富核糖核酸啤酒酵母菌的诱变方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及富核糖核酸啤酒酵母菌的诱变方法。
【背景技术】
[0002] 核糖核酸（RNA)普遍存在于动物、植物和微生物细胞内，参与细胞蛋白质合成和 免疫调节等生理活动。鉴于微生物发酵法得到的产品有着安全无毒害、生产周期短、性价比 高等优于其他途径的特点，微生物来源的RNA及其降解产物核苷酸产品在食品、保健品、医 药及农业等相关领域应用前景越来越好。此外，对酵母细胞进行自溶酶解、过滤浓缩等工艺 制作，获得富含天然呈味核苷酸（I+G)的酵母抽提物，也逐渐成为现代酵母深加工企业的 研发热点。这主要是因为富含天然呈味核苷酸（I+G)的酵母抽提物应用于食品中具有突出 主味，改善风味，抑制异味的功能，同时其对甜味、咸味、肉味有增效作用，对酸味、苦味、腥 味和焦味有遮蔽作用，因此被调味品领域研宄人员所青睐。
[0003] 不论是生产RNA和单核苷酸产品，还是制备富含天然呈味核苷酸（I+G)的酵母抽 提物，均要求酵母菌体细胞中含有大量的RNA，且主要应用于食品、保健品和药品领域，因此 要求选育的酵母菌在发酵培养过程中生成的菌体及其代谢产物对人体无毒害作用。啤酒酵 母属于酿酒酵母属，其被世界上广泛认为是安全无公害的，然而，啤酒酵母菌体中RNA含量 处于4% -8%，含量低，产生的呈味核苷酸含量少，品质较差。在提高酵母细胞RNA含量的 方法中，做过的尝试包括使用选择性的抗生素培养基，优化发酵培养基组分以及诱变筛选 突变株，如通过使用亚硝基胍（NTG)为诱变剂进行选育KC1敏感的变异株等。在啤酒酵母的 选育中未有通过常压室温等离子体诱变系统诱变筛选的方法提高RNA含量的研宄报道。
[0004] 常压室温等离子体（ARTP)诱变在清华大学化工系进行，使用北京思清源生物科 技有限公司生产的ARTP-II型常压室温等离子体诱变系统，其原理为利用氦气辉光放电产 生的等离子体射流作用于微生物，引起微生物的突变。氦气辉光放电的主要优点包括：温 度低，射流的温度可以维持在40°C以下；放电均匀；等离子体射流的活性粒子种类丰富，主 要包括He* (氦的激发态），以及氮、氧等。等离子体射流的活性粒子，可以作用于细胞内的 DNA物质上，引起DNA物质的损伤，并通过不完全的修复过程引起基因位点突变。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供富核糖核酸啤酒酵母菌的诱变方法，该发明具有简单、方 便、尚效、稳定、实用的特点。
[0006] 本发明的富核糖核酸啤酒酵母菌的诱变方法，包括以下步骤：
[0007] 步骤1，选择啤酒酵母菌株，对所述啤酒酵母菌株进行培养，得到菌株悬浮液；
[0008] 步骤2,将所述菌株悬浮液经过预处理，置于常压室温等离子体诱变系统中处理， 将处理后的菌株悬浮液进行梯度稀释后，通过涂抹平板，确定致死率随诱变时间的变化数 值关系；
[0009] 步骤3,根据所述致死率随诱变时间的变化数值关系，选择致死率平板，挑取所述 致死率平板上的单菌落进行培养，测定RNA含量，筛选富核糖核酸的啤酒酵母变异株，得到QH641CGMCCNO. 8810 ；
[0010] 步骤4,对所述QH641CGMCCNO. 8810进行发酵培养，得到高含量核糖核酸的QH641菌体。
[0011] 其中，以下菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心：
[0012] 菌株名QH641 ;
[0013]分类命名酿酒酵母Saccharomycescerevisiae;
[0014]保藏编号CGMCCNo. 8810;
[0015] 保藏日期2014年1月24日；
[0016] 简称QH641;
[0017] 地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所。
[0018] 本发明的有益效果如下：
[0019] 本发明富核糖核酸的QH641CGMCCNO. 8810通过常压室温等离子体诱变方法获 得，比常规诱变方法获得的菌株遗传稳定性更高，RNA含量的富集能力更高，经发酵，最高 RNA含量可达到菌体的15% -17%。
【附图说明】
[0020] 图1为常压室温等离子体诱变致死率曲线。
【具体实施方式】
[0021] 以下优选实施例，对本发明作详细描述，以使本领域的技术人员能够实践它们。
[0022] 下面对本发明做详细描述。
[0023] 在一些说明性实施例中，富核糖核酸啤酒酵母菌的诱变方法，包括以下步骤：步骤 1，选择啤酒酵母菌株，对所述啤酒酵母菌株进行培养，得到菌株悬浮液；步骤2,将所述菌 株悬浮液经过预处理，置于常压室温等离子体诱变系统中处理，将处理后的菌株悬浮液进 行梯度稀释后，通过涂抹平板，确定致死率随诱变时间的变化数值关系；步骤3,根据所述 致死率随诱变时间的变化数值关系，选择致死率平板，挑取所述致死率平板上的单菌落进 行培养，测定RNA含量，筛选富核糖核酸的啤酒酵母变异株，得到QH641CGMCCNO. 8810;步 骤4,对所述QH641CGMCCNO. 8810进行发酵培养，得到高含量核糖核酸的QH641菌体。
[0024] 其中，所述啤酒酵母菌株购自市售品。
[0025] 在一些说明性实施例中，对所述啤酒酵母菌株进行活化，包括以下步骤：挑取啤酒 酵母菌株接种于麦芽浸粉肉汤培养基中，28°C，振荡培养20-24小时。
[0026] 在一些说明性实施例中，所述预处理包括以下步骤：吸取10yL所述菌株悬浮液 于常压室温等离子体诱变系统专用的圆形贴片上。
[0027] 在一些说明性实施例中，所述常压室温等离子体诱变系统的参数为：气源为氦气， 工作气体流量为10SLM，功率为100W，处理距离为2mm，诱变时间为0s、15s、30s、60s、80s、 100s、120s、140s、160s、180s。
[0028] 在一些说明性实施例中，所述选择致死率平板的致死率为80% -90%。
[0029]其中，致死率为80 % -90 %时，菌株突变概率高。
[0030] 在一些说明性实施例中，所述RNA含量测定的方法为：取经过诱变的啤酒酵母，活 化两代，得到酵母菌液，4°C，6000r/min离心5min，生理盐水清洗2次，得到洁净的酵母菌 体；将所述洁净的酵母菌体稀释至3ml，旋涡混匀，得到菌悬液，吸取lml所述菌悬液到试管 中，记录质量；剩余的所述菌悬液，记录质量，转入已知质量的烘干至恒重的称量皿中，放入 101°C±2°C的鼓风干燥箱中烘干至恒重，测定固形物含量；试管中加入10%的高氯酸5ml， 沸水浴30min，置于冰上冷却，以6000r/min离心5min;取上层清液2ml，加入400yL氯仿， 剧烈震荡2min，10000r/min离心lOmin，吸取lml上清液，加入到经高温灭菌的无菌水试管 中分别稀释至10' 1(T2两个梯度，旋涡混匀，以10%高氯酸为空白，在260nm下测定核酸的 吸光度〇D26(lnm，根据公式酵母RNA含量％= (0D26(lnm/0.024X上清液体积X稀释倍数）X6/ (mXw)X100%计算酵母RNA含量。
[0031] 在一些说明性实施例中，所述步骤4,对所述QH641CGMCCNO. 8810进行发酵的 条件为：将QH641CGMCCNO. 8810接种于发酵培养基中，25°C-30°C发酵培养，转速150r/ min-200r/min,发酵培养 12-20h。
[0032] 在一些说明性实施例中，所述发酵培养基为：葡萄糖1.00% -3.00%，硫酸 铵1. 50%-3. 50%，酵母浸膏0. 50%-1. 50%，磷酸二氢钾0