专利名称：一种产角蛋白酶的基因工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种产角蛋白酶的基因工程菌及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术：
角蛋白酶(Keratinase)是ー种可以特异性降解角蛋白的酶类，由细菌、放线菌和真菌等多种微生物产生。羽毛作为家禽饲养和屠宰エ业的副产物每年产量巨大，且蛋白质和氨基酸含量丰富，是潜在的优良蛋白质资源。羽毛的合理利用一方面可以减少废弃物对环境的污染，同时可以作为ー种饲科蛋白质应用于畜禽的饲养。在传统利用羽毛过程中主要采用酸碱水解。热降解等方法，前者存在污染环境问题，后者对能源消耗比较大，且可以破坏部分氨基酸，降低了产品的营养价值。其他常见的角蛋白为动物的毛发，如牛毛、羊毛和人发等，这类角蛋白质部分作为商业原料进行加工外，其余多作为废物处理，也造成了环 境的污染和蛋白资源的浪费。角蛋白酶能使角蛋白降解为多肽和氨基酸，既可用于农业肥料的生产，又可作为畜禽的饲料蛋白源；角蛋白酶是皮肤真菌重要的侵袭因子，其在皮肤病治疗方面的研究还有待于进ー步挖掘。另外，角蛋白酶可“消化”导致疯牛病和人类克雅氏症的毒蛋白，从而可应用于医疗和实验仪器的浄化；它还可用于皮革脱毛鞣制，配制润肤露、浴皂、洗发水和脱毛膏等美容品。目前关于角蛋白酶的研究主要集中于生产菌株的筛选以及相关酶性质的研究。然而，在这些角蛋白酶产生菌中只有很少的菌株具有商业开发价值。在异源宿主中表达也存在许多问题需要解决，如表达蛋白以包涵体形式出现；这种异源表达的蛋白有时会对宿主菌产生毒性，限制宿主菌的生长，而且，在表达量积累的过程中，这种碱性蛋白酶还会造成自身的降解；构建的重组质粒有时很不稳定，在表达过程中容易丢失，这样就造成蛋白表达量的降低或消失。构建合适的载体和选择正确的宿主是这类蛋白表达的关键。
发明内容
本发明提供了一种产角蛋白酶的基因工程菌，是将角蛋白酶基因导入枯草芽孢杆菌得到的基因工程菌，已于2012年3月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉、武汉大学，保藏编号为CCTCC NO M 2012066，分类学命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600-pMA 0911-ker。本发明还提供了一种产盐水解酶基因工程菌的构建方法，包括如下步骤I)采用PCR方法或化学全合成方法获得ker基因；2)将ker基因连接到大肠杆菌表达载体pMA 0911，得到重组载体pMA 0911-ker ；3)重组载体转化 Bacillus subtilis WB600oPCR方法引物序列如下kerl-F:5， -GGAATTCCATATGATGAGGAAAAAGAGTTTTTGG-3>kerl-R:5’ CGCGGATCCTTATTGAGCGGCAGCTTCG-3，PCR反应体系0. 2mL PCR管中按顺序加入以下试剂5Xprime STAR PCR bufferII (Mg2+Plus) 5 μ I ；DNTP Mixture 4 μ I ;模板 DNA I μ I ;上下游引物各 I μ I ；Taq 酶O. 5 μ I ;加双蒸水至终体积为50 μ I。PCR 扩增条件94°C 预变性 5min ;94°C 变性 30s，61°C 退火 15s，72°C 延伸 Imin20s (30 个循环);72°C延伸 IOmin0将胶回收纯化后的PCR产物用Nde I和BamHI酶切后连接到枯草芽孢杆菌表达载体PMA0911，得到重组载体pMA 0911-ker，转化Bacillussubtilis WB600，经筛选鉴定获得重组菌 Bacillus subtilis WB600-pMA 0911_ker。角蛋白酶酶活测定方法将发酵液离心IOmin(10000Xg，4°C )取发酵上清液，吸取200uL适当稀释的酶液，加入300uL O. 05mol/L gly-NaOH缓冲液(pH9. O)溶解1%的底物(角蛋白)，50°C培养20min，加入500uL 4M TCA溶液以终止反应。离心lOmin，吸取200uL上清液移入到新的试管中，后依此加入ImL福林酚试剂和200uL O. 5M Na2CO3后50度显色 15min。空白为在加入酶液的同时，加入500uL TCA溶液，经过相同过程反应的过滤清液作为空白。在660nm处检测吸光值,根据酪氨酸标准曲线定义每20min内释放Iug酪氨酸定义为一个酶活单位。本发明构建了一种稳定表达角质酶基因的工程菌，以此工程菌为生产菌株进行发酵生产，在发酵结束后该菌株表达的角蛋白酶酶活为522U/mL，比野生菌的总酶活提高了近2倍，为角蛋白酶的大规模生产奠定了良好的基础。生物材料样品保藏一株高产角蛋白酶的枯草芽孢杆菌，命名为Bacillus subtilis WB600-pMA0911-ker，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO M 2012066，保藏日期为2011年3月8日。
图I : (a)目的基因的扩增。M DL 2，OOODNAMarker ;泳道I和泳道2 ker基因的PCR扩增条带；(b)菌落PCR挑选阳性重组子。M DL 2，OOODNAMarker ;泳道I和泳道2 :阳
性重组子；图2 : (a)重组质粒的提取。M DL 10, 000DNA Marker ;泳道I和泳道2 :重组质粒pMA0911-ker ； (b)双酶切验证。M DL 10, OOODNAMarker ;泳道 I :重组质粒 pMA 0911-ker ；泳道2 :重组质粒用BamH I和Nde I双酶切后得到的条带。图3 :蛋白电泳(SDS-PAGE)实验结果。M :蛋白质分子量标准(Protein MolecularWeight Marker) ；I :含质粒 pMA 0911-ker 重组菌；2 :含质粒 pMA 0911 重组菌。
具体实施例方式实施例I重组菌的构建及鉴定I)所述引物根据NCBI网站基因序列设计(GenBank S78160. I),引物序列如下kerl-F:5， -GGAATTCCATATGATGAGGAAAAAGAGTTTTTGG-3>kerl-R:5， CGCGGATCCTTATTGAGCGGCAGCTTCG-3，地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis BBEl已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2011319。
PCR反应体系0. 2mL PCR管中按顺序加入以下试剂5Xprime STAR PCR bufferII (Mg2+plus) 5 μ I ；DNTP Mixture 4 μ I ;模板 DNA I μ I ;上下游引物各 I μ I ；Taq 酶O. 5 μ I ;加双蒸水至终体积为50 μ I。PCR扩增条件94°C预变性5min ;94°C变性30s,61°C退火 15s，72°C延伸 Imin 20s (30 个循环);72°C延伸 IOmin02)以I %琼脂糖凝胶电泳验证并以O. 8%琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物，结果扩增得到与文献报道大小相符的ker基因片段(图Ia-泳道I、泳道2)。3)用限制性内切酶Nde I和BamH I双酶切消化纯化后的ker基因和载体pMA0911，用T4DNA连接酶于16°C过夜连接，连接产物用化学转化法转化宿主菌JM109，转化菌液涂布在含有氨苄青霉素(100mg/mL)的LB平板上，37°C过夜培养，以kerl_F和kerl-R为引物进行菌落PCR的方法鉴定阳性克隆子(图Ib-泳道I、泳道2)，最终获得含有ker基因的重组表达质粒pMA0911-ker (图2a_泳道I、泳道2)，用双酶切进行验证(图2b_泳道2)。大肠杆菌化学转化为取连接产物5μ I加入到含有ΙΟΟμ I JM109感受态细胞中，充分混匀后，冰浴30min ;将装有混合物的Eppendorf管，42°C水浴热休克90s，然后将Eppendorf管立即转移到冰上冷却2min ；向管中加入600 μ I LB液体培养基,置于370C 200rpm恒温摇床上培养lh，然后涂布于含有卡那霉素的平板上，37°C向上放置lh，倒置培养12-16h后观察菌落。4)将重组质粒 pMA 0911-ker 转化 Bacillus subtilis WB600 感受态细胞，得到能在含有卡那霉素(30mg/mL)的LB平板上正常生长的基因工程菌，并经过鉴定命名为Bacillus subtiIisffB600-pMA 0911-ker。实施例2重组菌的酶活测定和蛋白电泳
培养基种子和斜面培养基为LB培养基(IL):胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCllOg ;斜面培养基添加琼脂15g ;基本发酵培养基为添加葡萄糖的LB培养基(IL):胰蛋白胨IOg,酵母抽提物5g, NaCl 10g，葡萄糖IOg ；培养方法将37°C、200rpm下培养过夜的种子以3%的接种量转入基本发酵培养基，于37°C、200rpm条件下培养；；以空载体作为对照，通过蛋白电泳(SDS-PAGE)得到一条分子量大小约为40kDa的蛋白条带(见图3)，同时测定该重组菌的酶活，酶活为522U/mL比野生菌的总酶活(320U/mL)提高了近2倍。可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种产角蛋白酶的基因工程菌，于2012年3月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO M 2012066。
2.应用权利要求I所述基因工程菌发酵生产角蛋白酶的方法，其特征在于以产角蛋白酶基因工程菌为生产菌株，斜面活化制备种子后，以3%的接种量转入基本发酵培养基，于37°C、200rpm条件下培养24小时；种子和斜面培养基为LB培养基胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L ;斜面培养基添加琼脂15g ;基本发酵培养基为添加葡萄糖的LB培养基胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖10g/L ;所述基因工程菌的构建方法为1)采用化学全合成或PCR方法克隆ker基因； 2)将ker基因连接到大肠杆菌表达载体pMA0911，得到重组载体pMA 0911-ker ； 3)重组载体转化Bacillus subtilis WB600 得到基因工程菌 CCTCC NO M 2012066。
3.权利要求I所述基因工程菌应用于饲料添加剂。
全文摘要
本发明公开了一种产角蛋白酶的基因工程菌及其应用，属于基因工程技术领域。本发明采用重组DNA技术将地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis BBE11-1的角蛋白酶(ker)基因克隆连接到枯草芽孢杆菌表达载体pMA 0911，并转化Bacillus subtilis WB600，经筛选鉴定得到一株可以产较高角蛋白酶的重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600-pMA 0911-ker，于2012年3月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOM 2012066。该菌株表达的角蛋白酶酶活为522U/mL，比野生菌的总酶活提高了近2倍。这为角蛋白酶的大规模生产奠定了良好的基础。
文档编号C12N15/75GK102703368SQ20121010462
公开日2012年10月3日 申请日期2012年4月10日 优先权日2012年4月10日
发明者刘柏宏, 堵国成, 张娟, 陈坚 申请人:江南大学