抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶及其编码基因、突变位点与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及稗草抗药性相关基因及其应用，特别涉及抗药性稗草中的1-氨基环 丙烷-1-羧酸氧化酶及其编码基因、突变位点与应用，属于植物生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 据申请人所知，稗草（Echinochloa)是一年生禾本科稗属植物的总称，目前 全世界已发现约有35种稗草，生长在热带或亚热带地区，其中我国发现有8种稗草 (Chen&Philips, 2006)。作为全球十大农田恶性抗性杂草之一，稗草已对很多类型的除草剂 产生了抗药性（HeapI，2015)。目前，稗草对除草剂产生抗药性的机理研宄主要侧重于除草 剂作用靶标蛋白位点突变和非靶标蛋白位点突变。
[0003] 20世纪40年代以前研宄人员就发现，乙烯是植物体内重要的天然激素，不仅具 有催熟作用，而且还是一种内源生长调节剂，在生理上对植物生长和发育的许多方面都有 影响，它影响的过程包括：种子萌发，根和茎的生长，花的发育，花、叶的衰老和脱落，果实的 成熟。后来的研宄表明，乙烯也参与调节了植物一系列对应于生物和非生物胁迫的反应， 例如机械伤害、冷害、渍水、病原菌入侵等，另外乙烯也参与了植物程序性死亡和DNA降解。 AdamsD0等（1979)以苹果组织为研宄对象，发现了高等植物体内乙烯的生物合成途径： 甲硫氨酸（Met) -S-腺苷甲硫氨酸（SAM) - 1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC)-乙烯（ET)。 YangSF等（1979)对芹菜和番茄等16种蔬菜的根、茎、叶、花和果实的组织进行培养试验， 发现1-氨基环丙烷-1-羧酸能显著增加植物组织中乙烯的生成量，肯定了乙烯的生物合成 途径，也证明了 1-氨基环丙烷-1-羧酸是一种有效的生长调节剂。另外，CameronAC等 (1979)研宄发现，催化SAM向ACC转化的酶叫ACC合成酶（ACS)，催化ACC向乙烯转化的 酶称为ACC氧化酶（1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶，简称AC0)。从合成途径中可以看出， 1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC)是乙烯合成过程中的一个重要的中间产物，在有氧条件下， ACC在ACC氧化酶的催化下形成乙烯，该反应由ACC氧化酶催化，是乙烯生物合成的关键步 骤之一。
[0004] 随着除草剂的长期使用，稗草对常用的除草剂一二氯喹啉酸的敏感性正在逐年 下降。前面有人研宄认为稗草对二氯喹啉酸产生抗药性与吸收、传导、代谢无关，而与乙 烯的合成途径变化有密切关系。Yasuor等（2012)在研宄卡里福利亚水稗（Echinochloa phyllopogon)的抗二氯喹啉酸机制中也发现，敏感生物型中乙烯产量比抗性生物型中乙烯 产量要多。国内也研宄了西来稗（Echinochloacrus-gallivar.zelayensis)对二氯喹啉 酸的抗性机制，四个西来稗抗性生物型中的乙烯、1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC)的水平比敏 感性生物型中低，且抗性生物型中ACC合成酶和ACC氧化酶的活性比敏感性生物型中低，表 明了乙烯生物合成途径的抑制导致了西来稗抗药性的产生（Xuetal.，2013)。
[0005] 经检索发现，公开号为CN100393874C的中国专利公开了类1-氨基环丙烷-1-羧 酸氧化酶及其编码基因，特别涉及类1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶及其编码基因在棉花纤 维生产中的应用，该专利中的基因编码一个类1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶，具有乙烯合 成酶（ACO)的功能，在棉花纤维发育的起始开始转录，并在伸长期大量转录，在棉花纤维组 织中大量表达，显著提高了纤维生长速度和长度，说明了乙烯合成数量与纤维长度的正相 关性。
[0006] 由于抗衰老和保鲜的生产需要，花丼和水果例如康乃馨、番茄等植物中ACO基因 特征及其表达的研宄已取得了很大的进展。然而，在禾本科植物中有关ACO的研宄报道相 对较少。迄今为止，ACO基因未见从稗草中克隆，且从基因水平来阐述乙烯生物合成途径对 稗草抗药性的影响也未见报道。
【发明内容】
[0007] 本发明所要实现的发明目的是：克服现有技术存在的问题，提供一种抗药性稗草 中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶及其编码基因、突变位点与应用。
[0008] 为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
[0009] 一种抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶，其氨基酸残基序列如SEQID NO: 3所示。
[0010] 序列表中的序列3的蛋白质由311个氨基酸残基组成，存在DI0X_N*20G-Fe11_ 〇xy两个结构域。
[0011] 上述抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的编码基因也属于本发明的 保护范围，该编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
[0012] 序列表中的序列1编码序列表中SEQIDNO:3蛋白质序列的DNA，其核苷酸序列 长度为lOOObp，该基因的开放阅读框为自序列1的5'端第60位到第995位碱基，编码区长 度为936bp。
[0013] 上述抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶功能区域的所有突变位点均 属于本发明的保护范围。1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的功能区域包括蛋白保守结构域 DI0X_N和20G-FeII_0xy;1_氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的氨基酸突变位点为F98 -Y， G101 -D，Q206 -R，G270 -V，A272 -G，其中氨基酸突变位点F98 -Y，G101 -D和 Q206 -R处于蛋白保守结构域DI0X_N和20G-FeII_0xy中；与氨基酸突变相对应的碱基 突变位点为T293 -A，G302 -A，A617 -G，G809 -T，C815 -G。
[0014] 本发明以二氯喹啉酸抗药性稗草和敏感性稗草为研宄材料，分别提取二者的总 RNA，并利用反转录聚合酶链式反应技术（RT-PCR)克隆得到稗草中1-氨基环丙烷-1-羧酸 氧化酶（简称EcACO)的编码基因，在PCR扩增步骤中，引物的核苷酸序列为：
[0015]引物EcACO-F:5' -CAGTTGCACAGAGACATTTCAC-3'
[0016] 引物EcAC0-R:5' -TTACTTTAAGCCGCCGGAGAT-3'。
[0017] 其中，敏感性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的氨基酸残基序列如SEQ IDNO:4所示，其基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，该基因的开放阅读框为自序列2 的5'端第60位到第995位碱基。将抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶记为 EcACO-R，敏感性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶记为EcACO-S，如图1所示，对二 者进行核苷酸序列及氨基酸序列比较发现，二者的氨基酸序列存在5个氨基酸突变位点差 异，具体为F98 -Y，G101 -D，Q206 -R，G270 -V，A272 -G。据了解，氨基酸突变是由相应 位置的碱基异变引起的，与上述氨基酸突变相对应的碱基突变位点为T293 -A，G302 -A，A617 -G，G809 -T，C815 -G。其中，F98 -Y，G101 -D和Q206 -R这三处氨基酸突变 位置均处于蛋白保守结构域DI0X_N* 20G-FeII_0xy中，DI0X_N* 20G-FeII_0xy均与 Fe2+的氧化有关。Fe2+是催化ACC向乙烯转化过程中的关键辅助因子，这三处氨基酸突变可 能会降低乙烯生成反应中Fe2+辅助因子与EcACO蛋白的结合效率，进而抑制了乙烯生物合 成途径，最终导致稗草对二氯喹啉酸产生抗性。
[0018] 本发明根据二氯喹啉酸抗药性稗草中的EcACO-R基因序列以及敏感性稗草中的 EcACO-S基因序列设计特异性引物，并设0-act in基因为内参进行实时定量PCR分析，重 复3次试验，反应完成后进行溶解曲线检验，并按照2_AACT法计算基因的相对表达量，发现 EcACO-R基因的相对表达量比EcACO-S基因的相对表达量低（见图2)。
[0019] 本发明将抗药性稗草EcACO-R基因和敏感性稗草EcACO-S基因分别构建到含有麦 芽糖结合蛋白（MBP)标签的原核表达载体质粒pMAL-c5X中，构建原核表达载体后得到重组 质粒。将重组质粒转入大肠杆菌菌株BL21中进行融合蛋白的原核表达，对IPTG诱导后的 蛋白进行12 %SDS-PAGE电泳，结果表明，抗药性稗草中的融合蛋白MBP: :EcACO-R和敏感性 稗草中的融合蛋白MBP: :EcACO-S，二者分子量大小均约为75kD(与理论值一致），这两种融 合蛋白主要存在于上清中，即在大肠杆菌中主要以可溶性蛋白的形式表达（见图3)。分别 对这两种可溶性蛋白进行纯化并对纯化后的可溶性蛋白进行蛋白活性测定，以研宄AC0的 酶活性，AC0的酶活性以每小时1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC)生成乙烯（ET)这一步骤所产 生的乙烯量表示，单位为nmol?yf1 测量时，设乙烯标样为阴性对照，利用装备A1203 柱子的气相色谱仪分析单位时间内气体乙烯的生成量，重复3次试验，结果显示5yg的融 合蛋白MBP: :EcACO-S每小时内生成的乙烯量是融合蛋白MBP: :EcACO-R的2. 15倍（见图 4)，即MBP: :EcAC〇-R的蛋白活性显著低于MBP: :EcAC〇-S，EcAC