一种酸性耐高温β-甘露聚糖酶及其基因和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种酸性β -甘露聚糖酶AMan、酸性耐高温β -甘露聚糖酶AHTMan及其基因和应用。
【背景技术】
[0002]β_ 甘露聚糖酶(β -1,4-D-mannanase, EC 3.2.1.78)是一类能水解含β -1, 4-D-甘露糖苷键的甘露聚糖(包括均一甘露聚糖、葡萄甘露聚糖和半乳甘露聚糖)的半纤维素酶，广泛存在于动、植物和微生物中。
[0003]甘露聚糖是一种广泛存在于自然界中的植物半纤维素，如豆类、魔芋的块茎以及植物细胞壁中。β -甘露聚糖具有极强的吸水性，在单胃动物消化道内易形成凝胶状，影响营养物质与消化液的接触，降低了饲料利用率。而β_甘露聚糖酶不仅能分解β_甘露聚糖、降低消化道内容物黏度，而且其分解β -甘露聚糖产生的甘露低聚糖，能作为双歧杆菌的增殖因子、促进肠道内有益菌群的增殖，提高动物的生产性能。因此，β_甘露聚糖酶作为一种新型饲料添加剂已在饲料工业中广泛应用。在食品工业中，β_甘露聚糖可以用于生产甘露寡糖及其它食品加工中。在造纸工业中，将β_甘露聚糖酶和木聚糖酶等协同使用，可以减少氯的环境污染。在纺织印染工业中，β_甘露聚糖酶能有效地去除纺织印染产品上黏附的多余染料，以取代常规的化学处理工艺，降低能耗。在医药方面，β_甘露聚糖酶对防治高血脂症，预防动脉硬化和冠心病的发生有一定作用。此外，甘露聚糖酶还是油井石油压裂液的优质生物破胶剂，具有效率高、成本低、对地层伤害小等优点。
[0004]因此，β -甘露聚糖酶作为一种新型的工业酶，具有很高的潜在应用价值，在工业中有着广阔的应用前景。
[0005]但由于β_甘露聚糖酶的生产水平较低，尤其是其耐高温性能较低，极大地限制了 β_甘露聚糖酶的推广应用，因此开展β_甘露聚糖酶高产菌种的研究以及提高该酶的耐高温性等稳定性能，具有重要的实际意义。
【发明内容】
[0006]本发明主要解决的技术问题是提供一种酸性耐高温β -甘露聚糖酶及其基因和应用，通过高效表达后能够达到较高的发酵水平，在工业生产中可较大程度降低生产成本，使其在饲料、食品、石油开采等工业中显示出更大的应用潜力。
[0007]为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是:提供一种酸性β_甘露聚糖酶AMan。
[0008]在本发明一个较佳实例中，提供编码上述酸性β -甘露聚糖酶的基因GAMan。
[0009]在本发明一个较佳实例中，提供一种酸性耐高温甘露聚糖酶AHTMan。
[0010]在本发明一个较佳实例中，提供编码上述酸性耐高温β -甘露聚糖酶的基因GAHTMan。
[0011]在本发明一个较佳实例中,提供包含上述酸性β -甘露聚糖酶AMan或上述酸性耐高温β -甘露聚糖酶AHTMan的重组载体。
[0012]在本发明一个较佳实例中，提供包含上述酸性β -甘露聚糖酶基因GAMan或上述酸性耐高温β -甘露聚糖酶基因GAHTMan的重组菌株。
[0013]在本发明一个较佳实例中，提供制备上述酸性耐高温β -甘露聚糖酶的方法。
[0014]在本发明一个较佳实例中，提供上述酸性甘露聚糖酶AMan或酸性耐高温β -甘露聚糖酶AHTMan的应用。
[0015]本发明所涉及的生产上述酸性β -甘露聚糖酶AMan的黑曲霉(Aspergillusniger)，其生产原始菌株2008年12月3日来自并保藏于中国农业微生物菌种保藏管理中心(保藏中心地址:北京市中关村南大街12号，邮编:100081)，菌种保藏编号:ACCC30132。
[0016]本发明提供了一种β -甘露聚糖酶AMan，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示:
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41 RKYIQLQYGS HYISGQQDID RffNWVEKNIN VAPAILGSLE 81 HKYSPSAVDT GGKSHAVEGS IQHAGRNGDE ALVffHWYAGA 121 QLLDTAKENQ YKGFYTDYGD TQVSEAVNDH GNGTNYKLRL 161 QDDDAIAIQL DRLDQAKVTN RKRPLHEPEG GffFffffGAQGE 201 YAFKKLffDIL YDRITRYSHL HEQVffVCNTA QADffYPGIEK 241 CDIATIDHPN AVGDRRVAAD YNKKLQTVTN NERVLAMAED 281 GPIPDPDKQA RENVNWAAEY LDGQLEENGQ DPAYSINYGR 321 VWS⑶FIEDG KQNPNQFLKH VYNDTRVVAL NWEGA.该酶蛋白由355个氨基酸组成，其分子量为40.2 IKDa0
[0017]本发明还提供了编码上述β -甘露聚糖酶的基因GAMan，该基因的序列如SEQ IDN0.2所示:
I atgttcgcca aattgtccct cctttctctt cttttcagct ctcccgcgct gggcgactcc61 ctgcagactc tgctctatgg caacatctcg cttttcagca ccgctgaagc cagggcgctc121 cgtaagtaca tccagcttca gtatggatcg cactacatct ccggccagca ggacattgac181 cggtggaact gggtcgagaa gaacataaac gtggcccctg cgattctcgg cagcctcgaa241 cataagtact cgccttcggc tgttgacacc ggcggcaagt ctcacgccgt cgagggctct301 atccagcacg ccggccgcaa tggagacgag gccctggtgt ggcattggta cgctggcgct361 cagctactcg ataccgccaa ggagaaccag tacaaggggt tctacaccga ttatggagat421 actcaggtgt ctgaagccgt caacgaccat ggcaacggca ctaactacaa gcttcgcctc481 caggatgatg acgccatcgc tatccagctt gaccgtctgg atcaggccaa agtgactaac541 cgcaagcgcc cgctccacga gcccgagggt ggctggttct ggtggggtgc ccagggtgag601 tacgctttca agaagctgtg ggatatcctc tacgaccgca tcactcgcta ctcgcacctc661 cacgagcagg tctgggtttg caacactgct caagccgatt ggtatcccgg aatcgagaag721 tgcgacattg ccaccatcga tcaccctaac gccgttggtg accgccgtgt cgcggccgac781 tacaacaaga agctccagac cgttaccaac aacgagagag ttttggctat ggcagaggac841 ggccccattc cggaccccga taagcaggct cgtgagaacg tcaactgggc agccgagtac901 cttgacggac aactggagga gaacggtcaa gatccggcct actcgatcaa ttacggccgt961 gtttggtctg gtgacttcat cgaggatggc aagcagaacc ctaaccagtt cctgaagcac1021gtgtacaacg acacccgtgt tgtggctctg aactgggagg gggcttaa 经检测，该酶在pH 2.0-6.5的条件下酶活稳定,最适pH为3.5,属于酸性β -甘露聚糖酶，同时经胃蛋白酶及胰蛋白酶体外水解实验表明本发明获得的酸性甘露聚糖酶具有良好的抗消化能力。但该酶具有一个缺点，即其耐高温性能稍差，75°C水浴中保存10 min后，其酶活力损失达75%左右，因此，需对该酶进行相应的改造，以筛选获得耐高温性能的酸性甘露聚糖酶。
[0018]本发明优选采用定点突变法和易错PCR对SEQ ID N0.1所示的黑曲霉(Aspergillus niger)来源的酸性β -甘露聚糖酶AMan进行改造,并经过高通量筛选的方法筛选得到酸性耐高温甘露聚糖酶AHTMan。本发明的酸性耐高温甘露聚糖酶和原有黑曲霉生产的甘露聚糖酶AMan相比，有3个氨基酸的差异，突变位点由+25L，+56Q,+312Ρ，突变成+25C，+56C, +312C，整个蛋白质空间结构中增加了两个二硫键，突变后的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示:
I MFAKLSLLSL LFSSPALGDS LQTLCYGNIS LFSTAEARAL 41 RKYIQLQYGS HYISGCQDID RffNWVEKNIN VAPAILGSLE 81 HKYSPSAVDT GGKSHAVEGS IQHAGRNGDE ALVffHWYAGA 121 QLLDTAKENQ YKGFYTDYGD TQVSEAVNDH GNGTNYKLRL 161 QDDDAIAIQL DRLDQAKVTN RKRPLHEPEG GffFffffGAQGE 201 YAFKKLffDIL YDRITRYSHL HEQVffVCNTA QADffYPGIEK 241 CDIATIDHPN AVGDRRVAAD YNKKLQTVTN NERVLAMAED 281 GPIPDPDKQA R