含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的dna片段的制作方法

专利名称：含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的dna片段的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的DNA片段，进一步涉及作为含有具有与红球菌属细菌内质粒自主增殖相关的功能的基因的DNA片段，在该基因内至少存在一处使质粒的拷贝数增加的突变点的DNA片段以及含有该DNA片段的多拷贝质粒载体。
背景技术：
属于红球菌属的微生物作为微生物催化剂用于对腈进行水合，生产对应的酰胺类或酸已为人们所知，另外由于表现出非常多样的性质，如生产有关PCB(多氯联(二)苯)等的分解或原油的脱硫的酶，以及生产排水处理中使用的那样的生物表面活性剂等，所以在工业是非常有用的微生物。
另外属于紫红红球菌种(Rhodococcus rhodochrous)的微生物具有极高性能的腈水合活性已为人们所知，作为生物法制造丙烯酰胺的催化剂被用于工业上。
在这种状况下，人们从以前就期待红球菌属的宿主载体系的开发，并已经开发了几个。作为红球菌属细菌的工业上有用的质粒载体，可列举例如，紫红红球菌ATCC4276携带的质粒pRC001、紫红红球菌ATCC14349携带的质粒pRC002、紫红红球菌ATCC14348携带的质粒pRC003以及紫红红球菌IFO 3338携带的质粒pRC004(参照日本专利第2983602号公报)，以及由在大肠杆菌细胞内可复制增殖的质粒DNA区域和含有药剂抗性基因的DNA区域构成的复合质粒载体pK1、pK2、pK3和pK4(参照特开平5-64589号公报)、红串红球菌IFO12320携带的pRC020(参照特开平9-28379号公报)等。已知将有用基因导入以红球菌属细菌作为宿主的质粒载体之后，使该基因表达时，该有用基因的表达量大致与质粒载体的拷贝数成比例。然而，这些质粒在红球菌属细菌的细胞内的拷贝数为2～6左右，用于使外源基因高表达未必充分。
发明的公开因此，通过将有用基因插入多拷贝质粒载体后导入细胞内，人们期待着能获得高的基因扩增效果。
本发明的目的在于提供来自在红球菌属细菌内可自主复制的质粒的、含有与质粒自主增殖有关的基因的DNA片段，以及作为来自在红球菌属细菌内可自主复制的质粒的，含有有关质粒自主增殖基因的DNA片段，在该基因内至少存在一处使质粒拷贝数增加的突变点的DNA片段。
本发明者们通过阐明含有具有与红球菌属细菌内质粒自主增殖相关的功能的基因的DNA区域，获得在该基因内至少存在一处使质粒拷贝数增加的突变点的DNA片段，使得本发明完成。即，本发明涉及一种DNA片段，其含有具有与红球菌属细菌内质粒的自主增殖相关的功能的基因，该基因来源于质粒pRC001、pRC002、pRC003和pRC004，以及作为来自在红球菌属细菌内可自主复制的质粒的，含有与质粒自主增殖有关的基因的DNA片段，在该基因内至少存在一处使质粒拷贝数增加的突变点的DNA片段。
即，本发明如下构成(1)一种DNA片段，其包含具有与红球菌属(Rhodococcus)细菌中质粒自主增殖相关的功能的基因，该基因来源于质粒pRC001、pRC002、pRC003和pRC004。
(2)(1)的DNA片段，大小为1.6kb，在末端含有限制性内切酶SplI和SacI切割位点。
(3)(1)的DNA片段，大小为1.7kb，在末端含有限制性内切酶SmaI和SacI切割位点。
(4)(1)的DNA片段，大小为1.9kb，在两末端含有限制性内切酶SmaI切割位点。
(5)(1)的DNA片段，大小为2.3kb，在两末端含有限制性内切酶SacI切割位点。
(6)(1)的DNA片段，其含有包含在pRC004中的具有与红球菌属(Rhodococcus)细菌中质粒自主增殖相关的功能的基因，由序列1的碱基序列构成。
(7)(1)的DNA片段，其含有包含在pRC004中的具有与红球菌属细菌中质粒自主增殖相关的功能的基因，由序列3的碱基序列构成。
(8)(1)的DNA片段，其含有包含在pRC004中的具有与红球菌属细菌中质粒的自主增殖相关的功能的基因，由序列7的碱基序列构成。
(9)(1)～(8)中的任一个DNA片段，其中至少存在一处可使质粒拷贝数增加的突变点。
(10)(9)的DNA片段，其是由存在一处可使质粒拷贝数增加的突变点的序列2的碱基序列构成的。
(11)(9)的DNA片段，其是由存在一处可使质粒拷贝数增加的突变点的序列4的碱基序列构成的。
(12)(9)的DNA片段，其是由存在一处可使质粒拷贝数增加的突变点的序列9的碱基序列构成的。
(13)拥有(9)～(12)中任一项记载的DNA片段的，可在红球菌属细菌内自主增殖并具有多个拷贝的质粒。以及(14)拥有权利要求11中记载的DNA片段的，可在红球菌属细菌内自主增殖并具有多个拷贝的质粒pLK006。
所谓作为具有与红球菌属细菌中质粒自主增殖相关的功能的基因的DNA片段，在该基因内至少存在一处可使质粒的拷贝数增加的突变点的DNA片段(以下称为多拷贝质粒DNA片段)指的是，作为含有具有与质粒自主增殖相关的功能的基因的DNA片段，是与使用没有突变点的DNA片段制作的质粒载体的拷贝数相比，具有可使利用有突变点的DNA片段制作的质粒载体的拷贝数增加的作用的DNA片段。在本说明书中，称之为拷贝数的术语指的是1个细胞中的质粒分子数(存在的质粒数)，称之为多拷贝数的术语指的是作为含有具有有关质粒的自主增殖功能的基因的DNA片段，与使用没有突变点的DNA片段制作的质粒载体的拷贝数相比具有更多的拷贝数。
本发明的多拷贝质粒DNA片段可以从对在红球菌属细菌内自主增殖的质粒或含有具有与质粒的自主增殖相关的功能的基因的DNA片段进行适当的变异处理的产物中获得。
通常，将在红球菌属细菌内自主增殖的质粒或含有具有与质粒的自主增殖相关的功能的基因的DNA片段使用众所周知的方法插入到含有可成为标记的药剂抗性基因的载体质粒，例如含有卡那霉素抗性基因的pHSG298(宝酒造制造)、含有氯霉素抗性基因的pHSG398(宝酒造制造)、含有四环素抗性基因的pBR322(宝酒造制造)或含有氨苄青霉素抗性基因的pUC18(宝酒造制造)，通过电脉冲法使该载体质粒转化宿主红球菌属细菌，通过众所周知的方法、例如碱SDS方法等从得到的转化体中回收质粒DNA，通过限制性内切酶处理片段的解析等，可以确认目的DNA片段。
所谓适当的变异处理指的是，对象上述那样制作的质粒保持菌照射紫外线、X射线、γ射线等，或用N-甲基-N’-亚硝基胍等诱变剂进行处理。另外也可以利用在生物增殖时发生的自然突变。
或者，对在红球菌属细菌内自主增殖的质粒或含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的DNA片段直接、或做成单链DNA后，用肼、甲酸或亚硝酸进行处理，或通过包括选择适当的引物，在核苷酸类似物或锰离子存在下等进行PCR的诱发错误PCR等众所周知方法向DNA片段直接导入变异也是有效果的。通过这样的方法，由于可以集中将变异导入DNA序列的特定地方，例如可以将变异特异导入到本发明所公布那样的含有具有与质粒自主增殖相关的功能的基因的DNA片段中。另外，合成含有具有与质粒自主增殖相关的功能的基因的DNA片段也是可能的。
通过在利用各种浓度的药剂标记的选择下对拥有上述那样导入了变异的含有药剂标记基团的质粒载体的重组体进行培养，并选择药剂抗性浓度上升的菌株，可以得到质粒拷贝数上升的菌株。这样的菌株，由于拷贝数上升出现基因扩增效果，可以被认为是药剂抗性上升的菌株。从这样的菌株回收质粒可以得到多拷贝质粒DNA片段。
对于在实施了变异处理的在红球菌属细菌内进行自主增殖的质粒或含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的DNA片段的情况，插入含有适当的药剂抗性基因的上述质粒载体后，利用电脉冲转化宿主红球菌属细菌，通过在利用各种浓度的药剂标记的选择下进行培养，选择药剂抗性浓度上升的菌株，可以得到质粒拷贝数上升的菌株。
标记基因使用药剂抗性基因是简便的，而碱性磷酸酶、荧光素酶或lacZ基因等检测也可以使用简便的众所周知的方法。
拷贝数的解析可以根据例如Journal of Bacteriology，152，p.722(1982)记载的方法进行。即通过从细胞中提取染色体DNA和质粒DNA，求双方的分子数的比来进行。更简便的是对拥有无突变点的质粒的重组体和拥有突变点的质粒的重组体都同样进行培养，回收质粒，进行琼脂糖电泳，通过对经溴乙锭等染色后的密度测量分析，也可以比较拷贝数。
序列1给出了确定的来自紫红红球菌IFO3338的质粒pRC004碱基序列的结果。从碱基序列信息可以推定pRC004中有两个开放读码框(ORF)。一个是预料为被序列5所示的921碱基(从序列1碱基序列的第1142号碱基开始到2062号的碱基)编码的ORF(序列6给出了推定的氨基酸序列)，他与参与来自紫红红球菌NCIMB13064的质粒的pKA22和来自偶发分枝杆菌的pAL5000的质粒的复制的RepA蛋白质类似。另一个ORF是预料为被序列7所示的282碱基(从序列1碱基序列的第2052号开始到2333号的碱基)编码的ORF(序列8给出了推定的氨基酸序列)，他与被推定为来自红串红球菌NI86/21的质粒的pFAJ 2600的DNA结合性的质粒复制因子的ORF类似。然而，以上考察是基于基因类似性的结果，当然不能确定它们的功能，实际上为不具有功能的疑似基因(假基因)的可能性也很高。
本发明初次判明pRC004经Sp1I和SacI酶切生成的约1.6kb的DNA片段(序列3)是含有与在红球菌属细菌内有关质粒自主增殖功能的基因的区域。
即，判明在pRC004经SmaI酶切生成的约1.9kb的DNA片段和经SacI酶切生成的约2.3kb的DNA片段中含有与在红球菌属细菌内有关质粒自主增殖功能的基因的区域。对经SmaI酶切生成的约1.9kb的DNA片段用SacI切后生成的约1.7kb的DNA片段进一步研究时，判明在该DNA片段中也含有具有与在红球菌属细菌内有关质粒自主增殖功能的基因的区域。进一步判明，在将该约1.7kb的DNA片段用SplI切后生成的约1.6kb的DNA片段中，也含有具有与在红球菌属细菌内有关质粒自主增殖功能的基因的区域。
对末端含有上述限制性内切酶SplI和SacI切点的约1.6kb的DNA片段中存在的BamHI、Bg1II、SphI、XhoI识别部位分别用相应的限制性内切酶进行酶切后，再用klenow fragment等处理使之平末端化后进行自身连接时，由在红球菌属细菌内质粒自主增殖的功能丧失可以判明该区域实际上存在着可发挥功能的蛋白质性因子。
另外，通过在pRC004的该DNA片段中至少导入一处突变点可以使质粒的拷贝数增加的知识，正是本发明首次公布的内容。
即，通过使用向pRC004插入了含有可以起到标记功能的卡那霉素抗性基因的质粒载体的复合质粒载体，获得卡那霉素抗性提高了的变异体，本发明能够首次获得多拷贝变异质粒。
首次发现通过向这个含有具有与在红球菌属细菌内有关质粒自主增殖功能的基因的区域至少导入一处突变点可以得到多拷贝变异质粒的意义非常大，这就意味着以该发明为基础通过众所周知的方法可以很容易得到多拷贝变异质粒。
作为这样的多拷贝变异质粒的例子，可列举例如，在本发明中得到的质粒pLK006等。pLK006是在含有具有与在红球菌属细菌内有关质粒自主增殖功能的基因的区域中，序列3所示区域内1336号的鸟嘌呤碱基置换为胸腺嘧啶碱基后的变异体(序列4)。这相当于序列1碱基序列的2262号碱基、序列7碱基序列的211号的碱基，序列2和序列9分别表示在序列1和序列7的一个碱基中含有变异的序列。推定的ORF编码的氨基酸序列是序列8的第71位的甘氨酸变异(置换)为丝氨酸的序列(序列10)。
另外，质粒pLK006于2001年6月22日以保藏号FERM BP-8085保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地中央第6)。
而在本发明的DNA片段中也包括在严格条件下与该DNA杂交的，而且含有具有与在红球菌属细菌内有关质粒自主增殖功能的基因的DNA片段，或在严格条件下与该DNA杂交的，而且含有具有与在红球菌属细菌内有关质粒自主增殖功能、且存在至少一处使质粒的拷贝数增加的突变点的基因的DNA片段。这里所谓在严格条件下，指的是形成所谓的特异的杂化体，不形成非特异的杂化体的条件。该条件可列举例如，具有同源性高的DNA之间，例如具有至少60％或其以上、优选在80％或其以上、更优选95％或其以上同源性的DNA之间进行杂交，而同源性比它们低的DNA之间不杂交的条件，或者是在相当于作为通常sorthern杂交清洗条件的60℃、1×SSC、0.1％SSD、优选0.11×SSC、0.1％SDS盐浓度下进行杂交的条件。这样的DNA，例如利用位点特异变异法，通过改变本发明的DNA片段碱基序列可以获得。
附图的简单说明

图1是表示质粒pRC001、pRC002、pRC003和pRC004的限制性内切酶片段谱图。
实施发明的最佳形态以下通过实施例对本发明进行更具体的说明，但下述的实施例并不限定本发明的技术范围。
实施例1
含有具有与pRC004在红球菌属细菌内进行质粒自主增殖相关功能的基因的DNA片段的制备向从紫红红球菌IFO3338提取的质粒pRC004(1μg)中加入5units限制性内切酶SmaI或SacI，于37℃下反应1小时，对质粒DNA进行酶切。将限制性内切酶酶切的质粒溶液进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，分别切出SmaI切的产物中的约650bp、约1.9kb的DNA级分，用SacI切的产物中的约300bp、约2.3kb的DNA片段。
另外，向0.5μg的含有卡那霉素抗性基因的质粒载体pHSG299(宝酒造制造)加入5units限制性内切酶SmaI或SacI，于37℃下反应1小时，对质粒DNA进行酶切。向反应液中加入1/10量的1M-Tris-HCl(pH9.0)，与碱性磷酸酶(1unit)于65℃下反应1小时。将限制性内切酶酶切的质粒载体溶液进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，分别切出2.7kb的DNA片段。
DNA片段切出时，作为大小标志分子使用λ噬菌体DNA的HindIII消化物，算出DNA的大小。使用Gene clean kit(フナコシ(株))，从琼脂糖凝胶中回收DNA，溶解在TE缓冲液(10mMTris-HCl，1mMEDTA，(pH8.0))中。
将含有各个DNA片段的溶液等量混合，加入终浓度达到1unit T4DNA连接酶、1mM ATP、10mM二硫苏糖醇、10mM MgCl2的各成分，于4℃下反应过夜。
将上述反应液加到大肠杆菌JM105株感受态细胞(宝酒造生产)中，于0℃下静置1小时后，于42℃下进行2分钟热处理，加2×YT培养基(0.5％NaCl、1％酵母提取物、1.6％胨)，于37℃下振荡1小时。涂布到含有25μg/ml卡那霉素、1mM IPTG(异丙基-β-吡喃半乳糖苷)、以及0.02％X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)的2×YT琼脂培养基上，于37℃下静置培养过夜。从出现的菌落中选择白色的菌落，在加入50μg/ml卡那霉素的2×YT培养基(3ml)中，于37℃下振荡培养8小时。
通过于15,000rpm下离心分离5分钟，回收菌体，悬浮于0.35ml STET溶液(8％蔗糖、5％TritonX-100，50mM EDTA，10mM Tris-HCl(pH8.0))中。加入溶菌酶液(10mg/ml)25μl，用Vortex搅拌3秒后，浸入到沸腾的水中50秒。通过于15,000ypm下离心分离15分钟，除去沉淀，得到上清。向上清中加入0.5ml的TE饱和酚氯仿(1∶1)液，搅拌后，于15,000rpm下离心分离5分钟，得到上层液。加乙醚0.5ml混合后，通过离心分离除去上层。加入异丙醇0.5ml、2.5M醋酸钠液(pH4.5)50μl，于-80℃下静置30分钟后，于15,000rpm下离心分离10分钟，得到沉淀。用70％乙醇洗净，进行减压干燥，溶解在0.1ml的TE缓冲液中。
使用上述那样制备的质粒溶液，用限制性内切酶SmaI或SacI切，确认目的DNA片段的插入。使用插入了各个DNA片段的质粒，以紫红红球菌ATCC12674作为宿主，利用电脉冲法进行转化。
利用电脉冲法的转化按照以下方法进行。通过离心机收集紫红红球菌ATCC12674菌株的对数增殖期的细胞，用冰冷的灭菌水洗3次，悬浮于灭菌水中。将上述质粒1μl和菌体悬浮液10μl混合，进行冰冷。将DNA和菌体加入到一个小池中，通过基因导入装置Gene Pulser(BIO RAD)用2.0kV、200 OHMS进行电脉冲处理。将电脉冲处理液于冰冷下静置10分钟，于37℃下进行10分钟热激。加MYK培养基(0.5％多胨、0.3％细菌培养用酵母提取物、0.3％细菌培养用麦芽提取物、0.2％K2HPO4、0.2％KH2PO4)500μl，于30℃下静置5小时后，涂布到加入了50mg/l卡那霉素的MYK琼脂培养基上，于30℃下培养3天。
表1给出了使用的质粒和有无获得转化体。使用将pRC004的约1.9kb的SmaI酶切片段和约2.3kb的SacI片段插入到质粒载体pHSG299的质粒时，可以得到卡那霉素抗性的重组体。从得到的重组体提取质粒进行琼脂糖电泳分析时，可以得到与在各个转化中使用的质粒相同的分子量的质粒。
表1

实施例2与实施例1同样操作，向从紫红红球菌IFO3338提取的质粒pRC004(1μg)中加入5units限制性内切酶SmaI或SacI，反应1小时，对质粒DNA进行酶切。将限制性内切酶酶切的质粒溶液进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，切出约1.7kb的DNA片段。
另外，向0.5μg的含有卡那霉素抗性基因的质粒载体pHSG299(宝酒造制造)加入5units限制性内切酶SmaI和SacI，在37℃反应1小时，对质粒DNA进行酶切。向反应液中加入1/10量的1M-Tris-HCl(pH9.0)，与碱性磷酸酶(1unit)于65℃下反应1小时。将限制性内切酶酶切的质粒载体溶液进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，切出2.7kb的DNA片段。
将含有各个DNA片段的溶液等量混合，加入各个成分达到T4DNA连接酶1unit、1mM ATP、10mM二硫苏糖醇、10mM MgCl2，于4℃下反应过夜。
用上述反应液转化大肠杆菌JM105，获得插入了上述约1.7kb的DNA片段的质粒。使用得到的质粒，利用电脉冲法对紫红红球菌ATCC12674进行转化，可以得到卡那霉素抗性的转化体。
实施例3向实施例2得到的质粒中加入5units限制性内切酶SplI和SmaI，于37℃下反应1小时，对质粒DNA进行酶切。通过乙醇沉淀回收酶切的质粒后，添加klenow fragment 5units，进行平末端化，加入各个成分达到1unit T4DNA连接酶、1mM ATP、10mM二硫苏糖醇、10mM MgCl2，于4℃下反应过夜。
使用上述反应液转化大肠杆菌JM105，获得插入了上述约1.6kb的DNA片段的质粒。使用得到的质粒，利用电脉冲法对紫红红球菌ATCC12674进行转化，可以获得卡那霉素抗性的转化体。
实施例4多拷贝质粒DNA片段的获得使用由质粒pRC004和质粒pHSG299构成的复合质粒载体pK4，利用电脉冲法对红球菌sp N775(以保藏号FERM BP-961于1986年1月10日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地中央第6))进行转化，通过对得到的转化体在10ml的MYK培养基中于30℃下培养1天后在净化台内照射紫外线，进行变异处理。将进行了变异处理的培养液涂布在含有50～400μg/ml卡那霉素的MYK琼脂培养基上，于30℃下培养3天。
对存活下来的菌落进行培养，回收质粒。用回收的质粒再转化红球菌sp N775，验证卡那霉素抗性浓度上升。显然可以得到数株卡那霉素浓度提高的重组体。由用得到的重组体之一的pLK006株和不含有突变点的复合载体pK4转化的重组体分别制备染色体和质粒DNA，对质粒的拷贝数进行比较时，发现经变异处理得到的pLK006与pK4相比拷贝数上升了约5倍。
上述微生物中，与本发明人等制作的基因重组体有关的微生物保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。
实施例5突变点的确定使用Pharmacia公司荧光测序仪ALFII确定了实施例3得到的多拷贝变异质粒pLK006的碱基序列。其结果得到了序列4所表示的碱基序列。序列2所示的区域内1336位的鸟嘌呤碱基变异(置换)为胸腺嘧啶碱基。产业上的可利用性通过将有用的基因导入本发明提供的以红球菌属细菌为宿主的多拷贝质粒载体，可以使有用基因的表达量提高。这样一来，有用基因的表达量提高的基因重组体在产业上是非常有用的。
本说明书中引用的所有刊物为其所有内容收入到本说明书的刊物。另外，同行应当容易理解在没有脱离附加的权利要求范围中记载的技术思想和发明的范围的范围内，本发明的种种变形以及变更都是可能的。本发明的意思是指本发明也包括这样的变形以及变更。
序列表<110>三菱丽阳株式会社<120>含有具有有关质粒自主增殖功能的基因的DNA片段<130>PH-1601-PCT<140>
<141>
<150>JP 2001/204628<151>2001-07-05<160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2582<212>DNA<213>紫红红球菌<400>1cgatggcaag ccaccgcgaa gcggtggcgc ggcagaacct cgttttgccc ctgaggaggt 60gacgcgaatg catgaagcat gtcgcacttg cgcgccttgt cctgttatct gtaagatcga 120cccctggtgt acctcgtgca cccaaaatca ggcccggtgg ttcctttgga cccgggcctt 180cgttatttcc acgccagccc gagctccgcc cgctcgtgca agcgtcatgc tcttcgtccg 240tgatcaagac ctccgaacct atggccggcc aaccccctcg ggttgcgtcg gcctgacccg 300
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权利要求
1.一种DNA片段，其包含具有与红球菌属(Rhodococcus)细菌中质粒自主增殖相关的功能的基因，该基因来源于质粒pRC001、pRC002、pRC003和pRC004。
2.权利要求1记载的DNA片段，大小为1.6kb，在末端含有限制性内切酶SplI和SacI切割位点。
3.权利要求1记载的DNA片段，大小为1.7kb，在末端含有限制性内切酶SmaI和SacI切割位点。
4.权利要求1记载的DNA片段，大小为1.9kb，在两末端含有限制性内切酶SmaI切割位点。
5.权利要求1记载的DNA片段，大小为2.3kb，在两末端含有限制性内切酶SacI切割位点。
6.权利要求1记载的DNA片段，其含有包含在pRC004中的具有与红球菌属(Rhodococcus)细菌中质粒自主增殖相关的功能的基因，由序列1的碱基序列构成。
7.权利要求1记载的DNA片段，其含有包含在pRC004中的具有与红球菌属(Rhodococcus)细菌中质粒自主增殖相关的功能的基因，由序列3的碱基序列构成。
8.权利要求1记载的DNA片段，其含有包含在pRC004中的具有与红球菌属(Rhodococcus)细菌中质粒自主增殖相关的功能的基因，由序列7的碱基序列构成。
9.权利要求1～8任一项记载的DNA片段，其中至少存在一处可使质粒拷贝数增加的突变点。
10.权利要求9记载的DNA片段，其是由存在一处可使质粒拷贝数增加的突变点的序列2的碱基序列构成的。
11.权利要求9记载的DNA片段，其是由存在一处可使质粒拷贝数增加的突变点的序列4的碱基序列构成的。
12.权利要求9记载的DNA片段，其是由存在一处可使质粒拷贝数增加的突变点的序列9的碱基序列构成的。
13.拥有权利要求9～12中任一项记载的DNA片段的，可在红球菌属细菌内自主增殖并具有多个拷贝的质粒。
14.拥有权利要求11中记载的DNA片段的，可在红球菌属细菌内自主增殖并具有多个拷贝的质粒pLK006。
全文摘要
本发明提供含有与质粒自主增殖相关的基因的DNA片段，以及作为含有与质粒自主增殖相关的基因的DNA片段，在该基因内至少存在一处可使质粒的拷贝数增加的突变点的DNA片段。含有具有与红球菌属细菌中质粒自主增殖相关的功能的基因的DNA片段，在该基因内至少存在一处可使质粒的拷贝数增加的突变点的DNA片段，以及拥有在该基因内至少存在一处可使质粒的拷贝数增加的突变点的DNA片段的质粒。
文档编号C12N15/09GK1551915SQ0281731
公开日2004年12月1日 申请日期2002年7月3日 优先权日2001年7月5日
发明者水无涉, 汤不二夫, 夫 申请人:三菱丽阳株式会社