专利名称：：一种重组石斑鱼生长激素基因及相应多肽的表达系统、生产方法与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组石斑鱼生长激素基因及相应多肽的表达系统、生产方法与应用。
背景技术：
：生长激素(growthhormone,GH)是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种单一肽链的蛋白激素，它是一种具有广泛生理功能的生长调节素。鱼类生长激素(fishgrowthhormone,fGH)是鱼类脑垂体合成和分泌的一种分子量在22kD左右的蛋白多肽，对鱼类的生长和发育有重要作用。GH的促生长作用主要是通过其与肝脏中生长激素受体(GHR)结合后合成分泌胰岛素样生长因子I(IGF-I)而产生。因此肝脏中IGF-I及GHR的mRNA表达量一定程度上反映了鱼类的生长状况和营养状况。石斑鱼中已发现两种形式的GHR，分别命名为GHR1和GHR2，但是在生长调节方面这两种GHR的功能差异还有待研究。—部分鱼类GH基因已经得到克隆并在原核或者真核表达系统中成功表达。这些重组的生长激素表现出了与天然生长激素相同的生物活性，通过投喂或者注射的方法对鱼类进行处理后能明显促进鱼类的生长。石斑鱼是海洋珊瑚礁鱼类，属鯧科(Serranidae)石斑鱼属(Epin印helus)，有30多种，具有较高的经济价值。其生长激素基因已经得到了克隆，其氨基酸序列为重组表达该基因提供了基础。酵母胞内表达具有表达量高安全无毒性等特点，利用它进行石斑鱼生长激素的表达将有较好的应用前景。
发明内容本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种重组石斑鱼生长激素基因。本发明另一目的在于提供一种由上述重组石斑鱼生长激素基因编码得到的重组石斑鱼生长激素。本发明还有一个目的在于提供含有上述重组石斑鱼生长激素基因的克隆载体。本发明还有一个目的在于提供含有上述重组石斑鱼生长激素基因的表达载体。本发明还有一个目的在于提供上述表达载体转化的重组工程菌株。本发明还有一个目的是提供上述重组石斑鱼生长激素的生产方法。本发明还有一个目的是提供上述重组石斑鱼生长激素在制备海水鱼类使用的生长和繁殖调控剂中的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现本发明以已经公布的石斑鱼生长激素氨基酸序列为依据，根据酵母表达的密码子偏好性设计了编码该氨基酸序列的基因片段，如SEQIDN0:1所示。该片段是通过设计一系列寡聚核苷酸引物以搭桥法PCR的方法合成而得，所述引物序列如SEQIDN0:2SEQIDNO:11所示。将本发明重组石斑鱼生长激素基因与克隆载体连接，构建了含有该基因片段的克隆载体和相应的重组菌株。其中，克隆载体优选大肠杆菌pGEMT-gGH，相应的重组菌株即为将大肠杆菌pGEMT-gGH转入大肠杆菌E.coli.DH5a中所形成的大肠杆菌重组株pGEMT-gGH/DH5a。本发明构建了重组石斑鱼生长激素基因的酵母表达载体。该载体的构建方法为本领域的常用方法，即以克隆载体pGEMT-gGH为模板，通过PCR扩增重组石斑鱼生长激素基因后，进行酶切和纯化，与表达载体pPICZaA的相应酶切位点(EcoRI和Xhol)进行连接，得到酵母表达载体pPICZaA-gGH。本发明还构建了含有多拷贝酵母表达载体pPICZaA-gGH的重组工程菌株。该菌株是通过电击转化的方法将表达载体pPICZaA-gGH转入大肠杆菌E.coli.DH5a中所形成的大肠杆菌重组株pPICZaA-gGH/DH5a，或者将表达载体pPICZaA-gGH转入毕赤酵母X33中所形成的重组菌株PPICZaA-gGH/X33，通过高浓度抗生素培养基筛选得到。上述构建酵母表达载体的方法中，所述高浓度抗生素优选1000ug/mlZeocin。利用所述重组菌株pPICZaA-gGH/X33生产重组石斑鱼生长激素的方法，包括如下步骤(1)菌种的培养发酵将重组菌株接种到含抗生素zeocin的YPG培养基中，于28°C、250rpm条件下培养至0D600为2.0;(2)菌种的诱导表达收集菌液，重悬于以甲醇为碳源的培养基YPM中诱导表达，每24小时补充甲醇至浓度为0.5%，连续诱导5天；(3)将表达产物分离纯化，得到重组石斑鱼生长激素。上述重组石斑鱼生长激素可以直接用于制备适合海水鱼尤其是石斑鱼属使用的生长或繁殖调控剂，也可以通过适当的赋形剂、保护剂按一定比例形成组合物来应用。优选的方法是按重组石斑鱼生长激素基础饵料的湿重比为i:ioo的比例充分混合后自然风干，-201:保存。将重组石斑鱼生长激素用于生长和繁殖调控剂时，可以明显促进石斑鱼苗的生长和肝脏中IGF-I和GHR2的mRNA表达，对鱼体水分、脂肪和蛋白的含量则无显著影响。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明提供的重组石斑鱼生长激素基因通过与适当的载体连接后可在相应的微生物菌株中高效表达，分离纯化后可得高纯度的重组石斑鱼生长激素，而且具有表达水平高，容易纯化的有点。通过本发明，可以大量方便地生产重组石斑鱼生长激素，降低了生产成本，这种来源稳定、成本低廉的重组石斑鱼生长激素可进一步促进石斑鱼的生长，可广泛应用于水产养殖业。图1为搭桥法PCR人工合成石斑鱼生长激素基因及其克隆载体和表达载体构建过程示意图；图2为构建酵母表达载体时以pGEMT-gGH为模板扩增gGH的电泳图，其中M为分子量标准；1和2为PCR扩增产物；N为阴性对照；图3为酵母表达载体pPICZaA-gGH的PCR鉴定电泳图，其中M为分子量标准；1和2为PCR扩增产物；N为阴性对照；图4为酵母表达载体pPICZaA-gGH的双酶切鉴定电泳图，其中Ml和M2为分子量标准；1禾P3为未酶切的载体pPICZaA-gGH;2和4为对应的双酶切产物；图5为重组酵母诱导表达5天后胞内蛋白的SDS-PAGE图谱，其中M为蛋白分子量标准；N为转化pPICZaA的阴性对照；1-7为不同转化pPICZaA-gGH的单克隆。箭头所指为目的条带所在位置；图6为用黑鲷GH抗体做为一抗的westernblot图谱，其中M为蛋白分子量标准；N为转化pPICZaA的阴性对照；1-7为不同转化pPICZaA-gGH的单克隆。箭头所指为目的条带所在位置；图7为用含重组酵母的饵料投喂石斑鱼苗的生长曲线图。其中Hgroup为投喂含1%重组gGH佴料的实验组，Lgroup为投喂0.1%重组gGH佴料的实验组，control为投喂1%空载体重组酵母的对照组。*表示p<0.05;**表示p<0.01;图8为投喂含重组酵母的佴料后石斑鱼肝脏IGF-I、GHR1和GHR2mRNA相对表达的定量PCR结果。其中Hgroup为投喂含1%重组gGH饵料的实验组，Lgroup为投喂0.1%重组gGH佴料的实验组，control为投喂1%空载体重组酵母的对照组。**表示p<0.01;具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1斜带石斑鱼生长激素成熟肽基因的人工合成根据已发表的斜带石斑鱼生长激素成熟肽的氨基酸序列和酵母表达的密码子偏好性，设计搭桥法PCR的引物5对，每条引物的长度约为75bp，引物之间存在22bp的重叠区(见图l)。引物的序列从左至右为IDN0:2SEQIDNO:11，依次命名为P1P10。合成过程包括3轮PCR反应。在第一轮反应将PI和P2、P3和P4、P5和P6、P7和P8、P9和P10分别两两混合，按照PCR反应体系配成lOOul。反应条件为(l)94t:预变性5分钟;(2)94。C变性45秒，53。C退火45秒，72。C延伸45秒，共30循环;(3)72。C延伸5分钟。第二轮反应以(P5+P6)产物为核心模板，(P3+P4)、(P7+P8)为两头引物，各取33ul，补加1U的DNA聚合酶，反应条件同上。第三轮反应以P3P8的产物为核心模板，(Pl+P2)、(P9+P10)的产物为两侧引物，各取33ul混合，补加1U的DNA聚合酶，PCR反应条件同上。得到100ulPCR反应产物。实施例2克隆载体pGEMT-gGH的构建及含有该载体的大肠杆菌转化子pGEMT-gGH/DH5a的获得参照试剂盒pGEMTEasyVectorSystems的操作说明，将实施例1所得的PCR产物与克隆载体按比例混合连接，转化E.coli.DH5a。提取阳性克隆的质粒，用载体的通用引物进行DNA序列测定。由DNA序列翻译成的氨基酸序列与已公布的斜带石斑鱼生长激素成熟肽氨基酸序列完全一致，表明克隆载体构建成功。实施例3表达载体pPICZaA-gGH的构建及含有该载体的大肠杆菌转化子pPICZaA-gGH/DH5a的获得根据合成的斜带石斑鱼生长激素成熟肽基因序列及表达载体pPICZaA多克隆位点的序列设计一对引物目标基因的PCR扩增引物。上游引物序列如SEQIDNO:12所示；下游引物序列如SEQIDN0:13所示，同时引入终止子(TCA)。以构建的pGEMT-gGH载体为模板，用上述引物对斜带石斑鱼生长激素成熟肽基因进行PCR扩增，扩增出来的片段约为580bp，与预期PCR产物大小一致(见图2)。将回收纯化的基因片段用EcoRI和XhoI双酶切后与同样双酶切的线性载体pPICZaA连接，转化E.coli.DH5a。提取阳性克隆的质粒，用上述引物进行PCR筛选，可扩增出一条与预期大小(约580bp)相符的特征片段(见图4)。用EcoRI和Xhol双酶切检测重组质粒，酶切产物包括与PCR产物大小(约为580bp)—致的片段，以及与线性载体pPICZaA大小(3.3kb)—致的片段(见图3)。表明gGH基因已插入表达载体pPICZaA中。对重组质粒进行双向测序，其序列与预期完全一致，没有出现碱基突变，且读码框正确。实施例4重组毕赤酵母表达菌株pPICZaA-gGH/X33的构建取20ug表达载体pPICZaA-gGH用Sacl进行酶切，酶切完全后用胶回收试剂盒进行纯化，溶解于15ul双蒸水中。取80ul毕赤酵母X33感受态细胞，与酶切好的载体在冰上混合均匀，静置5分钟。将混合物转入电击杯，2000V电压电击转化。电击结束后迅速加入lml1Msorbital，30。C静置2小时后涂布在YPDS平板(1000ug/mlZeocin)。30。C培养3天后长出具有抗性的酵母单克隆pPICZaA-gGH/X33。实施例5重组酵母的甲醇利用型鉴定将单克隆对应点在MDH和匪H平板上，先点MDH，后点匪H。在两种平板上生长均良好的克隆为甲醇利用快型，只在MDH平板上生长良好的克隆为甲醇利用慢速型。结果表明转化子均为甲醇利用快速型。实施例6石斑鱼生长激素在毕赤酵母中的诱导表达及高表达转化子的筛选挑取7个生长良好的目标基因酵母转化子和1个阴性对照转化子(pPICZaA/X33)接种先将菌种到含抗生素Zeocin(500ug/ml)的BMGY培养基中，28°C，250转/分钟培养至0D600为2.0。离心收集细胞，重悬于含以甲醇为碳源的培养基B匪Y诱导表达。每24小时补充甲醇至终浓度为0.5%，连续诱导5天。离心收集细胞，用酸处理的玻璃珠在冰上破碎细胞，离心后取上清进行SDS-PAGE和westernblot分析。Westernblot所用一抗为兔抗黑鲷GH多克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶标羊抗兔IgG。同时用BCA法对上清进行总蛋白的浓度测定。SDS-PAGE结果(见图5)显示7个目标基因转化子均出现了一条大约22kDa的条带，与预期相符合，而阴性对照没有出现。Westernblot结果(见图6)也与SDS-PAGE结果一致。通过软件对SDS-PAGE进行扫描分析，得出6号转化子的外源蛋白表达量最高，约占胞内可溶性总蛋白的8.4%。结合总蛋白含量的检测结果，重组蛋白表达量约为850mg/1。实施例7饵料中含重组斜带石斑鱼生长激素的添加离心收集诱导表达5天的重组石斑鱼生长激素酵母，按湿重1%和0.1%的比例分别与基础饵料充分混合。对照饵料混合1%的空载体重组酵母。饵料自然风干，-2(TC冻存。实施例8含重组斜带石斑鱼生长激素的饵料对石斑鱼苗的促生长作用促生长实验在广东省大亚湾水产试验中心进行，时间为2008年七月初至九月中旬。驯养期间，实验鱼按每组35尾分组分3组分别驯养于容积为140L的桶中，自然光周6期，24h流动海水并充气。海水温度28-3(TC，盐度26-30%。。每天于8:30和17:00用基础饵料投喂两次，喂饱为止，驯养时间为10天。驯养之后用不同的饵料分别对实验鱼进行投喂，投喂时间和方法和驯养时一致，投喂时间为期8周，每两周测量实验鱼的体重一次。实验结果表明(见图7)，用含1%重组石斑鱼生长激素酵母的饵料投喂鱼苗(Hgroup)有明显的促生长效果。与对照组(control)相比，6周后体重出现显著性差异(p<0.05)，8周后差异极显著(p〈0.01)，此时Hgroup增重率比control高36.6%。含0.1%重组石斑鱼生长激素酵母的饵料(Lgroup)与control相比没有明显的促生长效果。实施例9含重组斜带石斑鱼生长激素的饵料对石斑鱼苗水分，脂肪和蛋白的含量的影响经8周投喂后，每实验组随机称取3尾鱼进行化学成分分析。将鱼处死后将其烘干，称重后计算其水分含量。将鱼干粉碎，称取少量用石油醚在索式抽提器中抽提总脂肪，进行总脂肪含量的测定；另称少量用硫酸消化后用凯氏定氮仪进行总蛋白的测定。测定结果(见表l)显示这三种成分在实验组和对照组之间没有显著性差异，表明投喂含重组斜带石斑鱼生长激素的饵料不改变石斑鱼的化学成分。表2投喂含重组酵母的饵料后石斑鱼苗身体水分，脂肪和蛋白的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例10含重组gGH酵母的佴料对石斑鱼苗肝脏IGF-I，GHR1及GHR2mRNA表达水平的影响经8周投喂后，每实验组取8尾鱼的肝脏样品，迅速放入液氮保存。提取肝脏总RNA，反转录成cDNA。以18S为内参做定量PCR检测IGF-I，GHR1及GHR2的mRNA表达水平。18S上游引物序列如SEQIDNO:14所示，下游引物序列如SEQIDNO:15所示；IGF-I上游引物序列如SEQIDN0:16所示，下游引物序列如SEQIDNO:17所示；GHR1上游引物序列如SEQIDNO:18所示，下游引物序列如SEQIDN0:19所示；GHR2上游引物序列如SEQIDNO:20所示，下游引物序列如SEQIDNO:21所示。反应在Rochelightcycle480定量PCR检测系统中进行，反应体系为10ul，反应条件为(l)94t:预变性3分钟；(2)94t:变性20秒，55。C退火20秒，72。C延伸30秒，84。C收集荧光1秒，共45循环。结果表明，用含1%重组gGH酵母的饵料投喂鱼苗能明显提高其肝脏中IGF-I和GHR2的表达，而GHR1表达量无显著性差异；用含0.1%重组gGH酵母的佴料投喂则对这三个生长相关基因的表达量均无显著影响。定量PCR的结果与促生长的效果表现出一致性，说明IGF-I和GHR2在外源gGH对石斑鱼的促生长效果中发挥重要作用(图8)。—种重组石斑鱼生长激素基因及相应多肽的表达系统、生产方法与应用序列表SEQUENCELISTING〈110〉中山大学〈120〉一种重组石斑鱼生长激素基因及相应多肽的表达系统、生产方法与应用〈130〉〈160>21〈170>PatentInversionl3.2〈210>1〈211>564〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1ctgacggtcaaagattgttctccatcgctgtttctegagttcaacacttg60cacttgttggctcaaagattgttctccgacttcgagtccactttgcaaactgaggagc皿120acaagatcttcttgcaagacttctgteactctgactecatcatctcccca180atcgac^gcaagatcctccgttttgaagttgttgtccatctcctecaga240ttggttgagtcctgggagttcccatctegatccttgtccggtggttctgctcc皿ga皿c300caaatttctccaaagttgtctgagttg皿gactggtetcttgttgttcatcag3gcteac360c皿gacggtgctgagttgttcccagactcctccgctttgcaattggctccatecggteac420tecteccaatctttgggtgctgacgagtctcttecgagttgttggcttgt■ttc皿g皿ggggttg卿cttecttgactgttgcteagtgtegattgtct540ccagaggcteactgteccttgteg564〈210〉2〈211〉75〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉2ctgacggtcaaagattgttctccatcgctgtttctegagttcaacacttg60cacttgttgg75〈210〉3〈211〉74〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉3gaattgtctttgctcctcagtttgcaaagtggactcg皿gtcggag^caatctttgagc60c皿c皿gtgc皿gt74〈210〉4〈211〉75〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>4ctgaggagc3朋gac朋ttg朋csiag3tcttcttgc朋gacttctgteactctgactecs60tcatctccccaatcg75〈210>5〈211>75〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>5ctgteggag3tggac朋c朋cttc朋朋cggagg;atctttgagtctcgtgcttgtcgatt60gggg卿tg3tgteg75〈210>6〈211>75<212>DNA〈213〉人工序列〈400>6ttgttgtccatctcctacagattggttgagtcctgggagttcccatctagatccttgtcc60ggtggttctgctcca75〈210>7〈211>75〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>7tc朋c朋c朋gatecc3gtcttc朋ctcagac朋ctttgg3ga朋tttggtttcttggag60C3g朋cc3ccggaca75〈210>8<211>75〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>8gactggtetcttgttgttcatcagagcteaccaagacggtgctgagttgttcccagactc60ctccgctttgcaatt75〈210>9〈211>75〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>9tcttctca朋gactcgtcagcacccaaagattggtagtegtteccatetggagcc朋ttg60caaagcggaggagtc75〈210>10〈211〉75〈212>DNA<213>人工序列〈400>10ctgacgagtctttgagaagaacttacgagttgttggcttgtttcaagaaggac3tgc3ca60滩gttg3gacttact75〈210>11<211>70〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉11ctac朋ggtecagttagcctctgg3gac朋tctecacttegcaacagtca3gteagtctc60aaccttgtgc70〈210>12〈211〉37〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>12cggcg朋ttc朋t朋tgtctC朋CC朋tC3ctgacgg37〈210〉13〈211〉28〈212>DNA<213>人工序列〈400>13gcggctcgagtcacaaggtacagttagc28〈210〉14〈211>23<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉14cctgagaaacggctaccacatcc23〈210>15<211>26〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉15agc朋ctttegtatacgctettggag26<210>16〈211>20〈213〉人工序列〈400>16gacattgcccgcatctcatc<210>17〈211〉22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>17aaaagcctctctctccacacac〈210〉18〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>18gcgactccatcttcattca〈210>19〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列<400>19gcatcctcagcatccacc〈210>20〈211>17〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>20gacgctgctgaatgtga〈210>21〈211>18〈212>DNA<213>人工序列〈400〉21acccgaacctcgtgaatg1权利要求一种重组石斑鱼生长激素基因，其特征在于该基因的序列如SEQIDNO1所示。2.—种重组石斑鱼生长激素，其特征在于该激素是由权利要求1所述的重组石斑鱼生长激素基因编码得到的。3.—种克隆载体，其特征在于该克隆载体含有权利要求1所述的重组石斑鱼生长激素基因。4.根据权利要求3所述的克隆载体，其特征在于所述克隆载体为大肠杆菌克隆载体pGEMT-gGH。5.—种重组工程菌株，其特征在于该菌株是将权利要求3或4所述的克隆载体转入大肠杆菌E.coli.DH5a中所形成的大肠杆菌重组株。6.根据权利要求5所述的重组工程菌株，其特征在于该菌株是将权利要求3所述的克隆载体pGEMT-gGH转入大肠杆菌E.coli.DH5a中所形成的大肠杆菌重组株pGEMT-gGH/DH5a。7.—种酵母胞内表达载体pPICZaA-gGH，其特征在于所述表达载体含有权利要求1所述的重组石斑鱼生长激素基因。8.—种重组大肠杆菌菌株，其特征在于该菌株是将权利要求7所述的酵母胞内表达载体pPICZaA-gGH转入大肠杆菌E.coli.DH5a中所形成的大肠杆菌重组株pPICZaA_gGH/DH5a。9.一种重组毕赤酵母菌株，其特征在于该菌株是将权利要求7所述的酵母胞内表达载体pPICZaA-gGH转入毕赤酵母X33中所形成的重组菌株pPICZaA_gGH/X33。10.权利要求2所述的重组石斑鱼生长激素在制备石斑鱼类使用的生长或繁殖调控制剂中的应用。全文摘要本发明公开了一种重组石斑鱼生长激素基因，该基因序列如SEQIDNO1所示。本发明基因是以石斑鱼生长激素基因序列为基础设计引物，通过引物SEQIDNO2~SEQIDNO11经PCR扩增得到的。本发明还构建了含有该重组石斑鱼生长激素基因的表达载体和重组基因工程菌株。本发明还公开了利用重组基因工程菌株生产重组石斑鱼生长激素基因的方法及其应用。利用本发明可以批量扩增重组石斑鱼生长激素基因，降低了成本且基因来源稳定；本发明重组石斑鱼生长激素基因用作生长或繁殖调控剂，可明显促进石斑鱼的生长，避免对鱼体本身造成不良影响。文档编号C12N15/81GK101748131SQ200910193720公开日2010年6月23日申请日期2009年11月6日优先权日2009年11月6日发明者李文笙,李阳源,林浩然,龙少军申请人:中山大学