生长激素融合蛋白的制作方法

专利名称：：生长激素融合蛋白的制作方法生长激素融合蛋白本发明涉及嵌合多肽，所述的多肽含有与生长激素受体的受体结合区连接的经修饰的生长激素结合区；本发明还涉及所述修饰的生长激素结合区的串连物/低聚物。GH是一种与调节哺乳动物生长和发育有关的激素大家族中的一员。人GH是一种22kDa的多肽，其与众多生物学过程有关，例如，细胞生长，乳汁分泌，巨噬细胞活化以及能量新陈代谢调控。GH通过GH上称为位点1和位点2的两个独立位点依次与膜结合的两个GHR反应。位点l为高亲和性结合位点，而位点2为低亲和性位点。单独的GH分子通过位点1与第一个GHR结合。随后第二个GHR通过位点2加入从而形成GHR:GH:GHR复合体。该复合体随后被内化，并活化信号传导级联从而导致基因表达改变。GHR的胞外区存在两个相连区域，每个大约100个氨基酸(SD-100)。其中C-末端SD-100区域(b)最接近细胞表面，而N-末端SD-100区域(a)离得最远。一旦激素与形成的三聚复合体GHR-GH-GHR结合，这两个区域的构象就会发生改变。美国专利5849535公开了经修饰的GH,在此引为参考。对GH的该修饰发生在位点1和位点2结合位点。对位点1的〗务饰产生出一种对GHR亲和力高于野生型GH的GH分子，这种修饰的GH分子具有激动剂活性。该文献还公开了对位点2的修饰，该修饰产生GH拮抗剂。美国专利US5854026、US6004931、US6022711、US6057292和US6136563公开》务饰GH而改变GH位点1的亲和力的其它例子，其中的每一篇在此均引为参考。表1中列出了对位点1进行修饰的情况。对位点2的修饰也有公开，特别是当将氨基酸残基G120修饰为精氨酸，赖氨酸，色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸或谷氨酸中的任何一种时，会产生一种具有拮抗特性的GH分子。此外，通过已知的"聚乙二醇化，，方法将经修饰的GH包裹在聚乙烯乙二醇(PEG)中能产生许多有益效果。首先，PEG包裹使GH的有效分子量从22kD增大至大约40kD，这产生的效果降低了GH的血管小球滤过，从而增加了GH在体内的半衰期，进而减少达到预期效果的给药剂量。此外，认为聚乙二醇化既降低了用这种方式处理过的蛋白的免疫原性，还降低了其毒性，参见AbuchowskietalJBiolChem,,252,3578-3581,(1977)。然而，聚乙二醇化降低了经修饰的GH分子对GHR的亲和性，这意味着必须增加所需的剂量来克服亲和性的降低。由于它抵消了聚乙二醇化带来的修饰GH的半衰期增加的有益效果，因此这种结果不尽人意。人们期望获得一种经修饰的GH分子，该分子不需要聚乙二醇化，但也具有增加的半衰期并具有降低的免疫原性和无毒性的附加优点。本发明的第一方面提供了一种嵌合多肽，该多肽包括i)至少一个经修饰的生长激素结合区，其中所述的修饰为插入、缺失或取代至少一个氨基酸残基；和ii)生长激素受体的生长激素结合区。在本发明的优选实施方案中，所述多肽在生长激素的位点1结合区被修饰。在本发明进一步优选的实施方案中，所述多肽在生长激素的位点2结合区被修饰。在本发明进一步优选的实施方案中，所述多肽在生长激素的位点1和位点2被》务饰。如上文所述，位点1的突变是本领域公知的，其能提高生长激素与生长激素受体上的其结合区的亲和性，这种修饰的生长激素作为促效剂。如果位点1修饰与位点2修饰相结合，则后一修饰会使位点2结合位点失活或部分失活，因此该分子作为拮抗剂。屏蔽掉野生型位点1结合位点仅对位点2进行修饰也同样产生拮抗剂。在本发明进一步的优选实施方案中提供了一种多肽，该多肽含有经氨基酸取代修饰的位点1结合区，所述的修饰选自对图12所示的序列用丙氨酸或天门冬氨酸取代组氨酸18，用天门冬酰胺取代组氨酸21，用丙氨酸取代谷酰胺22，用丙氨酸取代苯丙氨酸25，用丙氨酸取代天门冬氨酸26，用丙氨酸取代谷酰胺29,用丙氨酸取代谷氨酸167,用丝氨酸取代天门冬氨酸171，用丝氨酸或丙氨酸取代赖氨酸172和用酪氨酸取代异亮氨酸179。优选地，所述增加位点1与GHR中的其结合区的亲和性的修饰包括如下氨基酸取代对图12中的GH氨基酸序列用天门冬氨酸取代组氨酸18,用天门冬酰胺取代组氨酸21，用天门冬酰胺取代精氨酸167,用精氨酸取代天门冬氨酸171，用丝氨酸取代谷氨酸174和用苏氨酸取代异亮氨酸179。在本发明进一步优选的实施方案中，所述的增加位点1与GHR中的其结合区的亲和性的修饰包括如下氨基酸取代对图12中的GH氨基酸序列用丙氨酸取代组氨酸18，用丙氨酸取代谷胺酰22,用丙氨酸取代苯丙氨酸25，用丙氨酸取代天门冬氨酸26，用丙氨酸取代谷氨酰29,用丙氨酸取代谷氨酸65,用丙氨酸取代赖氨酸168和用丙氨酸取代谷氨酸174。在本发明进一步的优选实施方案中，所述的位点2修饰是对图12所示序列的氨基酸残基120进行修饰。优选地，所述位点2^f，务饰与位点1修饰相结合，如同本文的公开。可选择地，GH仅在氨基酸残基甘氨酸120处被修饰。在本发明的优选实施方案中，所述的位点2修饰是用下列的氨基酸取代甘氨酸精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸。优选地，所述取代是用精氨酸或赖氨酸或丙氨酸取代甘氨酸120。在本发明进一步的优选实施方案中，GHR的生长激素结合区为GHR的胞外区域。更优选地，该结合区为GH的C-末端SD-100结构域。可选的，所述结合区为全长GHR。在本发明的优选实施方案中，所述嵌合多肽是融合蛋白，其中经修饰的GH与GHR或GHR部分发生符合读框的平移融合。优选地，所述融合多肽含有经4务饰的GH和GHR的C-末端SD-100区域。在本发明可选择的进一步优选的实施方案中，GH经修饰的结合区通过连接子与GHR的GH结合区相连。该连接子是可变的。所述的连接子可以是受体胞外区的任何残基，其能使修饰的GH与细胞表面的自由受体发生可变结合。优选地，在靠近修饰的GH分子C-末端的残基和靠近GHRN-末端的残基之间形成连接子。更优选地，在靠近修饰的GH分子C-末端的残基和靠近C-末端SD-100N-末端的N-末端残基之间形成连接子。更优选地，在GHRC-末端SD-100的N-末端位点126-128的任何残基处形成连接子。在本发明的实施方案中，在C-末端SD-100的N-末端127残基处形成连接子。优选地，所述连接子是肽。GHR:GH:GHR复合体的晶体结构显示GH的C-末端(残基191)与C-末端SD-100的N-末端(残基126-128)的距离为10A。这为设计连接子提供了有用的信息。优选地，所述连接子是含有5到30个氨基酸残基的多肽。更优选地，所述连接子含有10到20个氨基酸残基。更优选地，所述连接子含有至少一个拷贝的下述肽GlyGlyGlyGlySer(在下文中称为"Gly4Ser")。在本发明实施方案中，所述连接子长10个氨基酸，含有2拷贝的Gly4Ser连接子。在本发明的可选实施方案中，所述连接子长15个氨基酸，含有3拷贝的Gly4Ser连接子。在又一可选实施方案中，所述连接子长20个氨基酸，含有4拷贝的Gly4Ser连接子。在本发明的优选实施方案中，所述多肽来源于人GH和人GHR。本发明的另一方面提供了编码本发明所述多肽的核酸分子，该核苷酸分子选自i)图13的核酸序列所示的核酸分子；和ii)能与(i)中的核酸序列杂交的核酸分子。编码本发明的经修饰的生长激素的核酸分子，可以典型地用本领域公知的分子技术来合成，包括重组法和使用寡核普酸合成仪的核酸分子合成法。在本发明的优选实施方案中，所述的核酸分子在严格杂交条件下杂交。本文所采用的术语"严格杂交条件"是指所用的本领域熟知的参数。在记载了这种方法的参考文献中可以找到这类核酸杂交参数，例如，Mo/ecw/orC7om'w爿丄a6ora^yMa肌a/，J.Sambrook等编,第二版，Cold9SpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,1989，或Cwre"f尸ratoco/sz.mMo/ecw/w^'o/ogy,F.M.Ausubel等编,JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork。更详细地，本文所用的严格杂交条件的例子是指，65。C在杂交緩沖液(3.5xSSC，0,02%Ficoll，0.02%聚乙烯吡咯烷酮，0.02%牛血清白蛋白，2.5mMNaH2P04(pH7)，0.5%SDS,2mMEDTA)中杂交。SSC为0.15M的氯化钠/0.015M的柠檬酸钠，pH7;SDS为十二烷基硫酸钠；同时EDTA为乙二胺四乙酸。杂交后，将DNA转移到膜上，室温下，用2xSSC漂洗该月莫，随后将温度升高到68。C在0.1-0.5xSSC/0.1xSDS中漂洗。本发明的另一方面提供了一种含有本发明所述核酸分子的载体。在本发明的优选实施方案中，所述的载体是适于重组基因表达的表达载体。典型地，所述适于的例子包括，但不仅限于提供介导细胞/组织特异表达的转录调控序列(启动子序列)。这些启动子序列可以是细胞/组织特异性的、诱导型的或组成型的。启动子是本领域公知的术语，但为了清楚的目的，描述为具有下列特征，这些特征仅仅是举例，并不产生任何限制。增强子元件是顺式作用核酸序列，通常位于基因转录起始位点的5'端(增强子也可位于基因序列的3'端或甚至位于内含子序列中，因而其位置独立)。增强子的功能是增强与其连接的基因的转录速率。增强子的活性受与增强子元件特异结合的反式作用转录因子的影响。转录因子的结合/活性(参见EukaryoticTranscription,byDavidSLatchman,AcademicPressLtd,SanDiego)受许多环境因素的影响，这些因素的例子包括，但不限于中间代谢物和/或环境效应器。启动子元件还含有所谓的TATA盒和具有转录起始位点选择功能的RNA聚合酶起始选择(RIS)序列。这些序列还与多肽结合，该多肽具有有利于RNA聚合酶转录起始选择的功能。所述的适于还包括提供选择性标记和有助于在真核细胞或原核宿主中保持所述载体的自主复制序列。自主保持的载体被称为游离型载体。由于这类分子可整合大的DNA片段(30-50kbDNA),因此游离型载体是理想的。这类游离型载体记载于W098/07876中，在此引为参考。苷酸化序列，还包括提供内部核糖体进入位点(IRES)，该IRES具有<吏排列在双顺反子或多顺反子表达盒中的基因编码载体最大化表达的功能。所述的适于是本领域公知的，有大量的公开文献涉及到表达载体的构建和通用的重组DNA技术。参见Sambrook等(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual，ColdSpringHarbourLaboratory,ColdSpringHarbour,NY;Marston，F(1987)DNACloningTechniques:APracticalApproach,第3巻，IRLPress,OxfordUK;DNACloning:FMAusubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.(1994)。本发明的另一方面提供了本发明的多肽作为药物的用途。在本发明的优选实施方案中，所述多肽用于制备药物以治疗下述疾病巨人症，肢端肥大症，癌症(例如，肾胚细胞肿瘤，成骨肉瘤，乳^^癌，结肠癌，前列腺癌，曱状腺癌)，糖尿病引起的视网膜病，糖尿病引起的肾病以及糖尿病和GH过量引起的其他并发症。本发明的多肽和组合物可以采用任何常规的方式给药，包括注射或在一段时间内逐渐灌输的方式。所述给药的例子包括口服、静脉内、腹膜内、肌内、体腔内、眼内、皮下或脑内给药。所述的药物组合物可以方便地制成单位剂量形式，并用制药领域公知的任何方法来制备。当给药时，本发明所述的药物制剂以药学上可接受的剂量和药学上可接受的组分形式给药。术语"药学上可接受"是指不妨碍活性成分的生物学活性效果的非毒性物质。所述的制剂通常可以含有盐、緩冲剂、防腐剂、相容性载体和可选择的其他治疗药剂。如果需要，所述的组合物可以与药学上可接受的载体结合。术语"药学上可接受的载体"是指一种或多种适于向人给药的相容性固体或液体填充剂、稀释剂或胶嚢物质。术语"载体"是指天然或合成的有机或无机成分，活性成分与其结合可使应用方便。所述的药物组合物可以含有合适的緩冲剂，如乙酸盐、硼酸盐和磷酸盐。所述的药物组合物可选4奪地还可以含有合适的防腐剂，如苯扎氯铵、氯丁醇、羟基苯曱酸酯类和噻汞撒。本发明的另一方面提供了用本发明所述核酸或载体转化或转染的细胞。在本发明的优选实施方案中，所述的细胞是真核细胞。优选地，所述的细胞选自粘液菌(例如网柄菌)，酵母细胞(例如啤酒酵母、毕赤氏酵母(尸/c/n'as;p))，哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞)，植物细胞和昆虫细月包(例如《火粘虫(Spodoptera))。在可选择的优选实施方案中，所述细胞是原核细胞，优选为大肠杆菌属(^sc/2g/r/n'aco//)或芽孑包杆菌属(5a"7/ws>s，)的细胞。本发明的另一方面提供了制造本发明所述多肽的方法，该方法包括i)制备本发明所述的细胞；ii)在有利于本发明所述多肽产生的条件下培养所述细胞；和任选地iii)从细胞或细胞培养基中分离所述多肽。在本发明的优选方法中，所述多肽携带有方便从所述细胞中纯化该多肽的分泌信号。更优选地，所述多肽携带有方便vt人所述细胞或细胞培养基中纯化该多肽的亲和标记。本发明的另一方面提供了治疗哺乳动物，优选治疗人的方法，该方法包括向所述哺乳动物给予本发明所述多肽。本发明的另一方面提供了嵌合多肽，该多肽具有两个以上经修饰的生长激素结合位点，其中所述修饰为插入、缺失或取代至少1个氨基酸残基。在本发明的优选实施方案中，提供了大多数生长激素结合区被修饰的嵌合多肽。在本发明的优选实施方案中，提供了至少含有两个经过修饰的位点2生长激素结合区的嵌合多肽。在本发明的另一优选实施方案中，提供了含有3、4、5、6、7、8、9、10个经修饰的位点2生长激素结合区的嵌合多肽。如本发明的另一优选实施方案中，所述的嵌合多肽含有两个以上通过连接子分子连接在一起的经修饰的生长激素结合区。优选地所述的连接子分子为上文所公开的连接子分子。本发明的另一方面，所述的嵌合多肽含有两个以上经修饰的生长激素结合区，该多肽还含有至少一个生长激素受体的生长激素结合区。优选地，所述嵌合多肽含有两个经修饰的生长激素结合区和一个生长激素受体的生长激素结合区。优选地，所述嵌合多肽含有至少两个经修饰的位点2生长激素结合区。与含有与受体结合区相连的生长激素结合区的嵌合多肽相关的方面和实施方案也适用于含有多个或多数生长激素结合区的嵌合多肽。例如，含有编码所述嵌合多肽的核酸的载体，含有所述多肽的药物组合物，表达所述嵌合多肽的细胞系，制备所述多肽的方法和利用所述多肽进行治疗的方法都在与这种嵌合多肽有关的本发明的范围内。现在，将通过具体例子并结合下述表和附图对本发明的具体实施方案作进一步的描述表1简要显示了对人GH位点1和位点2进行的氨基酸取代；图l是pHEAT.GH.G120R的质粒图镨，该质粒通过连接PCR合成的位于BomHI和7VWI限制性酶切位点间的GH.G120R基因构建。该质津立的选择才示i己为Amp11;图2是pTrcHis-TOPO.1A7的质粒图i普，该质粒通过连接pTrcHis1A1的万amffl和iVort位点间的GH.G120R基因构建，其连接子为(G4S)4,质粒上的选择标记为AmpR;图3是pTrcHis-TOPO.1B2的质粒图谱，该质粒通过连接pTrcHis旧l的BamHI和NotI位点间的GH.G120R基因构建，其连接子为(G4S)4，质粒上的选4奪标记为AmpR;图4是pTrcHis-TOPO.1C3的质粒图谱，该质粒通过连接pTrcHis1A7的五coRI和历"DIII位点间的GH.G120R基因构建，其连接子为(G4S)4，质粒上的选4奪标记为AmpR;图5是GH.G120R基因的序列，其中标明了起始密码子、6xHis标记、相关的限制性酶切位点、终止子和G120R突变(CGC)。实际的GH.G120R组成用大写字母表示，序列区域用黑体显示；图6是1A7基因的序列，其中标明了起始密码子、6xHis标记、相关13的限制性酶切位点、终止子和G120R突变(CGC)。实际的GH.G120R-(G4S)4-GHR(b)组成用大写字母表示，序列区域用黑体显示；图7是1B2基因的序列，其中标明了起始密码子、6xHis标记、相关的限制性酶切位点、终止子和G120R突变(CGC)。实际的GH.G120R-(G4S)4-GHR(flec)组成以大写字母表示，序列区域以黑体显示；图8是1C3基因的序列，其中标明了起始密码子、6xHis标记、相关的限制性酶切位点、终止子和G120R突变(CGC)。实际的GH.G120R-(G4S)4-GH.G120R组成以大写字母表示，序列区域以黑体显示；图9是用抗人GH作为一抗，用15%SDSPAGE胶进行的Western印迹以研究GH.G120R、1A7、1B2和1C3的表达。表达由E.coliXL1Blue或E.coliSURE中的pTrcHis载体产生，在加入lmM(终浓度)IPTG诱导后4小时取样。印迹结果显示GH.G120R和1C3产生单一的带，而1A7和1B2的样品含有裂解产物；图10显示了对纯化GH.G120R、1A7和1C3的15%SDSPAGE胶进行的考马氏亮蓝染色[C]，和用抗人GH作为一抗对这些样品进行的Western印迹[W]。考马氏亮蓝染色结果表明纯化的蛋白样品达>95%的纯度，然而western印迹结果表明只有GH.G120R和1C3产生单一的带，而1A7样品含有裂解的产物；图11的图表显示了对GH.G120R、1A7和1C3进行GH生物测定的结果。每一图表显示了标准曲线、单独采用不同浓度的构建体的试验结果和采用不同浓度的构建体与25ng/mlhGH联用的试验结果。这些结果显示没有一种蛋白具有固有的激动活性，但其全部都具有拮抗活性。其中GH.G120R活性最强，1A7活性最弱。图12是未修饰的GH的氨基酸序列；图13是未修饰的GH的核酸序列。材料和方法制备位点1和/或位点2经修饰的GH的方法在US5849535、US5854026、US6004931、US6022711、US6057292和US6136563中公开，每篇文献在此都引为参考。DNA构建体位点2突变的GH拮抗剂(GHa)的制备从人脑垂体组织中通过PCR扩增出人GH的cDNA(图13)，并克隆至载体pTrcHis國Topo(pTrcHis-TOPO國GHstop)中。用PCR从人肝脏cDNA中扩增出GHR胞外区。生长激素拮抗剂(G120R)构建体生长激素的G120R突变通过噬菌体介导的ssDNA突变方法使生长激素(GH)基因发生突变。首先将该GH基因,人pTrcHisGH亚克隆至pT7T318的BamHI和HindIII位点间，从而产生pT7T318-GH。随后将该质粒转化至E.coliCJ236中，产生单链ssDNA。然后，将Glyl20的密码子从GGC变为CGC，从而使pT7T318-GH的ssDNA发生突变，其中采用了GH.(G120R)上游引物。突变过程后产生dsDNA的pT7T318-GH.G120R,随后将其用于将GH.G120R亚克隆至pHEAT载体，从而产生了pHEAT.GH.G120R(图1)。GH.G120R构建体的制备ylA7「GH.G120R-(G^VGHR(b)1=与GHR的b区域连接的GHa利用限制性酶切位点BamHI和Notl从pHEAT.GH.G120R(图1)中剪切下GH.G120R基因。随后将该基因连接至pTrcHisXlAl[GH-(G4S)4-GHR(b)]的GH基因位置(图2)。将得到的质粒转化至EscherichiacoliXL1Blue中，并涂布于LB(0.3%葡萄糖，50ug/ml胺千青霉素，12.5ug/ml四环素)琼脂糖平板上。ylB2「GH.G120R-(X^S、-GHRflecl=与全长GHR胞外区相连的GHa重复产生5ClA7基因的步骤，只将受体载体改为pTrcffisx旧l[GH-(G4S)4-GHRflec](图3)。将得到的质粒转化至E.coliXL1Blue中，并涂布于LB(0.3。/。葡萄糖，50ug/ml胺苄青霉素，12.5ug/ml四环素)琼脂糖平板上。ylC3「GH.G120R-(G￡SV-GH.G120R1=GHa串连子釆用引物DiGHEcoFl和DiGHHinRl对pTrcHisGH进行PCR扩增反应。然后采用五coRI和i^"din消化PCR产物，将该产物连接至pTrcHisXlAl[GH-(G4S)4-GHR(b)](图4)的GHR(b)区域。将得到的质粒转化至重组缺陷型E.coliSURE中，并涂布于LB(0.3。/。葡萄糖，50ug/ml胺苄青霉素，12.5ug/ml四环素，50ug/ml卡那霉素)琼脂糖平板上。测序结果对含有构建基因的质粒进行测序。对GH.G120R、xlA7、;^B2和义1C3进行测序所得的基因和区域序列分别如图5-8所示。表达研究将单个克隆分别接种于用于培养五.co//XL1Blue细胞的LB(0.3%葡萄糖，50ug/ml胺千青霉素，12.5ug/ml四环素)培养基和用于培养E.coliSURE细胞的LB(0.3%葡萄糖，50ug/ml胺节青霉素，12.5ug/ml四环素，50ug/ml卡那霉素)培养基中。随后在37。C下振荡培养。随后将200ul的LB过夜培养物接种于含有合适抗生素的4ml4YT培养基中。培养3小时后取出lml样品(To样品)。随后采用终浓度为lmM的IPTG诱导4YT培养物，并再培养4小时(T4样品)。取出To和T4样品后立即对其进行处理。首先离心使其形成细胞颗粒沉淀，随后弃去上清，将颗粒沉淀置于SDSPAGE胶上电泳。通过考马氏亮蓝染色或通过以抗GH作为一抗的western印迹来^f吏该PAGE月交上的蛋白质显色以;险测构建体存在。在全部情形中，考马氏亮蓝染色的PAGE胶没有表现出构建体的过度表达。但是在western印迹中却观察到构建体(图9)。这表明在所有情形中，正确大小的蛋白都得到表达。纯化一般是从4x250ml的含有合适抗生素，并经终浓度为lmM的IPTG诱导4-5后获得的4YT培养物中纯化蛋白质。经离心收集细胞，超声波处理后，用溶菌酶和脱氧胆酸钠处理〗吏细力包裂解。16离心裂解的细胞除去细胞碎片，并采用InvitrogenProBond树脂(Ni-纯化柱)初步纯化上清。采用5ml0.5M的咪唑洗脱蛋白质。将Ni-纯化柱的洗脱液以合适的i爰冲液10倍稀释后4吏其通过MonoQ离子交换柱而使蛋白质样品进一步纯化。采用超过20ml的O-lMNaCl的盐梯度，以0.5ml/min的速率洗脱蛋白质，收集0.5ml的部分。然后，对该部分进行分析以确定构建体的存在，结果表明该部分含有大量的构建体。通过SDSPAGE(考马氏亮蓝染色和western印迹)(图10)和浓度测量试验来分析纯化的蛋白质。随后将蛋白质用于生物检测。对于在western印迹中显示出裂解产物的X1A7和xlB2，将所述构建体置于快速翻译系统(RTS)中，使其发生体外转录。以前对xlA7和xlB2的研究表明，RTS系统与蛋白酶抑制剂和表达的陪伴蛋白联用时可以使裂解显著减少。生物测定采用Asterion标准GH生物测定来检测纯化的构建体。采用一定剂量范围的构建体来刺激制备的、稳定表达生长激素受体的293Hi。同时还准备另一个完全相同的培养皿，但加入25ng/ml的GH处理30分钟。在加入所述构建体后，观察所述构建体的拮抗作用。全部的GH.G120R构建体都具有拮抗活性(图11)。拮抗剂活性的筛选用一种确定的生物测定方法来筛选拮抗剂活性(9)。用与活化的Stat5结合的萤光素酶报告基因瞬时转染表达全长GHR的永久细胞系(9)。24小时后，釆用含有或不含有拮抗剂的GH刺激所述细胞6小时。随后裂解细胞并测定萤光素酶的活性(9)。测定体内新陈代谢清除率麻醉Sprague-Dawley小鼠，并在其大腿和颈静脉血管处植入插管。两天后，经静脉或皮下注射方式用GH嵌合体或串连子给药。经大腿插管处收集血液样品，并通过放射免疫测定来检测嵌合体和串连子或寡聚蛋白的水平。采用适合于计算激素浓度随时间变化的可用计算机程序来预测药动力学参数。表1简要显示了GH位点1的氨基酸取代。对位点2的修饰包括采用精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸中的任何一种来取代G120。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>权利要求1.一种嵌合多肽，该多肽含有i)第一经修饰的生长激素的生长激素受体结合区，其中所述的修饰为插入、缺失或取代至少一个氨基酸残基；以及ii)第二经修饰的生长激素的生长激素受体结合区，其中所述的修饰为插入、缺失或取代至少一个氨基酸残基，其特征在于所述结合区是以串联方式融合，并且所述修饰发生于至少一个生长激素的位点2，其中所述多肽是拮抗剂。2.如权利要求l所述的多肽，其中所述第一和第二结合区还在生长激素的位点1被^务饰。3.如权利要求1所述的多肽，其中所述第一和第二结合区在生长激素的位点2被修饰。4.如权利要求1所述的多肽，其中所述的修饰同时发生于生长激素的位点1和位点2。5.如权利要求2或4所述的多肽，其中所述的修饰选自对图12所示的生长激素氨基酸序列用丙氨酸或天门冬氨酸取代组氨酸18，用天门冬酰胺取代组氨酸21,用丙氨酸取代谷酰胺22,用丙氨酸^f又代苯丙氨酸25,用丙氨酸取代天门冬氨酸26，用丙氨酸取代谷酰胺29，用丙氨酸取代谷氨酸167,用丝氨酸取代天门冬氨酸171,用丝氨酸或丙氨酸取代赖氨酸172和用酪氨酸取代异亮氨酸179。6.如权利要求5所述的多肽，其中所述的修饰由如下氨基酸取代组成对图12所示的序列用天门冬氨酸取代组氨酸18,用天门冬酰胺取代组氨酸21，用天门冬酰胺取代精氨酸167,用精氨酸取代天门冬氨酸171，用丝氨酸取代谷氨酸174和用苏氨酸取代异亮氨酸179。7.如权利要求5所述的多肽，其中所述的修饰由如下氨基酸取代组成对图12所示的序列用丙氨酸取代组氨酸18，用丙氨酸取代谷胺酰22,用丙氨酸取代苯丙氨酸25，用丙氨酸取代天门冬氨酸26，用丙氨酸取代谷氨酰29，用丙氨酸取代谷氨酸65，用丙氨酸取代赖氨酸168和用丙氨酸取代谷氨酸174。8.如权利要求1所述的多肽，其中所述4立点2》务饰是对如图12所示序列的氨基酸残基甘氨酸120进行修饰。9.如权利要求8所述的多肽，其中所述的位点2修饰是用选自下列的氨基酸取代甘氨酸精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸。10.如权利要求9所述的多肽，其中所述位点2取代是用精氨酸、赖氨酸或丙氨酸取代甘氨酸120。11.如权利要求1所述的多肽，其中所述第一经修饰的生长激素结合区通过一连接子与所述第二经修饰的生长激素受体结合区连接。12.如权利要求11所述的多肽，其中所述连接子是具有5到30个氨基酸残基的多肽。13.如权利要求12所述的多肽，其中所述连接子是包含10到20个氨基酸残基的多肽。14.如权利要求12或13所述的多肽，其中所述连接子含有至少一个GlyGlyGlyGlySer肽拷贝。15.如;K利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含多个经^^饰的生长激素的生长激素受体结合区。16.如权利要求15所述的多肽，其中所述多肽包含2、3、4、5、6、7、8、9、或至少10个位点2经修饰的生长激素的生长激素受体结合区。17.如权利要求15所述的多肽，其中所述多肽包含2个位点2经修饰的生长激素的生长激素受体结合区。18.编码如权利要求1-17中任意一项所述的多肽的核酸分子。19.含有如权利要求18所述的核酸分子的载体。20.如权利要求19所述的载体，其中所述载体为适于重组表达的表达载体。21.如权利要求1-17中任一项所述的多肽在制备治疗下列疾病的药物中的应用巨人症；肢端肥大症；癌症，肾胚细胞肿瘤，成骨肉瘤，乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，曱状腺癌；糖尿病引起的视网膜病，糖尿病引起的肾病，糖尿病并发症。22.如^L利要求21所述的应用，其用于治疗月支端月巴大症。23.含有权利要求1-17中任一项所述多肽的药物组合物。24.经如权利要求18所述核酸或权利要求19或20所述载体转化或转染的细胞。25.制备如权利要求1-17中任一项所述的多肽的方法，该方法包括i)提供如权利要求24所述的细胞；ii)在有利于所述多肽产生的条件下培养所述细月包；和任选地iii)从所述细胞或细胞培养基中分离所述多肽。26.如权利要求25所述的方法，其中所述多肽携带有方便从所述细胞纯化该多肽的分泌信号。27.如权利要求25或26所述的方法，其中所述多肽携带有方便从所述细胞或细胞培养基中纯化该多肽的亲和标记。全文摘要本发明涉及嵌合多肽，所述的多肽含有与生长激素受体的受体结合区连接的经修饰的生长激素结合区。本发明还涉及所述修饰的生长激素结合区的串连物/低聚物。文档编号A61P43/00GK101638437SQ20091016402公开日2010年2月3日申请日期2002年12月6日优先权日2001年12月14日发明者乔恩·塞耶斯,彼得·阿蒂米克,理查德·罗斯申请人:埃斯特瑞恩有限公司