一种用于高通量测序分析dna甲基化状态的文库构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于高通量测序分析DNA甲基化状态的文库构建方法。
【背景技术】
[0002] 真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs)的作用下 使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶转变为5'-甲基胞嘧啶。
[0003]目前检测甲基胞嘧啶有多种方法，十多年前重亚硫酸盐基因组序列检测技术已成 为在复杂基因组中分析DNA甲基化的方法。这个敏感而又直接的方法从根本上改了基因组 DNA甲基化模式的特征，在目前使用的技术中可以得到最好的特异性结果并排除多种限制。 这个技术的标准方法是基于DNA变性后用重亚硫酸氢钠处理，可将未甲基化的胞嘧啶修饰 成尿嘧啶，能够将基因组中未甲基化的C碱基与甲基化的C碱基区分开来，重亚硫酸盐基因 组测序已经被证实是分析DNA甲基化的有效和强有力的方法，是目前公认的DNA样品甲基 化检测的"金标准"，它可以明确甲基化的确切位置及甲基化的程度。
[0004] 将重亚硫酸盐修饰与高通量测序技术相结合，能够绘制单碱基分辨率的DNA甲基 化图谱，因此成为表观遗传学研究的经典实验方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种用于高通量测序分析DNA甲基化状态的文库构建方法。
[0006] 本发明提供的一组DNA分子，该组分子由如下（1)- (4)所示的四种分子组成：
[0007] (1)SEQ ID No. 1 所示的 DNA分子；
[0008] (2) SEQ ID No. 2 所示的 DNA分子；
[0009] (3) SEQ ID No. 3 所示的 DNA分子；
[0010] (4)SEQ ID No. 4 所示的 DNA分子。
[0011] 一组接头分子也属于本发明的保护范围，该组分子由如下（1)- (4)所示的四种分 子组成：
[0012] (1)SEQ ID No.1 所示的DNA分子；
[0013] (2)SEQIDNo.2所示的DNA分子，其中3'末端的两个碱基均进行硫代修饰；
[0014](3) SEQ ID No. 3所示的DNA分子；
[0015] (4 )SEQIDNo. 4所示的DNA分子，其中3'末端的两个碱基均进行硫代修饰；
[0016] 所述（1) - (4)所示的四种分子的dC在5位置均有甲基修饰；
[0017]其中（1)和（2)形成双链构成第一种接头分子，（3)和（4)形成双链构成第二种接 头分子。
[0018] 一对引物也属于本发明的保护范围，该对引物由如下（1)和（2)所示的两种分子 组成：
[0019] (1)SEQ ID No.5 所示的DNA分子；
[0020] 该分子与SEQIDNo. 3所不的分子部分序列一致；
[0021] (2)SEQID No.6 所示的DNA分子；
[0022] 该分子与SEQIDNo. 1所不的分子部分序列一致。
[0023] -种重亚硫酸盐修饰试剂也属于本发明的保护范围，该试剂按照如下方法制备而 成：称取1. 9gNa2S205，加水至5mL，全部溶解后用3M氢氧化钠调节pH至5. 0,真空干燥浓缩 制成。
[0024] -种用于高通量测序分析DNA甲基化状态的文库构建的试剂盒也属于本发明的 保护范围，该试剂盒包含上述接头分子和上述引物。
[0025] 上述试剂盒中，所述试剂盒还包含牛血清白蛋白、DNA片段化酶、DNA片段化反应 缓冲液、ddH20、不含核酸酶的水、末端修复缓冲液、T4DNA聚合酶、DNA聚合酶I，（Klenow)大 片段、T4多聚核苷酸激酶、T4DNA连接酶缓冲液、T4DNA连接酶、缺口平移缓冲液、BstDNA聚 合酶(大片段)、甲基化PCR扩增缓冲液和高保真DNA聚合酶；
[0026] 所述末端修复缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为Tris-HCl缓冲液，溶质为MgCl2、 DTT、ATP和dNTPs，Tris-HCl缓冲液的浓度为500mM，MgCl2在所述10X末端修复缓冲液中 的浓度为l〇〇mM，DTT在所述10X末端修复缓冲液中的浓度为100mM，ATP在所述10X末端 修复缓冲液中的浓度为l〇mM，dNTPs在所述10X末端修复缓冲液中的浓度为5mM，溶液pH 为 7.5 ;
[0027] 所述缺口平移缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为Tris-HCl缓冲液，溶质为 (NH4)2S04、KC1、MgS04、TritonX-100 和dNTPs，Tris-HCl缓冲液的浓度为 200mM，（NH4)2S04 在所述10X缺口平移缓冲液中的浓度为lOOmM，KC1在所述10X缺口平移缓冲液中的浓度 为100mM，MgS04在所述10X缺口平移缓冲液中的浓度为20mM，TritonX-100在所述10X 缺口平移缓冲液中的体积百分含量为1%，dNTPs在所述10X缺口平移缓冲液中的浓度为 2mM，所述dNTPs包含等浓度的dATP、dm5CTP,dGTP和dTTP，溶液pH为8. 8 ;
[0028] 所述甲基化PCR扩增缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Tris、（NH4) 2S04、MgCl2和0 -巯基乙醇，Tris在所述甲基化PCR扩增缓冲液中的浓度为670mmol/L， (NH4) 2S04在所述甲基化PCR扩增缓冲液中的浓度为166mmol/L，MgCl2在所述甲基化PCR 扩增缓冲液中的浓度为67mmol/L，0 -巯基乙醇在所述甲基化PCR扩增缓冲液中的浓度为 100mmol/L〇
[0029] 上述任一所述的试剂盒中，所述DNA片段化酶的商品名称为NEBNextdsDNA Fragmentase，购自NEB公司，产品目录号为M0348L;
[0030] 所述DNA片段化反应缓冲液的商品名称为10XFragmentaseReactionBuffer,购 自NEB公司；
[0031] 所述T4DNA聚合酶的商品名称为T4DNAPolymerase，购自NEB公司，产品目录号为 M0203S；
[0032] 所述DNA聚合酶I，（Klenow)大片段的商品名称为DNAPolymerase I，Large(Klenow)Fragment,购自NEB公司，产品目录号为M0210S;
[0033] 所述T4多聚核苷酸激酶的商品名称为T4PolynucleotideKinase,购自NEB公司， 产品目录号为M0201;
[0034] 所述T4DNA连接酶缓冲液的商品名称为10XT4DNALigaseBuffer，购自NEB公 司；
[0035] 所述T4DNA连接酶的商品名称为T4DNALigase，购自NEB司，产品目录号为 M0202S；
[0036] 所述BstDNA聚合酶（大片段）的商品名称为BstDNAPolymerase，Large Fragment，购自NEB公司，产品目录号为M0275;
[0037]所述高保真DNA聚合酶的商品名称为PhusionHigh-FidelityDNAPolymerase， 购自NEB公司，产品目录号为M0530S。
[0038] -种用于高通量测序分析DNA甲基化状态的文库的构建方法也属于本发明的保 护范围，包括如下步骤：
[0039] (1)提取基因组DNA;
[0040] (2)将基因组DNA进行片段化，收集长度为100-300bp的片段化DNA并纯化；
[0041] (3)将步骤（2)得到的DNA的粘性末端修复成平末端，并在5'末端进行磷酸化修 饰并纯化；
[0042] (4)对步骤（3)得到的DNA片段连接上述接头分子并纯化；
[0043] (5)将步骤（4)得到的DNA片段进行缺口平移；
[0044] (6)将步骤（5)得到的DNA片段进行重亚硫酸盐修饰及脱磺酸基并纯化；
[0045] (7)以步骤（6)得到的DNA片段为模板，以上述引物为引物进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物，即为富集的DNA甲基化状态的文库。
[0046] 上述方法中，所述步骤（3)的具体步骤如下：
[0047] 将步骤（2)的片段化的DNA与ddH20、末端修复缓冲液、T4DNA聚合酶、DNA聚合酶 I，（Klenow)大片段、T4多聚核苷酸激酶混合，得体系1;将体系1置于20°C30分钟，得DNA 片段末端修复以及5'末端磷酸化修饰后的产物并纯化；
[0048]所述体系1的总体积为100ul，所述ddH20的体积为29ul，所述末端修复缓冲液的 体积为l〇ul，所述T4DNA聚合酶的酶活为150U，所述DNA聚合酶I，（Klenow)大片段的酶活 为5U，所述T4多聚核苷酸激酶的酶活为50U;
[0049] 所述末端修复缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为Tris-HCl缓冲液，溶质为MgCl2、 DTT、ATP和dNTPs，Tris-HCl缓冲液