct tcaacaattc 2700taaaatgatt gtagtaatct gcattattgg aatataattg ttttatctga atttttaaac 2760aagtatttgt taatttagaa aactttaaag cgtttgcaca gatcaactta ccaggcacca 2820aaagaagtaa aagcaaaaaa gaaaaccttt cttcaccaaa tcttggttga tgccaaaaaa 2880aaatacatgc taagagaagt agaaatcata gctggttcac actgaccaag atacttaagt 2940
gctgcaattg cacgcggagt gagtttttta gtgcgtgcag atggtgagag ataagatcta 3000tagcctctgc agcggaatct gttcacaccc aacttggttt tgctacataa ttatccagga 3060agggaataag gtacaagaag cattttgtaa gttgaagcaa atcgaatgaa attaactggg 3120taatgaaaca aagagttcaa gaaataagtt tttgtttcac agcctataac cagacacata 3180ctcatttttc atgataatga acagaacata gacagaagaa acaaggtttt cagtccccac 3240agataactga aaattattta aaccgctaaa agaaactttc tttctcacta aatcttttat 3300aggatttatt taaaatagca aaagaagaag tttcatcatt ttttacttcc tctctgagtg 3360gactggcctc aaagcaagca ttcagaagaa aaagaagcaa cctcagtaat ttagaaatca 3420ttttgcaatc ccttaatatc ctaaacatca ttcatttttg ttgttgttgt tgttgttgag 3480acagagtctc gctctgtcgc caggctagag tgcggtggcg cgatcttgac tcactgcaat 3540ctccacctcc cacaggttca ggcgattccc gtgcctcagc ctcctgagta gctgggacta 3600caggcacgca ccaccatgcc aggctaattt ttttgtattt tagcagagac ggggtttcac 3660catgttggcc aggatggtct cgagtctcct gacctcgtga tccacccgac tcggcctccc 3720aaagtgctgg gattacaggt gtaagccacc gtgcccagcc ctaaacatca ttcttgagag 3780cattgggata tctcctgaaa aggtttatga aaaagaagaa tctcatctca gtgaagaata 3840cttctcattt tttaaaaaag cttaaaactt tgaagttagc tttaacttaa atagtatttc 3900ccatttatcg cagacctttt ttaggaagca agcttaatgg ctgataattt taaattctct 3960ctcttgcagg aaggactatg aaaagctaga attgagtgtt taaagttcaa catgttattt 4020gtaatagatg tttgatagat tttctgctac tttgctgcta tggttttctc caagagctac 4080ataatttagt ttcatataaa gtatcatcag tgtagaacct aattcaattc aaagctgtgt 4140gtttggaaga ctatcttact atttcacaac agcctgacaa catttctata gccaaaaata 4200gctaaatacc tcaatcagtc tcagaatgtc attttggtac tttggtggcc acataagcca 4260ttattcacta gtatgactag ttgtgtctgg cagtttatat ttaactctct ttatgtctgt 4320ggattttttc cttcaaagtt taataaattt attttcttgg attcctgata atgtgcttct 4380gttatcaaac accaacataa aaatgatcta aacc 4414<210>2<211>638<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Asp Leu Trp Gln Leu Leu Leu Thr Leu Ala Leu Ala Gly Ser Ser1 5 10 15Asp Ala Phe Ser Gly Ser Glu Ala Thr Ala Ala Ile Leu Ser Arg Ala20 25 30Pro Trp Set Leu Gln Ser Val Asn Pro Gly Leu Lys Thr Asn Ser Ser35 40 45Lys Glu Pro Lys Phe Thr Lys Cys Arg Ser Pro Glu Arg Glu Thr Phe50 55 60Ser Cys His Trp Thr Asp Glu Val His His Gly Thr Lys Asn Leu Gly65 70 75 80Pro Ile Gln Leu Phe Tyr Thr Arg Arg Asn Thr Gln Glu Trp Thr Gln85 90 95Glu Trp Lys Glu Cys Pro Asp Tyr Val Ser Ala Gly Glu Asn Ser Cys100 105 110Tyr Phe Asn Ser Ser Phe Thr Ser Ile Trp Ile Pro Tyr Cys Ile Lys115 120 125Leu Thr Ser Asn Gly Gly Thr Val Asp Glu Lys Cys Phe Ser Val Asp
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<221>repeat_region
<222>(6232)..(6303)<223>补体MER4B分散的<400>4aacttanagt atcaaagcag caagtagatt tgaaggaatt gttacaatgc aattttgctt 60tcccgccact ttaaaatcaa ggtgtagtac tttatttact ttaggaaaat gtttgctttt 120tgtcataatt ccttattgca tatgagagta aatgatctat agatgaagat aataataaaa 180tttagagaga gaataaaaaa gaaacacttt cacagctgaa aggctgcttc ccagttagct 240aactgggagg agttactgaa aaagtacatt gaaaagcggc tcaggggcag gtgaattgga 300ctcaccaggc tctgacattc agagagatgg gaatgagtca gctcactgtc cagcacatct 360ttattttatt tctctttctt gttttatatc agaaatagat ttcttggcat tgttactgtg 420ggtttctatt aaggactgaa caaaagtatt aataatctga gagtatgtaa aaaaaaattc 480attttctcct actatactct cataacacag aatattttgg tgaccagaga tcaccaaaat 540gtgtgtggtg tcaacgaaaa gagtcaaact ctctaaaata tttgaagaga ttttttctga 600gccaaatgtg agtgaacatg gcctgtgaca tagccctcag gaggtcctga gaacatgtgc 660ccaaggtggt cagggtacag cttggttttt atatatttta gggaggcata agacatcaat 720caaatacatt taagaaatac gttgatttgg ttcagaaagg caggacaact caaatgggga 780gcttccaggc tataggtaaa tttaaacatt ttctggttga caattagttg agtttgtctg 840aagacctggg attaatggaa aggactattc aggttaagat atgtttctta ttggacctaa 900aactgtgcct ggctcttagt tgattactgc ctggatctgg gaaggaagga aggaaaacaa 960agggggaagg ggattctcta tagaatgtgg atttttccca taagagactt tgtagggcaa1020tttcaaggca tggcaaggaa atatactttg gggctaatat tttnccttgt ctcataatgt1080tatgccagag tcatattgaa aagcaagtca caatatacaa ggtcaaataa aaccatctga1140tgagaaccca tggtttgtag ggcatgactc cccagaaccc ttaggtagga atttgggcaa1200gataaaaaat cggaacttag tcctcggcgg gaatctctcc ccacacaaat tctccaacag1260attcttcagt gggacaccaa ctgggtggtt ctcaaattca attcaattct gaccaatcta1320cctatctacc tggaaatagc atcagataac cacaggttta cggctcattc caacaatact1380gtcccccact tcagatgcca actgcaagta ataggttgtt acctatactt ctagccagtc1440agctgtnaan tggtgttccc acaacctccc cctccggttt gataatttga gacagcttgc1500ttacatgtac cagcttatta gaaaggatat tacaaaggac acagatgaag agatggatag1560ggtaaggtat gtgggttgga gttgcagagt ttccatgacc tctctgagtg cagcatcttc1620atgtgttcag ctatccagaa tctctcggat taagacattg gccactggtg atcaaattaa1680ccttgagtcc ctctcccctt cctgaggttg gagagtgggg ctgaagtgtc tcaacctcta1740atcaactctt ggtctttcct gtgaccatgc cccatcctga ggctctccag gagcccccag1800gcatcagtca actcattagc atacgaaaga cacttatcac tacagagatt cgaaggattt1860taggaactgt gtcaagaaac ggagacaagg tcaaatatgt atttcacaat atcaccagta1920gtttcactgg gaggtaaaac tcagtgttta ctgtgggcct gagccatgct gaccctctaa1980gaataactta gaggtaacgt gatcagatgt ggggaattct ggagaaacac ctttcaccac2040caagcccaga caagagatgc atacttttct agctgggatg cttacaaagc aacccactct2100aatacttcaa ggtagagtga cactacattc atcatttttc attttttcct gttttttatg2160ccatctacta ctaatgtcaa tcaaattacg actgtgttta tagtggatga attatggacc2220atctcacacc ataaagttct gtttctctca tgttgagctt ttcacctccc ttcattccct2280ccctacttcc aggatcattc acatgtttat ttctaaaaat aaactttttt tactgaactt2340tttttcatac tgtttaaaaa gaatttatat ttctcttcat tcttacagat aagattcaag2400tttaaactca aataatgtag gaaatctttt tttaaaaaat tgttccctac tgtgtctagg2460
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<221>GENE<222>(1)..(1474)
<223>生长激素受体(GHR)包含外显子3的缺失<220>
<221>repeat_region<222>(268)..(1085)<223>补体LTR1B分散的<220>
<221>repeat_region<222>(1094)..(1165)<223>补体MER4B分散的<400>6aatctttttt taaaaaattg ttccctactg tgtctaggcg tgagacccaa aagtaattaa 60gaccaggttt tcatttgctg tgatttgtgt gagttctttt tagaggttag gtgcaatttt 120aatttttaaa agggggatta ttatgagagg agaaatcata ctttatcatt tgaaaatgat 180gccataacag gtgttagcag aaaaatcaaa ctgtaaaata ttttaaagag atttattctg 240agccaatata agtgactgtg gccccattga aatgagcgag ttccctgatc cctctcacag 300agcttgcgac agggatgtgg ctcacctgtt cagttgcccc accgctcaaa cccctagggg 360gagaatacag acggtcaggt gcaaaggctg gggcaagtgc cttggcccct tggcccctta 420gccccgaggt agtgtctagg ggtggggtgc ctgcaacccc agtgttacaa agttctttca 480gctttgcagt ccacggacag cttgagtgtt aatcagctca atggaccctc tgccttatag 540caaaggcaga gggccagtgt gacagctttc tgtatcccaa gctcttgccc agtgtcctag 600aaaaaacaga tcatacaggg gctcgaagga tgagtgcaag gttttattga gtagtggagg 660tggctctcag caagatggat ggggagtggg aagtggggat ggagtgggaa ggtgaacttc 720ctctgaagtc gggcagccca gtggctggac tcttctccaa cctcccccag gcaagctcct 780ctcagcgtcc agatgttcct cttccctctc tctctctgcc gcatcatttc accatctgtc 840tgctggtcag ctggcttgct ggtgtgctgg tctgttggtc tgctggtctg cttctggaac 900ctcaggttca gagtttatat gagtgcagga tagggggtgt tttgggccaa aaggtagctt 960tttggacatg aaaacggaaa tgcctgttcc catttagggc tgcaggtctt caggcttgag1020ggtggggcct ttgcccagga actaccctct tctacccagt gtttccctgt ctcctgtcca1080tatcaccagt attcacagtc tcaaggagtc ttgagaaagt gtgcccaagg ccgtcagatt1140cagtttggtt ctgtatgtca cagggtctaa gaagcgtaaa cattgtgcct tgttgaaata1200cagcctctag gtatggagga tgtgttgaac aacttcctac cagtcatttg gcatatgttg1260atttcctgtc ttcatgatac gtaagacgac tagctaatta tcattcatat gtggtaagtc1320acatagatac tgacttcccc tatctttcca gctttttctt atcaaaagtc acctgctctc1380tgtcccagga acgactggct aaagtaacct atatcagtgt ctgtaacagt gggcacctat1440catagtgcac atgcttgaac atatcattgc cttt147权利要求
1.一种预测受试者对能结合GHR蛋白的试剂的反应的方法，其特征在于，所述方法包括测定受试者内是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因与对所述试剂有高或低的阳性反应的可能性相互关联，从而可鉴定该受试者对所述试剂的治疗反应可能增高或降低。
2.一种预测受试者对能提高受试者身高或生长速度的试剂的反应的方法，其特征在于，所述方法包括测定受试者内是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因与对所述试剂有高或低的阳性反应的可能性相互关联，从而可鉴定该受试者对所述试剂的治疗反应可能增高或降低。
3.一种预测受试者对治疗肥胖症的试剂的反应的方法，其特征在于，所述方法包括测定受试者内是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因与对所述试剂有高或低的阳性反应的可能性相互关联，从而可鉴定该受试者对所述试剂的治疗反应可能增高或降低。
4.一种预测受试者对治疗感染的试剂的反应的方法，其特征在于，所述方法包括测定受试者内是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因与对所述试剂有高或低的阳性反应的可能性相互关联，从而可鉴定该受试者对所述试剂的治疗反应可能增高或降低。
5.一种预测受试者对治疗糖尿病的试剂的反应的方法，其特征在于，所述方法包括测定受试者内是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因与对所述试剂有高或低的阳性反应的可能性相互关联，从而可鉴定该受试者对所述试剂的治疗反应可能增高或降低。
6.一种预测受试者对治疗肢端肥大症或巨人症的试剂的反应的方法，其特征在于，所述方法包括测定受试者内是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因与对所述试剂有高或低的阳性反应的可能性相互关联，从而可鉴定该受试者对所述试剂的治疗反应可能增高或降低。
7.一种预测受试者对治疗钠或水滞留相关疾病的试剂的反应的方法，其特征在于，所述方法包括测定受试者内是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因与对所述试剂有高或低的阳性反应的可能性相互关联，从而可鉴定该受试者对所述试剂的治疗反应可能增高或降低。
8.一种预测受试者对治疗代谢综合征的试剂的反应的方法，其特征在于，所述方法包括测定受试者内是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因与对所述试剂有高或低的阳性反应的可能性相互关联，从而可鉴定该受试者对所述试剂的治疗反应可能增高或降低。
9.一种预测受试者对治疗心境和睡眠障碍的试剂的反应的方法，其特征在于，所述方法包括测定受试者内是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因与对所述试剂有高或低的阳性反应的可能性相互关联，从而可鉴定该受试者对所述试剂的治疗反应可能增高或降低。
10.一种预测受试者对治疗癌症的试剂的反应的方法，其特征在于，所述方法包括测定受试者内是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因与对所述试剂有高或低的阳性反应的可能性相互关联，从而可鉴定该受试者对所述试剂的治疗反应可能增高或降低。
11.一种预测受试者对治疗心脏疾病的试剂的反应的方法，其特征在于，所述方法包括测定受试者内是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因与对所述试剂有高或低的阳性反应的可能性相互关联，从而可鉴定该受试者对所述试剂的治疗反应可能增高或降低。
12.一种预测受试者对治疗高血压的试剂的反应的方法，其特征在于，所述方法包括测定受试者内是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因与对所述试剂有高或低的阳性反应的可能性相互关联，从而可鉴定该受试者对所述试剂的治疗反应可能增高或降低。
13.一种鉴定受试者对采用能结合GHR蛋白的试剂治疗疾病或病症反应可能增高或降低的方法，其特征在于，所述方法包括a)使存在GHR基因的等位基因与受试者对能结合GHR蛋白的试剂的反应相关联；和b)在该受试者中检测步骤a)的等位基因，从而鉴定该受试者对用所述试剂治疗的反应可能增高或降低。
14.一种鉴定与采用能结合GHR蛋白的试剂治疗疾病的可能性增高或降低相关的GHR基因的等位基因的方法，其特征在于，所述方法包括a)测定受试者中是否存在GHR基因的等位基因；和b)使步骤a)的等位基因的存在情况与用能结合GHR蛋白的试剂治疗疾病的可能性增高或降低相关联，从而鉴定出与用所述试剂治疗的反应可能增高或降低相关的等位基因。
15.如权利要求1或13-14所述的方法，其中，所述能结合GHR蛋白的试剂是能治疗选自以下疾病的试剂身材矮小、肥胖症、感染或糖尿病；肢端肥大症或巨人症，或与其相关的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效应；与钠或水滞留相关的症状；代谢综合征；心境和睡眠障碍、癌症、心脏病和高血压。
16.一种加快受试者生长的方法，其特征在于，所述方法包括(a)测定该受试者中是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因与对能加快受试者生长的试剂的阳性反应可能增高或降低相关联；和(b)选择或确定给予所述受试者的所述试剂的有效量。
17.一种治疗肥胖症患者的方法，其特征在于，所述方法包括(a)测定该受试者中是否存在GHR基因的等位基因，将该等位基因与对能改善肥胖或其症状的试剂的阳性反应可能增高或降低相关联；和(b)选择或确定给予所述受试者的所述试剂的有效量。
18.一种治疗糖尿病患者的方法，其特征在于，所述方法包括(a)测定该受试者中是否存在GHR基因的等位基因，将该等位基因与对能改善糖尿病或其症状的试剂的阳性反应可能增高或降低相关联；和(b)选择或确定给予所述受试者的所述试剂的有效量。
19.一种治疗感染患者的方法，其特征在于，所述方法包括(a)测定该受试者中是否存在GHR基因的等位基因，将该等位基因与对能改善感染或其症状的试剂的阳性反应可能增高或降低相关联；和(b)选择或确定给予所述受试者的所述试剂的有效量。
20.一种治疗肢端肥大症或巨人症患者的方法，其特征在于，所述方法包括(a)测定该受试者中是否存在GHR基因的等位基因，将该等位基因与对能改善肢端肥大或巨人症，或与此二种疾病相关的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化症状的试剂的阳性反应可能增高或降低相关联；和(b)选择或确定给予所述受试者的所述试剂的有效量。
21.一种治疗与钠或水滞留异常相关症状患者的方法，其特征在于，所述方法包括(a)测定该受试者中是否存在GHR基因的等位基因，将该等位基因与对能改善所述与钠或水滞留异常相关的症状的试剂的阳性反应可能增高或降低相关联；和(b)选择或确定给予所述受试者的所述试剂的有效量。
22.一种治疗代谢综合征患者的方法，其特征在于，所述方法包括(a)测定该受试者中是否存在GHR基因的等位基因，将该等位基因与对能改善所述代谢综合征或其症状的试剂的阳性反应可能增高或降低相关联；和(b)选择或确定给予所述受试者的所述试剂的有效量。
23.一种治疗心境和睡眠障碍患者的方法，其特征在于，所述方法包括(a)测定该受试者中是否存在GHR基因的等位基因，将该等位基因与对能改善所述心境和睡眠障碍或其症状的试剂的阳性反应可能增高或降低相关联；和(b)选择或确定给予所述受试者的所述试剂的有效量。
24.一种治疗癌症患者的方法，其特征在于，所述方法包括(a)测定该受试者中是否存在GHR基因的等位基因，将该等位基因与对能治疗癌症的试剂的阳性反应可能增高或降低相关联；和(b)选择或确定给予所述受试者的所述试剂的有效量。
25.一种治疗心脏病或高血压患者的方法，其特征在于，所述方法包括(a)测定该受试者中是否存在GHR基因的等位基因，将该等位基因与对能改善所述心脏病或高血压或其症状的试剂的阳性反应可能增高或降低相关联；和(b)选择或确定给予所述受试者的所述试剂的有效量。
26.如权利要求16-25中任一项所述的方法，还包括(c)给予所述受试者有效量的所述试剂。
27.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法包括测定受试者的DNA是否编码含外显子3缺失的GHR多肽。
28.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法包括测定受试者中是否存在GHRd3等位基因。
29.如权利要求27或28所述的方法，所述方法包括测定受试者是GHRd3等位基因的杂合子还是纯合子。
30.如权利要求27-29所述的方法，其中，所述测定步骤包括检测样品中的GHRd3核酸。
31.如权利要求30所述的方法，其中，所述测定步骤包括进行杂交试验。
32.如权利要求27-29所述的方法，其中，所述测定包括检测样品中的GHRd3多肽。
33.如权利要求32所述的方法，其中，所述测定步骤包括检测抗体与样品中GHRd3多肽的结合。
34.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人类受试者。
35.如权利要求16所述的方法，其中，所述受试者患有ISS。
36.如权利要求16所述的方法，其中，所述受试者的身高低于同年龄同性别正常人2个标准差。
37.如权利要求16或26所述的方法，所述方法还包括测定受试者的身高是否低于同年龄同性别正常人2个标准差。
38.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述试剂是重组生长激素多肽，或其片段或变体。
39.如权利要求38所述的方法，其中，GH的有效量高于约0.2mg/kg/周。
40.如权利要求38所述的方法，其中，GH的有效量高于约0.25mg/kg/周。
41.如权利要求38所述的方法，其中，GH的有效量高于约0.3mg/kg/周。
42.如权利要求38所述的方法，其中，GH的有效量在约0.001-0.2mg/kg/天之间。
43.如权利要求38所述的方法，其中，GH的有效量在约0.01-0.1mg/kg/天之间。
全文摘要
本发明提供使受试者对能结合生长素受体(GHR)蛋白的试剂产生反应的方法，该方法包括测定该受试者中是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因与对该试剂有高或低的阳性反应的可能性相互关联，从而可鉴定该受试者对该试剂的治疗反应可能增高或降低。
文档编号C12Q1/68GK1747968SQ200380109702
公开日2006年3月15日 申请日期2003年11月10日 优先权日2002年12月19日
发明者P·布格内雷斯 申请人:辉瑞健康股份公司