期的二氯喹啉酸抗药性稗草和敏感性稗草材料，利用实时定量 PCR(quant itat ive real-t ime PCR)分析这些材料中EcACO基因的表达水平，从而获得EcACO基因表达水平与二氯喹啉酸抗药性的关系。
[0044] 1.稗草总RNA的提取。以二氯喹啉酸抗药性稗草和敏感性稗草为研宄材料，从培 养至2~3叶期的抗药性稗草单株苗和敏感性稗草单株苗中分别提取总RNA。稗草总RNA的提取采用超纯总RNA快速提取试剂盒（购自原平皓生物技术有限公司），操作方法参照试 剂盒说明书。提取的稗草总RNA，经1%琼脂糖电泳检测RNA的质量和完整性，然后放入超 低温冰箱中在_80°C条件下冻存。
[0045] 2.cDNA模板的制备。取出超低温冰箱中冻存的抗药性稗草总RNA和敏感性稗草总 RNA分别置于冰上，以RNA为模板，采用反转录试剂盒（购自天根生物科技有限公司）分别 进行抗药性稗草及敏感性稗草cDNA第一链的合成。反应条件是25°C，lOmin;42°C，30min; 85〇C,5min〇
[0046] 3.实时定量PCR。根据实施例1获得的抗药性及敏感性稗草EcACO基因序列 设计特异性引物。特异性引物为EcACO-QF: 5 ' -GACACACGCAATCAACAATGG-3 '，EcACO-Q R: 5 ' -CAAGCTGAAAGAATCCCCACT-3 '。实时定量PCR实验时，选取0-actin基因作为内 参，然后设计内参的特异性引物：正向引物5' -CACACTGGTGTCATGGTAGG-3'和反向引物 5' -AGAAAGTGTGATGCCAGAT-3'。实时定量PCR(quantitativereal-timePCR)试验操作在 ABI-Steponeplus实时定量PCR仪上进行，其反应体系及程序参照TakaraSYBRPremixEX TaqTMII说明书。试验时设定3次重复，反应完成后进行溶解曲线分析，然后按照2_AACT法 计算基因的相对表达量。结果如图2所示，EcACO-R基因的相对表达量比EcACO-S基因的 相对表达量低，试验表明EcACO基因在抗药性稗草中表达较少，对乙烯合成反应具有一定 抑制作用，可能对二氯喹啉酸抗药性发挥重要作用。
[0047] 实施例3.抗药性稗草和敏感性稗草中EcACO的酶活测定及其差异比较
[0048] 选取2~3叶期的二氯喹啉酸抗药性稗草和敏感性稗草材料，利用YusukeKosugi 等（2014)方法分析这些材料中EcACO的酶活性。
[0049] 1.原核表达载体构建。设计的引物为EcACO-Ndel-S: 5'-GGTATATACATATGGTGGTTC CAGTGATCG-3'（划线处为限制性内切酶Ndel酶切位点识别序列）；EcAC0-NdeI-R:5'-GGTAT ATACATATGGTGGTCCCTGTGATCG-3' (划线处为限制性内切酶Ndel酶切位点识别序列）；EcAC0 -EcoRV: 5' -GGCTCTCAGATATCTCATTAAGCCGCCGGAG-3'(划线处为EcoRV酶切位点识别序列）。 将EcACO-R基因和EcACO-S基因分别构建到含有MBP(麦芽糖结合蛋白）标签的原核表达 载体质粒pMAL-c5x中，其中EcACO-R基因以EcACO-Ndel-R和EcACO-EcoRV为两端引物， EcACO-S基因以EcACO-NdeI-S和EcACO-EcoRV为两端引物，通过PCR反应分别扩增EcACO基 因的完整编码区。PCR扩增的程序为：95°C预变性3min;94°C变性30s，58°C退火40s，72°C 延伸2min，重复33个循环后；72°C延伸lOmin。将PCR扩增后的产物一含有EcACO-R基因 的DNA片段的扩增序列以及含有EcACO-S基因的DNA片段的扩增序列经回收纯化后，分别 采用限制性内切酶NdeI和EcoRV进行双酶切，得到EcACO-R基因片段和EcACO-S基因片 段。同时，采用限制性内切酶NdeI和EcoRV对原核表达载体pMAL-c5x质粒进行双酶切， 得到回收纯化的线性载体。在16°C条件下通过T4-DNA连接酶将EcACO-R基因片段与线性 载体连接得到含有EcACO-R基因片段的重组质粒，过夜后将重组质粒转化到大肠杆菌菌株 DH5a中，在含有氨苄青霉素的平板上挑取单克隆，再经PCR和酶切验证得到阳性克隆，对 阳性克隆进行DNA测序分析；同时在16°C条件下通过T4-DNA连接酶将EcACO-S基因片段 与线性载体连接得到含有EcACO-S基因片段的重组质粒，过夜后将重组质粒转化到大肠杆 菌菌株DH5a中，在含有氨苄青霉素的平板上挑取单克隆，再经PCR和酶切验证得到阳性克 隆，对阳性克隆进行DNA测序分析。若测序结果表明重组质粒中的插入基因序列无缺失和 突变，说明原核表达载体构建成功。
[0050] 2.融合蛋白的原核表达。将含有EcACO-R基因片段的重组质粒和含有EcACO-S基 因片段的重组质粒分别转入大肠杆菌菌株BL21中，并设pMAL-c5x空载体作为对照组。将 上述三组的单菌落分别接种到10mL含有氨苄青霉素（浓度为100mg/L)的LB液体培养基 中，37°C条件下培养过夜，然后将接种后的LB液体培养基按照质量比为1:100的比例接种 到新鲜的LB液体培养基中，培养至0D_(opticaldensity)值约为0. 6,向培养基中加入 IPTG(异丙基硫代半乳糖苷）至其终浓度为0. 4mM，18°C条件下低温诱导16h后，过夜培养 产生融合蛋白MBP: :EcAC〇-R或MBP: :EcAC〇-S，同时设未加IPTG诱导剂的菌液作为阴性对 照。4000Xg条件下离心收集三组过夜培养的菌液，用适量ColumnBuffer溶液（Column Buffer溶液由20mMTris-Hcl、200mMNaCl和ImMEDTA组成）悬浮后进行超声波裂解， 20000Xg条件下离心20min后分离上清和沉淀。取部分上清和沉淀分别加入5XSDS上 样缓冲液中，经l〇〇°C煮沸10min处理后于冰上保存2min，然后进行12%SDS-PAGE电泳， 分析蛋白在上清和沉淀中的表达情况。电泳的结果如图3所示，其中A图为EcACO-R，B图 为EcACO-S;图中M表示pMAL-c5x空载体对照组，是蛋白质分子量标准，1表示未经IPTG 诱导的MBP: :EcACO, 2表示经IPTG诱导的MBP: :EcACO蛋白沉淀，3表示经IPTG诱导的 MBP: :EcACO蛋白上清，4表示MBP: :EcACO纯化蛋白。由图3可知，融合蛋白MBP: :EcACO-R 或MBP: :EcACO-S的分子量大小均约为75kD(与理论值一致），主要存在于上清中，表明融合 蛋白在大肠杆菌BL21中主要以可溶性蛋白的形式表达。
[0051] 3.可溶性蛋白的纯化。将含有融合蛋白MBP: :EcACO-R或MBP: :EcACO-S的菌株接 种于含有氨苄青霉素（浓度为l〇〇mg/L)的LB液体培养基中，37°C振荡培养至0D_值约为 0. 6左右，向培养基中加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷）至其终浓度为0. 4mM，18°C条件下 低温诱导16h后，4, 000Xg、4°C条件下离心收集菌体，采用ColumnBuffer溶液悬浮后进行 超声波裂解，20, 000Xg、4°C条件下离心20min，收集上清。将上清液加入到MBP吸附柱中， 经ColumnBuffer平衡上样后的吸附柱，用MBP洗脱液（由20mMTris-HCl、200mMNaCl、 ImMEDTA和10mMmaltose组成）洗脱融合蛋白，洗脱后可获得分子量大小约75kD的蛋白。 洗脱后的蛋白经12%SDS-PAGE电泳分析融合蛋白的纯度，电泳结果如图3的第4泳道所 示，纯化后的蛋白没有明显杂带，获得的蛋白液适合进一步作蛋白活性测定。
[0052] 4.融合蛋白的活性分析。AC0的活性测定参考YusukeKosugi等（2014)方法并 结合本实施例的特点加以修改。融合蛋白活性分析实验中，以纯化后的MBP: :EcAC〇-R或 MBP: :EcACO-S融合蛋白为对象，ACC为底物，抗坏血酸和氧为辅助底物，Fe2+和C0 2为辅助因 子。操作步骤为：将50yL酶蛋白液（蛋白量5yg)加入到60mMMOPS-NaOH溶液中（PH= 7. 5)，再加入25mM抗坏血酸钠，50yMFeS04, 25mMNaHCOjP0?ImMACC得到2mL总体积的 反应液。将2mL反应液转移至5mL密闭气体收集瓶中，盖上橡胶筛，30°C恒温水浴30min后， 取lmL上层气样，用装备A1203柱子的气相色谱仪（GC-9860)分析单位时间内气体乙烯的生 成量，重复操作3次，并设乙烯标样为阴性对照。其中AC0的酶活性以每小时1-氨基环丙 烧-1-羧酸（ACC)生成乙稀（ET)这一步骤所产生的乙稀量表示，单位为nmol?yg4 ?)!' 如图4所示，5yg的MBP: :EcACO-S每小时内生成的乙烯量是同质量的MBP: :EcACO-R的 2. 15倍。上述结果表明，MBP: :EcAC〇-R的蛋白活性显著低于MBP: :EcAC〇-S，g卩EcACO在抗 药性稗草中的氨基酸突变可能降低了反应底物、辅助底物或辅助因子与EcACO蛋白的结合 效率。
[0053] 实施例4. EcACO-R转基因水稻对二氯喹啉