嗜热细菌海藻糖合酶c端片段提高海藻糖合酶酶活的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学领域，具体涉及嗜热细菌来源的海藻糖合酶基因和其C端截 短片段，涉及恶臭假单胞菌来源的海藻糖合酶基因和其截短片段，涉及谷氨酸棒杆菌、天蓝 色链霉菌和海栖热袍菌三种来源的海藻糖合酶基因，还涉及含这些海藻糖合酶基因的重组 表达载体和应用。
【背景技术】
[0002] 海藻糖是由两分子葡萄糖以1，1_糖苷键连接而成的非还原性双糖，广泛存在于 细菌、酵母、丝状真菌、植物、昆虫、无脊椎动物等生物体体内。海藻糖对生物体具有非常重 要的生物学意义，是蛋白质和生物膜分子在脱水、高温、氧自由基、低温等恶劣环境中的稳 定剂和保护剂。又因为海藻糖具有甜度适中，性质稳定，不易分解，无还原性等特殊性质，因 此被广泛应用于食品加工业、医药业、农业、生化制品业和化妆品产业中。
[0003] 海藻糖在生物体内的合成途径主要有以下5种：（1)TPS/TPP途径，亦称为OtsA/ OtsB途径：该途径由6_磷酸海藻糖合成酶（Trehalose-6-phosphatesynthase，TPS)催 化尿苷二磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖合成6-磷酸海藻糖，再在6-磷酸海藻糖磷酸酯 酶（Trehalose-6-phosphatephosphatase，TPP)作用下生成海藻糖。（2)TreS途径：由 海藻糖合酶（Trehalose synthase，Tres)催化麦芽糖分子内部发生重排反应，将a， a-l，4_糖苷键连接的麦芽糖转化为a，a-l，l-糖苷键连接的海藻糖。（3)TreY/TreZ 途径：由麦芽寡糖基海藻糖合成酶（Maltooligosyltrehalosesynthase，TreY)催化麦芽 糊精形成麦芽寡糖基海藻糖，然后由麦芽寡糖基海藻糖水解酶（Maltooligosyltrehalose trehalohydrolase，TreZ)水解麦芽寡糖基海藻糖形成海藻糖。（4)TreT途径：由海藻糖葡 糖基转移合成酶（Trehaloseglycosyltransferringsynthase，TreT)催化NDP-葡萄糖 (ADP-，UDP-和⑶P-葡萄糖）和葡萄糖聚合生成海藻糖。（5)TreP途径：由海藻糖磷酸化酶 (Trehalosephosphorylase，TreP)催化D-葡萄糖与1-磷酸葡萄糖合成海藻糖。
[0004] 在海藻糖的工业生产中，海藻糖合酶与其它海藻糖合成酶相比具有更大的优势， 只需要一种酶一步反应就能够获得海藻糖，简单，快捷，而且其生产原料为更加廉价的麦芽 糖。因此，各国科学家更加关注海藻糖合酶，并对其进行了更为深入的研宄。
[0005] 早在1995年，日本的Nishimoto等从脂肪杆菌属的Pimelobactersp.R48中最早 发现并提纯了海藻糖合成酶。随后不久，Tsusaki等人分别从Pimelobactersp.R48和水 生栖热菌（ThermusaquaticusATCC33923)中克隆得到了海藻糖合酶的基因。随后，在结 核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis),耻垢分枝杆菌（Mycobacteriumsmegmatis), 施氏假单胞菌（PseudomonasstutzeriCJ38)和嗜热嗜酸的干热嗜酸菌（Picrophilus torridus)等中也发现了海藻糖合酶的存在。
[0006] 大肠杆菌近年来已被广泛用于工业化生产各种异源蛋白，被认为是最有效的蛋白 表达系统之一。因其工程菌体系遗传背景清晰，具有易培养，密度高、蛋白表达量高、培养成 本低、不易染菌等特点，成为了工业化生产酶的优质选择。
[0007]目前，国内外有很多成功实例采用大肠杆菌对不同来源的海藻糖合酶基因 进行异源表达，DeSmet等人（2000)克隆并在大肠杆菌中异源表达了结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis)的海藻糖合酶，并对其反应的最适条件做了研宄；韩国 的Lee等人（2005)利用大肠杆菌malPQ缺陷菌株和MacConkey培养基，对施氏假单胞菌 (PseudomonasstutzeriCJ38)的基因组文库进行筛选，得到了海藻糖合酶的基因，并将其 成功表达于大肠杆菌中；我国的黄日波等人（2004)先后从褐色喜热裂孢菌（Thermobifida fusca)、谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum)和耐放射异球菌（Deinococcus radiodurans)中克隆得到了海藻糖合酶的基因，通过这些基因在大肠杆菌中的异源表达， 将其应用于海藻糖的酶法生产中，并取得了较好的成果；李明春等人（2008)克隆得到了红 色亚栖热菌（Meiothermusruber)的海藻糖合酶基因，并将其异源表达于大肠杆菌中。
[0008] 嗜热菌属来源的海藻糖合酶是一种耐热酶，它有一个相对更高耐热性和热稳定 性，并且比其他已知的常温来源的海藻糖合酶有更好的转化率。中国台湾的Chen等人 (2007)发现嗜热细菌来源的海藻糖合酶基因比其它来源的海藻糖合酶多一个特殊的C端 片段，C端片段的去除或与其他海藻糖合酶基因融合表达都对海藻糖的生成产生很大影响， 也影响了酶的耐热性和热稳定性，证实C端片段对在海藻糖合酶催化时起着重要的作用。 综上所述，在大肠杆菌中表达恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌这 四种来源的海藻糖合酶基因，还未有将其与嗜热细菌海藻糖合酶C端片段融合表达的方法 提尚其海澡糖广量。
[0009] 本发明提供三种常温来源包括恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌和天蓝色链霉菌，和 嗜热来源包括海栖热袍菌的海藻糖合酶基因，分别与嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端片段 在大肠杆菌体系中进行融合表达，并且利用相应的方法对酶学性质进行研宄，对海藻糖的 产量进行测定。测定结果发现嗜热细菌来源的海藻糖合酶基因更有利于在大肠杆菌中表 达，比较这五种不同来源海藻糖合酶基因序列，嗜热细菌来源的比其他四种来源的海藻糖 合酶基因多出了C端嗜热部分，对嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端嗜热片段截短后，除了降 低了酶反应温度外，还影响了酶催化活性，实验证明C端嗜热片段确实对酶活有一定增强 效果。
[0010] 本发明提供了四种不同来源的海藻糖合酶与嗜热细菌来源的海藻糖合酶基因C 端片段融合表达的形式，实验证明嗜热细菌来源的海藻糖合酶基因C端片段对海藻糖合酶 催化活性的提高有很好的效果。此反应不但能提高海藻糖合酶酶活，进而提高海藻糖的产 量，这种具有优良效果的四种不同来源的海藻糖合酶与嗜热细菌来源的海藻糖合酶基因C 端片段融合表达从未被提及或公开过。
[0011] 本发明中所引述的文献、著作、专利和专利申请公开书，其中全部或局部都明确地 和独立地都在本专利申请书引用参考。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的在于提供嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端片段；提供恶臭假单胞菌 来源的海藻糖合酶截短片段和谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌三种来源的海藻 糖合酶基因；提供这四种海藻糖合酶基因片段和嗜热来源海藻糖合酶C端片段融合表达的 蛋白应用。
[0013] 本发明的技术方案如下：
[0014] -种将海藻糖合酶基因与嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端嗜热片段融合表达的 方法，其步骤如下：
[0015] (1)嗜热细菌海藻糖合酶基因编码区的克隆及其在大肠杆菌中的表达
[0016] 将恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌总DNA根据已知的 海藻糖合酶基因编码区序列，设计一对上下游引物，设计的引物为：
[0017] 恶臭假单胞菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22treSBamHF:5'-GGGAAA匹 ATCCGGCCAAGCGTTCCCGCC-3'(下划线为BamHI酶切位点），
[0018]下游引物 22treSXhoR: 5' -GGGAAACTCGAGTGACTCTCCCCAGGTACTGATC-3' (下划线为 Xhol酶切位点）；
[0019] 谷氨酸棒杆菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22cgtreSNC〇F:5'-GGGAAA CCATGGGCACTGATACCTCTCCGTTGAATTCTCA-3' (下划线为Ncol酶切位点），
[0020] 下游引物：22cgtreSHindR:
[0021] 5 :-GGGAAAAAGCTTTTCCATATCGTCCTTTTCATCGGC-3'(下划线为Hindlll酶切位 点）；
[0022] 天蓝色链霉菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22sCtreSBamHF:5'-GGGAA AGGATCCGCACCGTCAACGAGCCCGTAC-3'(下划线为BamHI酶切位点），
[0023]下游引物 22sctreSHindR:5' -GGGAAAAAGCTTAGCGCGGCGGCCG-3'（下划线为 HindllI酶切位点）；
[0024] 海栖热袍菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22tmtreSEC〇RF:5'-GGGAAAS AATTCGGATGTTGTGTTGAGAGAGCGAAGC-3?(下划线为EcoRI酶切位点），
[0025]下游引物 22tmtreSSalR:5'-GGGAAAGTCGACCCTCAACAGATCTAAGAAGAGTTTCAGATAGT T-3'（下划线为BamHI酶切位点）；
[0026]PCR反应体系为50yL:基因组模板DNAlyL，上下游引物各2yL，dNTPMix 3yL,2XPrimeSTARGCBuffering25yL,DMSO0. 75yL,ddH20 15. 65yL,PrimeSTAR 0? 6yL;PCR反应条件为 98°C预变性lmin，进行 98°C12s，65°C10s，72°Cxs，共 9 个循环， 然后进行98°〇128,57°〇3〇8,721^8，共21个循环，最后721：延伸31^110根据片段长度 设定lmin延伸lOOObp。切胶回收PCR产物并将其克隆至pET-22b上；对所获得的海藻糖合 酶进行测序，构建pET_22b_pptreS、pET_22b_cgtreS、pET_22b_sctreS和pET-22b_tmtreS 质粒并实现其在大肠杆菌中的表达；
[0027] (2)恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌来源的海 藻糖合酶与其融合连接的嗜热细菌海藻糖合酶C端嗜热片段基因编码区的克隆及 pET_22b-pptreS565_tttreSC、pET_22b-cgtreS_tttreSC、pET_22b-sctreS_tttreSC和 pET-22b-tmtreS_tttreSC重组质粒的构建；
[0028] 根据已知的嗜热细菌来源的海藻糖合酶基因C端嗜热片段编码区序列和恶臭假 单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌四种来源的海藻糖合酶基因编码区序 列，分别设计一对上下游引物，设计的引物为：
[0029]恶臭假单胞菌来源的去掉其C端后的1696bp，并与嗜热细菌来源的海藻糖合酶C 端1239bp基因融合表达的海藻糖合酶基因片段的上游引物EchouABamHF:5'-GGGAAAGGATC ￡GGCCAAGCGITCCCGCCCGGCAGCC-3'（下划线为BamHI酶切位点），
[0030]下游引物EchouAlinkerR:5' -GGCGGCGGCTCCGGCTCCGGGCATGCGGTCATGG-3' ；
[0031] 嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端的1239bp，并与恶臭假单胞菌来源的去掉其C 端后的1696bp的海藻糖合酶基因片段融合表达的海藻糖合酶C端基因片段的上游引物 EchouBlinkerF:5' -GGAGCCGGAGCCGCCGCCTGGGCCGAGGAGCCCG-3'，
[0032] 下游引物EchouBHindR:5' -GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT-3'（下划线为Hindlll酶切位点）；
[0033] 谷氨酸棒杆菌来源的，并与嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端1239bp基因融合表达 的海藻糖合酶基因片段的上游引物GuansuanANcoF:5'-GGGAAACCATGGGACTGATACCTCTCCGT TGAATTCTCAGCCG-3'（下划线为Ncol酶切位点），
[0034]下游引物GuansuanAli