专利名称：单链核酸分子间错配的判断方法
技术领域：
本发明涉及判断作为样品的单链核酸分子与作为基准的单链核酸分子之间是否存在序列错配方法。由于即使序列中只存在一个碱基的错配也可以正确判断，所以这种方法可以用于DNA诊断。
背景技术：
杂交的方法被广泛应用于特异地检测具有某种特定碱基序列的核酸分子。这种方法被用于特定细菌或病毒的检测、特定基因的分离等，最近也被用于基因诊断等领域，即通过检测人类基因组DNA中微小的变异，判断个体对疾病的易感性或药物的反应性。对疾病的易感性或药物的反应性的差异，常常是由于基因组DNA中一个碱基差异造成的。在基因诊断中，用作探针的DNA只与完全互补的核酸分子进行杂交，必须设定至少不与会有错配的核酸分子杂交的条件。为了实现这种要求严格的杂交，通常是预先设定完全互补的双链核酸分子和包含错配的双链核酸分子的解链温度(Tm)，再根据此温度调整杂交时的温度和盐浓度。
然而，当检测对象是较短的核酸分子时，通过调整温度固然可以实现在某种程度上保持特异性的杂交，但是当核酸分子较长时，由于完全互补的双链核酸分子和包含错配的双链核酸分子的解链温度(Tm)差别很小，故要在杂交中区别两者是很困难的。
已知以阳离子聚合物为主链，以亲水性高分子作侧链的接枝共聚合物可以使核酸分子稳定化(日本公开专利平成10年-45630号公报、公开专利平成10年-158196号公报)和促进核酸分子间的交换反应(公开专利2001年-78769号公报)，但还不了解采用这种接枝共聚物对于排除含有上述错配的核酸分子的杂交的效果如何。
因此，在基因诊断中，了解某种核酸分子是否不含探针与一个碱基的错配而完全互补，是非常重要的。
本发明正是在以上技术背景的基础上提出的，其目的在于提供一种正确判断单链核酸分子样品与探针之间是否存在序列错配的手段。
发明的公开本发明的发明人为解决上述问题，反复进行了深入的研究，结果发现，在上述接枝共聚物等阳离子高分子化合物存在的条件下，当双链DNA中一条链与互补的单链DNA同时存在的时候，根据其互补单链DNA是否包含错配，DNA之间的置换速度和置换率有很大的差异。根据这一发现，完成了本发明。
本发明为判断单链核酸分子间的错配的方法，是判断样品单链核酸分子与基准单链核酸分子间是否存在序列错配的方法，其特征在于包括(a)在阳离子高分子存在的条件下，使由作为该基准的单链核酸分子与其互补链构成的双链核酸分子，与作为样品的单链核酸分子共存的步骤；(b)测定作为该基准的单链核酸分子的互补链与作为该样品的单链核酸分子的置换速度或置换率的步骤。
另外，本发明为判断单链核酸分子间的错配的方法，是判断样品单链核酸分子与基准单链核酸分子间是否存在序列错配的方法，其特征在于包括(a)使作为该样品的单链核酸分子与作为该基准的单链核酸分子相接触，形成双链核酸分子的步骤；(b)在阳离子高分子存在的条件下，使由(a)形成的双链核酸分子与作为该基准的单链核酸分子的完全互补链同时存在的步骤；(c)测定作为该样品的单链核酸分子与作为该基准的单链核酸分子的完全互补链的置换速度或置换率的步骤。
而且，本发明为判断单链分子间的错配的方法，是判断样品单链核酸分子与基准单链核酸分子间是否存在序列错配的方法，其特征在于包括(a)在阳离子高分子存在的条件下，使作为基准的单链核酸分子的完全互补链以及作为该样品的单链核酸分子与作为该基准的单链核酸分子相接触的步骤；(b)求得两种双链核酸分子，即作为该基准的单链核酸分子与和其完全互补链构成的双链核酸分子，以及作为该基准的单链核酸分子与作为样品的单链核酸分子构成的双链核酸分子的形成比的步骤。
以下是本发明的详细说明。
本发明是利用阳离子高分子，判断样品单链核酸分子与作为基准的单链核酸分子之间是否存在序列错配的方法。
阳离子高分子，对于测定置换速度或置换率，尽管在可能测定的程度上有差异，但都可以应用。例如以下详述的(A)以能够形成阳离子基团的单体构成的聚合物为主链、以亲水性高分子为侧链的接枝共聚物；或(B)由具有类似磷酸胆碱的基团的单体，以及有阳离子基团的阳离子单体聚合而成的聚合物(以下简称PC聚合物)等。
(A)以能够形成阳离子基团的单体构成的聚合物为主链、以亲水性高分子为侧链的接枝共聚物这种接枝共聚物中，能够形成阳离子基团的单体有赖氨酸、精氨酸、组氨酸等氨基酸，氨基葡萄糖等糖类，烯丙胺、乙撑亚胺、二乙基氨基乙基甲基丙烯酸酯、二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯等的合成单体等。另外，由能够形成阳离子基团的单体构成的聚合物有聚赖氨酸、聚烯丙胺等。亲水性高分子则有聚乙二醇等水溶性聚烷撑二醇，葡聚糖、茁霉多糖、直链淀粉、阿拉伯半乳糖胶等水溶性多糖，包括丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸等亲水性氨基酸的水溶性聚氨基酸、用丙烯酰胺及其衍生物作为单体合成的水溶性高分子、用甲基丙烯酸和丙烯酸以及其衍生物(例如，羟乙基甲基丙烯酸酯)为单体合成的水溶性高分子、聚乙烯醇及其衍生物等。更优选的阳离子高分子，有在Bioconjugate Chem.，9，292-299(1998)报道的以下述通式表示的侧链被葡聚糖修饰的α-聚(L-赖氨酸)[以下缩写为α-PLL-g-Dex]和侧链被葡聚糖修饰的ω-聚(L-赖氨酸)[以下缩写为ω-PLL-g-Dex]，以及侧链被葡聚糖修饰的聚丙烯胺[以下缩写为PAA-g-Dex]。
α-PLL-g-Dex ω-PLL-g-Dex
PAA-g-Dex 这些阳离子高分子的分子量、侧链和主链的长度、接枝的程度等并没有特别的限制，可以视具体使用目的而定。此外，这些阳离子高分子的制备，可以根据现有的方法(例如公开专利平成10年-45630号公报)进行。
(B)PC聚合物在这种聚合物中，含有类似磷酸胆碱的基团的单体(以下简称“PC单体”)用以下通式表示。
该通式中，X表示2价有机残基，Y表示1～6个碳原子的亚烷基氧基，Z表示氢原子或R5-O-(C＝O)-(R5表示1～10个碳原子的烷基或1～10个碳原子的羟烷基)。R1表示氢原子或甲基，R2、R3和R4相同或不同，表示氢原子或碳原子数为1～6个的烷基或羟烷基。m表示0或1，n表示1～4的整数。
通式(I)中X表示的2价有机残基，实例有-C6H4-、-C6H10-、-(C＝O)-O-、-O-、-CH2-O-、-(C＝O)NH-、-O-(C＝O)-、-O-(C＝O)-O-、-C6H4-O-、-C6H4-CH2-O-、-C6H4-(C＝O)-O等。
通式(I)中Y表示的1～6个碳原子的亚烷基氧基，实例有甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基和己氧基等。
通式(I)中Z表示氢原子或R5-O-(C＝O)-(R5表示1～10个碳原子的烷基或1～10个碳原子的羟烷基)。
这里，1～10个碳原子的烷基的实例有甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基和癸基等。
另外，1～10个碳原子的羟烷基的实例有羟甲基、2-羟乙基、3-羟丙基、2-羟丙基、4-羟丁基、2-羟丁基、5-羟戊基、2-羟戊基、6-羟己基、2-羟己基、7-羟庚基、2-羟庚基、8-羟辛基、2-羟辛基、9-羟壬基、2-羟壬基、10-羟癸基和2-羟癸基等。
PC单体的具体实例有2-[(甲基)丙烯酰氧基]乙基-2’-(三甲铵基)乙基磷酸酯、3-[(甲基)丙烯酰氧基]丙基-2’-(三甲铵基)乙基磷酸酯、4-[(甲基)丙烯酰氧基]丁基-2’-(三甲铵基)乙基磷酸酯、5-[(甲基)丙烯酰氧基]戊基-2’-(三甲铵基)乙基磷酸酯、6-[(甲基)丙烯酰氧基]-己基-2’-(三甲铵基)乙基磷酸酯、2-[(甲基)丙烯酰氧基]乙基-2’-(三乙铵基)乙基磷酸酯、2-[(甲基)丙烯酰氧基]乙基-2’-(三丙铵基)乙基磷酸酯、2-[(甲基)丙烯酰氧基]乙基-2’-(三丁铵基)乙基磷酸酯、2-[(甲基)丙烯酰氧基]乙基-2’-(三环己铵基)乙基磷酸酯、2-[(甲基)丙烯酰氧基]乙基-2’-(三苯铵)乙基磷酸酯、2-[(甲基)丙烯酰氧基]乙基-2’-(三甲醇铵基)乙基磷酸酯、2-[(甲基)丙烯酰氧基]丙基-2’-(三甲铵基)乙基磷酸酯、2-[(甲基)丙烯酰氧基]丁基-2’-(三甲铵基)乙基磷酸酯、2-[(甲基)丙烯酰氧基]戊基-2’-(三甲铵基)乙基磷酸酯、2-[(甲基)丙烯酰氧基]己基-2’-(三甲铵基)-乙基磷酸酯、2-(乙烯氧基)乙基-2’-(三甲铵基)-乙基磷酸酯、2-(烯丙氧基)乙基-2’-(三甲铵基)-乙基磷酸酯、2-(对乙烯基苄氧基)乙基-2’-(三甲铵基)-乙基磷酸酯、2-(对乙烯基苯甲酰氧基)乙基-2’-(三甲铵基)-乙基磷酸酯、2-(苯乙烯氧基)乙基-2’-(三甲铵基)-乙基磷酸酯、2-(对乙烯基苄基)乙基-2’-(三甲铵基)-乙基磷酸酯、2-(乙烯基氧羰基)乙基-2’-(三甲铵基)-乙基磷酸酯、2-(烯丙基氧羰基)乙基-2’-(三甲铵基)-乙基磷酸酯、2-(丙烯酰胺基)乙基-2’-(三甲铵基)-乙基磷酸酯、2-(乙烯基羰基胺基)乙基-2’-(三甲铵基)-乙基磷酸酯、(2’-三甲铵基乙基磷酰乙基)富马酸乙酯、(2’-三甲铵基乙基磷酰乙基)富马酸丁酯、(2’-三甲铵基乙基磷酰乙基)富马酸羟乙酯、(2’-三甲铵基乙基磷酰乙基)马来酸乙酯、(2’-三甲铵基乙基磷酰乙基)马来酸丁酯、(2’-三甲铵基乙基磷酰乙基)马来酸羟乙酯等。
其中2-[(甲基)丙烯酰氧基]乙基-2’-(三甲铵基)-乙基磷酸酯优选，而2-[(甲基丙烯酰氧基)乙基-2’-(三甲铵基)乙基磷酸酯[即2-(甲基丙烯酰氧基)乙基磷酸胆碱，以下缩写为MPC]从可获得性方面更为优选。
PC单体可以根据公知的方法(例如公开专利昭和54年-63025号公报、公开专利昭和58年-154591号公报)制备。
作为本发明中所应用的具有阳离子基团的阳离子单体，列举具有伯氨基的单体、具有仲氨基的单体、具有叔氨基的单体，或具有季铵基的单体。作为上述具有伯氨基的单体，具体有烯丙胺(盐酸盐)、氨基乙基(甲基)丙烯酸酯(盐酸盐)、2-甲基烯丙胺、4-氨基苯乙烯等。另外，作为具有仲氨基、叔氨基或季铵基的单体，具体有(甲基)丙烯酰胺、N-[3-(二甲胺基)丙基]甲基丙烯酰胺(盐酸盐)、N-[3-(二甲胺基)丙基]丙烯酰胺(盐酸盐)、2-(二甲胺基)乙基甲基丙烯酸酯(盐酸盐)、2-(二甲胺基)乙基丙烯酸酯(盐酸盐)、[3-(异丁烯酰氧基氨基)丙基]三甲基氯化铵、[3-(丙烯酰氧基氨基)丙基]三甲基氯化铵、[2-(异丁烯酰氧基氨基)乙基]三甲基氯化铵、[2-(丙烯酰氧基氨基)乙基]三甲基氯化铵、2-羟基-3-异丁烯氧丙基三甲基氯化铵(以下缩写为“QA”)、2-羟基-3-丙烯酰氧丙基三甲基氯化铵等。
其中，优选把PC单体与阳离子单体加以组合，例如MPC与有伯氨基的氨基乙基丙烯酸酯(盐酸盐)组合，MPC与有季铵基的QA组合。
本发明中所谓的单链核酸分子，主要指单链DNA，但也包括RNA或类似的核酸分子(例如PNA等)。对于作为样品的单链核酸分子的长度没有特别的限制，但优选难以判断一个碱基错配的存在、长度为12个以上的核酸分子。
作为本发明的判断方法，可以用下述第一至第三种方法为例。
(1)第一种方法第一种方法，包含下述步骤(a)和(b)。
步骤(a)中，在阳离子高分子存在的条件下，使作为基准的单链核酸分子与其互补链构成的双链核酸分子，与样品单链核酸分子同时存在。当样品单链核酸分子与基准单链核酸分子之间不存在序列错配时，该基准单链核酸分子的互补链，便会以高速度和高置换率与样品单链核酸分子发生置换。另一方面，当存在错配时，则该互补链则几乎不与样品单链核酸分子发生置换。
采用的阳离子高分子的量没有特别的限制，但是阳离子高分子的阳离子基团与核酸分子磷酸基团的比率以0.1～1000为宜。双链核酸分子与样品核酸分子共存的时间也没有特别的限制，但以1～16分钟为最佳。
与基准单链核酸分子形成双链的单链核酸分子，也可以不是完全的互补链，可以有一个到几个错配。在这种情况下，如果样品单链核酸分子与基准单链核酸分子完全互补，其置换速度和置换率会更高。
步骤(b)中，测定该基准单链核酸分子的互补链与该样品单链核酸分子之间的置换速度或置换率。如上所述，基准单链核酸分子的互补链与样品单链核酸分子发生置换的速度和置换率，在不包含错配的情况下显著高于包含错配时。因此，通过测定这种置换速度或置换率可以判断两条单链核酸分子间是否存在错配。不包含错配的情况下置换速度是有错配时的10～1000倍左右。如果适当设定反应时间和条件，在不包含错配的情况下置换率值通常可以达到40-100％左右，而有一个碱基错配时则为0-10％左右。
为了更正确地判断，优选用与基准单链核酸分子完全互补的单链核酸分子代替样品单链核酸分子进行对照试验。在这种情况下，如果样品单链核酸分子的置换速度和置换率与完全互补链的置换速度和置换率相等，则可以便判断序列中不存在错配。
步骤(b)可以和步骤(a)同时进行，同时进行时从测定置换速度方面优选。
测定置换速度和置换率的方法没有特别限制，可以用酶、荧光物质或发光物质进行测定，特别优选用荧光共振能量移动法(FRET)测定。这种方法是用供体荧光色素(例如荧光异硫氰酸酯)标记基准单链核酸分子，而用受体荧光色素(例如四甲基若丹明)标记它的互补链，在供体荧光色素标记的核酸分子与受体荧光色素标记的核酸分子形成双链的状态下，供体荧光色素虽然不发荧光，但如果受体荧光色素标记的核酸分子与样品单链核酸分子置换，供体荧光色素就会发荧光。因此，通过测定供体荧光色素的荧光强度，就可以间接地测定置换速度和置换率。测定可以在置换反应过程中或结束后用毛细管电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、琼脂糖凝胶电泳(AGE)等电泳方法连续测定，或者，还可以用96孔板、384孔板和1536孔板等的滴定板(タイタ一プレ一ト)同时测定多个。
(2)第二种方法第二种方法包括下述步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)。
步骤(a)是使样品单链核酸分子与该基准单链核酸分子相接触，使其形成双链核酸分子。双链核酸分子的形成可以与通常的杂交方法一样进行。同时，作为基准的单链核酸分子最好固定在载体上。
步骤(b)是在阳离子高分子存在的条件下，使基准单链核酸分子的完全互补链与步骤(a)形成的双链核酸分子放在一起。当样品单链核酸分子与基准单链核酸分子之间存在序列错配时，样品单链核酸分子将以非常高的速度和置换率置换基准核酸分子的完全互补链。另一方面，没有错配时，虽然也会发生置换，但是置换速度和置换率比存在错配时要低。
使用的阳离子高分子的量可以和第一种方法相同。而且使基准单链核酸分子的完全互补链与双链核酸分子共存的时间也可以与第一种方法相同。
步骤(c)是测定样品单链核酸分子与该基准单链核酸分子的完全互补链置换的速度或置换率。如上所述，当包含错配时与没有错配时相比，样品单链核酸分子与该基准单链核酸分子的完全互补链置换的速度和置换率要高得多。因此，通过测定其置换速度或置换率，能够判断两条单链核酸分子之间是否存在错配。包含错配时，通常其置换速度是没有错配时的10～1000倍左右。如果设定合适的反应时间和条件，置换率的值通常在没有错配时为0～10％左右，包含错配时则是40～100％左右。
为了更加准确地判断，也应第一种方法一样，最好用基准单链核酸分子的完全互补链代替样品单链核酸分子进行对照试验。
步骤(c)可以与步骤(b)可以同时进行，同时进行时从测定置换速度方面是优选的。
测定置换率的方法与第一种方法一样，优选采用FERT，但不限于这种方法。
(3)第三种方法第三种方法包括下述步骤(a)和步骤(b)。
步骤(a)是在阳离子高分子存在的条件下，使基准核酸分子的完全互补链和该样品单链核酸分子与该基准单链核酸分子相接触。由此，基准单链核酸分子与其完全互补链形成双链(对照双链)。另外，如果样品单链核酸分子也与基准单链核酸分子存在一定的互补性，也会形成双链(样品双链)。当样品单链核酸分子与基准单链核酸分子之间没有错配时，则对照双链和样品双链的形成量几乎相等；另一方面，如果存在序列错配，则对照双链的形成量比样品双链要多。
双链核酸分子的形成可以与通常的杂交方法一样进行。同时，作为基准的单链核酸分子最好固定在载体上。
使用的阳离子高分子的量可以和第一种方法相同。
步骤(b)是求出由该基准单链核酸分子与其互补链形成的双链核酸分子(对照双链)、与由该基准单链核酸分子和该样品单链核酸分子形成的双链(样品双链)之形成比。如上所述，当序列中没有错配时，对照双链和样品双链的形成量几乎相等，在包含错配时对照双链则比样品双链的形成量多。因此通过求出对照双链与样品双链的形成比，可以判断序列间是否存在错配。对照双链与样品双链的形成比因各种条件不同而有所变动，但如果核酸分子浓度相等，通常在没有错配时基本为1∶1，包含1个碱基错配时为1.5～5∶1左右。
步骤(b)与步骤(a)可以同时进行，同时进行时从测定双链形成速度方面优选。
求得形成比的方法，可以采用与第一种方法相同的FERT，但不限于这种方法。
附图的简单说明
图1是表示完全互补的双链和包含一个碱基改变的双链的解链温度的曲线。
图2是表示双链(F2/T2)与单链(M2，M2misG，M2misA，M2misC)之间的置换率随时间发生的变化的图。
图3是表示当存在α-PLL-g-Dex时，双链(F2/T2)与单链(M2，M2misG)之间的置换率的关系的图。
图4是表示双链与单链的链置换试验概要的图。
图5是表示温度和单链改变状态与双链与单链间的置换率的关系的图。
图6是表示当存在α-PLL-g-Dex时，双链(F2/T2)与单链(M50，M50miss1)之间的置换率的关系的图。
图7是表示双链(F3/T3)与单链(M3，M3miss1)之间的置换率随时间变化的图。
实施发明的最佳方式合成例1PC聚合物1的合成取单体MPC1.1g、2-氨乙基异丁烯酸酯盐酸盐(以下缩写为AEMA)0.6g，引发剂2，2-偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐(和光纯药工业有限公司制，以下缩写为V-50)0.4g，聚合溶剂蒸馏水12.9g装在聚合反应管中，使其均匀溶解。向此溶液中通入氩气10分钟后将管口封闭。将封好的管在60℃进行聚合反应8小时。聚合反应完成后，在室温冷却，开启聚合管，将此溶液装在透析袋(商品名为Spectrum/por.membrans Mw Co.6000～8000，Spectrum Medical industries公司出品)中，使用10倍于聚合反应液体积的蒸馏水进行透析，每天换一次水，连续透析7天，除去未反应之单体和引发剂。将透析后的溶液冷冻干燥，得1.5gPC聚合物1。
将得到的冷冻干燥粉末20mg溶解在1.5mL重水(D2O)中，所得重水溶液用日本电子(有限公司)产JNM-EX270仪器进行1H-NMR分析，求出PC单体与阳离子单体的摩尔比。
再取10mg PC聚合物1溶解在1.0mL Dulbeco氏磷酸缓冲液(以下缩写为DPBS)中，在其中加入溶解在二甲基甲酰胺(以下缩写为DMF)中浓度为1.0mg/mL的琥珀酰亚胺丙酸酯(和光纯药工业有限公司制)溶液，在室温下温育3小时。温育结束后，将此溶液装在透析袋(商品名为Spectrum/por.membrans Mw Co.6000～8000，Spectrum Medicalindustries公司出品)中，使用10倍于聚合反应液体积的蒸馏水进行透析，每天换一次水，连续透析7天。将透析后的溶液冷冻干燥，得到8.5mg丙基化的PC聚合物1。将此丙基化的粉末溶解在含有0.5重量％氯化锂的氯仿∶甲醇＝6∶4(V/V)混合溶剂中，制备成浓度为0.5重量％的聚合物溶液。再将此溶液用0.45μm的滤膜过滤，作为试验溶液。
GPC分析，采用用MIXED-C(两根，Polymer Laboratories公司出品)、洗脱溶剂为含有0.5重量％氯化锂的按氯仿∶甲醇＝6∶4(V/V)配成的溶剂、标准物质聚甲基丙烯酸甲酯(Polymer Laboratories公司出品)，测定用视差折光仪，重量平均分子量(Mw)、数平均分子量(Mn)和分子量分布(Mw/Mn)的测定用东ソ—公司出品的内含积分器的分子量计量程序(SC-8020用GPC程序)，流速1.0M1/分，样品用量为100μL，柱温保持40℃。
根据以上分析，得知聚合物1的摩尔比是65/35(MPC/AEMA)，Mn＝393000，Mw＝515000，Mw/Mn＝1.3。
合成例2PC聚合物2的合成除使用2-羟基-3-异丁烯酰氧基丙基三甲基氯化铵(以下缩写为QA)的50％水溶液0.8g代替合成例1所用的AEMA，V-50用量为0.12g、蒸馏水为6.0g外，均按合成例1同样的方法进行。得到1.4gPC聚合物2。
将所得之冷冻干燥粉末20mg溶解在1.5mL重水(D2O)中，所得重水溶液用日本电子(股份有限公司)产JNM-EX270仪器进行1H-NMR分析，求出PC单体与阳离子单体的摩尔比。
用蒸馏水将得到的共聚合物水溶液稀释成0.5重量％，再将此溶液用0.45μm的滤膜过滤，作为试验溶液。
GPC分析，色谱柱采用G3000PWx1X2根(东ソ—公司出品)，洗脱溶剂用蒸馏水，标准物质为聚乙二醇(Polymer Laboratories公司出品)，测定用视差折光仪，重量平均分子量(Mw)、数平均分子量(Mn)和分子量分布(Mw/Mn)的测定用东ソ—公司出品的内含积分仪的分子量计量程序(SC-8020用GPC程序)，流速1.0mL/分，试样溶液用量为100μL，柱温保持40℃。
根据以上分析，得知聚合物2的摩尔比是70/30(MPC/QA)，Mn＝295000，Mw＝389000，Mw/Mn＝1.3。
实施例1寡聚脱氧核苷酸(ODN)及双链序列的制备由ニップン公司购得表1所列之序列，并用反向色谱纯化。将TE缓冲液中的互补序列等摩尔量混合，90℃加热冷却后得到双链DNA。
表1
关于各ODA，下面加以简单说明。
(1)M2系列F2及T2是完全互补的20个碱基序列，它们的3’末端和5’末端分别用荧光素异硫氰酸酯(FITC)和四甲基若丹明(TAMRA)标记。M2是与T2相同但没有标记的序列。M2misG、M2misA、M2misC是在M2的中央部分有一个碱基发生改变的序列。M2misG2和M2misG3是M2从5’端算起第4个碱基和第一个碱基发生改变的序列。
(2)M1系列F1及T1是完全互补的20个碱基序列，它们的3’末端和5’末端分别用FITC和TAMRA标记。M1是与T1相同但没有标记的序列。M1misA、MlmisT和M1misC是在M1的中央部分有一个碱基发生改变的序列。
(3)M50系列M50是在中央部分具有与T2互补的序列的50个碱基序列。M50mis1是M50的中央部分有一个碱基发生改变的序列。
(4)M3系列F3及T3是完全互补的19个碱基序列，它们的3’末端和5’末端分别用FITC和TAMRA标记。M3是与T3相同但没有标记的序列。M3mis1是在M3的中央部分有一个碱基发生改变的序列。
实施例2解链温度(Tm)的测定分别由F2与M2、M2misG、M2misA和M2misC制备完全互补的双链和包含一个碱基发生改变的双链。在含有150mM NaCl的10mM磷酸钠缓冲液(PBS，pH7.2)中将双链的浓度稀释为0.83μM，用装有Micro Tm测定装置的BECKMANN可视紫外分光光度计测定解链温度。测定温度范围为30℃～110℃，升温速度为1℃/分钟。同时，按载荷比(相对于DNA磷酸基的PLL-g-Dex之氨基量)的2倍加入PLL-g-Dex(α-PLL-g-Dex)，用同法测定。
结果如图1所示。粗线是解链曲线，细线是它的一次微分曲线。没有PLL-g-Dex时在50～70℃，有PLL-g-Dex时在70～90℃观察到双链的解链。各种条件下的解链温度总结在表1中。
表2各双链序列的解链温度
无论PLL-g-Dex存在与否，解链温度都很接近，最大差异不过7℃。而且解链的转移幅度在各序列中也是重复的。总之，这说明在解链温度测定或通常的杂交法中，要严格区分这些序列是很困难的。实施例3完全互补双链与单链间的置换(之一)探讨了一个碱基改变对完全互补双链与单链间的链置换的影响。将由F2与T2制备的双链溶解在PBS中使其浓度为12nM，加入PLL-g-Dex使载荷比为3.3。将此溶液在37℃保温，加入单链M2、M2misG、M2misA和M2misC使各自的浓度为12nM，开始进行链置换反应。通过经TAMRA消光的FITC的荧光(激发波长490nm，荧光波长520nm)恢复检测链置换过程。
结果如图2所示。与完全互补序列的链置换进行得快速，而具有变异的单链的链置换则缓慢。计算出的各链置换速度常数以相对值表示在表3中。
表3
与变异序列的链置换速度只有完全互补链的百分之一左右。而没有PLL-g-Dex时与完全互补序列几乎不发生链置换(图3)。因此可见，通过用PLL-g-Dex加速的链置换，可以高灵敏度地检出变异序列。实施例4完全互补双链与单链间的链置换(之二)以与实施例3相同的条件开始链置换反应，3分钟和5分钟后测定荧光强度，结果见表4所示。
表4 链置换反应3分钟和5分钟后荧光信号强度
由上表可见，通过3分钟和5分钟反应，可以检测出变异序列。实施例5完全互补双链与单链间的链置换(之三)除单链采用M2、M2misG、M2misG2和M2misG3，并应用PLL-g-Dex、PC聚合物1和PC聚合物2作为阳离子高分子以外，其它按与实施例3相同的条件进行链置换实验，测定各种条件下实验开始3分钟后的荧光强度，结果见表5。
从表5可见，不仅PLL-g-Dex，PC聚合物也可以检测出变异序列。而且不仅中央部分一个碱基改变可以检出，末端一个碱基改变也容易检出。
实施例6完全互补双链与单链间的链置换(之四)除下述(1)～(3)点外，按与实施例3相同的条件进行链置换实验，测定各种条件下3分钟后荧光强度。
(1)在25℃、30℃和37℃3个温度下进行实验。
(2)用96孔血清试验板进行置换反应。用96孔荧光板读出装置(Wallac 1420 multilabel counter，PerkinElmer Lifescience公司出品)进行测定。
(3)除进行由F2与T2构成的双链与M2、M2misG、M2misA和M2misC的链置换实验外，还进行由F1与T1构成的双链与M1、M1misA、M1misT和M1misC的链置换实验。
荧光强度的测定结果如图5所示。
实施例7完全互补双链与单链间的链置换(之五)除载荷比为5.0，并采用M50、M50mis1作为单链外，按与实施例3相同的条件进行链置换实验，调查了双链和单链间置换率随时间的变化，结果如图6所示。
实施例8完全互补双链与单链间的链置换(之六)除载荷比为3，采用F3与T3组成的双链，以及用M3和M3miss1作为单链外，按与实施例3相同的条件进行链置换实验，调查了荧光强度随时间的变化，结果如图7所示。
参考例1应用包括退火步骤的杂交过程检测变异加入与F2(12nM)等摩尔量的T2和M2，在90℃加热后冷却(退火)，再测定荧光强度。另外，同样测定M2发生了变异的序列，两者荧光强度的相对值如表6所示。
表6进行包括退火步骤的杂交后荧光信号强度比值
与完全互补序列相比，变异序列最低显示60％以上的荧光强度，可见采用包括退火步骤的通常杂交法难于检测一个碱基的改变。
本说明书包括在作为在申请的优先权基础的日本专利申请2001-253789号说明书和附图中记载的内容。同时，本发明引用的全部出版物、专利和专利申请书都直接作为参考引入在本说明书中。
在产业上应用之可能性本发明提供了一种新方法，利用这种方法可以判断样品单链核酸分子与基准单链核酸分子之间是否存在序列错配。由于这种方法即使只有一个碱基错配，也可以准确判断，所以可以在DNA诊断等中应用。
序列表<110>日本油脂株式会社(NOF CORPORATION)<120>单链核酸分子间错配的判断方法(METHOD FOR DETECTING MISMATCH BETWEEN SINGLE NUCLEICACID MOLECULES)<130>SCT040235-47<150>JP 2001-253789<151>2001-08-24<160>17<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1atggtgagca agggcgagga 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列
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<210>17<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>17atgggttccc gggaaataa 19
权利要求
1.一种判断样品单链核酸分子与基准核酸分子之间是否存在序列错配的方法，其特征在于包括(a)在有阳离子高分子存在的情况下，使由该样品单链核酸分子与其互补链构成的双链核酸分子与该样品单链核酸分子共存的步骤；(b)测定该基准单链核酸分子的互补链与该样品单链核酸分子的置换速度或置换率的步骤。
2.一种判断样品单链核酸分子与基准核酸分子之间是否存在序列错配的方法，其特征在于包括(a)使该样品单链核酸分子与该基准单链核酸分子接触，形成双链核酸分子的步骤；(b)在有阳离子高分子存在的情况下，使(a)步骤形成的双链核酸分子与该基准单链核酸分子的完全互补链共存的步骤；(c)测定该样品单链核酸分子与该基准单链核酸分子的完全互补链的置换速度或置换率的步骤。
3.一种判断样品单链核酸分子与基准核酸分子之间是否存在序列错配的方法，其特征在于包括(a)在有阳离子高分子存在的情况下，使该基准单链核酸分子的完全互补的链和该样品单链核酸分子与该基准单链核酸分子相接触的步骤；(b)求出两种双链核酸分子的形成比的步骤，这两种分子是该基准单链核酸分子和与其完全互补链构成的双链核酸分子，以及该基准单链核酸分子与该样品单链核酸分子构成的双链核酸分子。
4.权利要求1～3任一项所述的判断单链核酸分子间的错配的方法，其特征在于阳离子高分子是以由能够形成阳离子性基团的单体构成的聚合物为主链，以亲水性高分子为侧链的接枝共聚合物。
5.权利要求4所述的判断单链核酸分子间的错配的方法，其特征在于，由能够形成阳离子性基团的单体构成的聚合物，是聚赖氨酸或聚烯丙胺。
6.权利要求4或5所述的判断单链核酸分子间的错配的方法，其特征在于，亲水性高分子是葡聚糖或聚乙二醇。
7.权利要求1～3任一项所述的判断单链核酸分子间的错配的方法，其中阳离子性高分子由下式[I]表示的含有与磷酸胆碱类似基团的单体和含有阳离子性基团的阳离子性单体聚合而成的聚合物 该通式中，X表示2价有机残基，Y表示1～6个碳原子的烷撑氧基团，Z表示氢原子或R5-O-(C＝O)-(R5表示1～10个碳原子的烷基或1～10个碳原子的羟烷基)；R1表示氢原子或甲基，R2、R3和R4相同或不同，表示氢原子或碳原子数为1～6个的烷基或羟烷基；m表示0或1，n表示1～4的整数。
全文摘要
提供了判断样品单链核酸分子与基准单链核酸分子之间是否存在序列错配的方法。这种方法是在有阳离子高分子存在的情况下，使由基准单链核酸分子与其互补链构成的双链核酸分子与样品单链核酸分子共存，然后测定该基准单链核酸分子的互补链与该样品单链核酸分子的置换率，根据该测定值来判断样品单链核酸分子与基准单链核酸分子之间是否存在序列错配。利用这种方法，即使单链核酸分子序列中只有一个碱基错配，也可以准确判断其存在。
文档编号C12Q1/68GK1547616SQ0281660
公开日2004年11月17日 申请日期2002年8月22日 优先权日2001年8月24日
发明者丸山厚 申请人:日本油脂株式会社