酸的抗性检测
[0054] 1.构建抗药性稗草中EcACO-R基因的植物表达载体。设计引物，正向引物为5'-GG TATATAAGATCTATGGTGGTTCCAGTGAT-3' (划线处为BglII酶切位点识别序列），反向引物为 5' -GGCTCTCAGGTGACCTTAAGCCGCCGGAG-3' (划线处为BstEII酶切位点识别序列）。以抗 药性稗草cDNA为模板，采用高保真的TagPlus酶经PCR反应扩增出两端含有酶切位点的 EcACO-R全长基因，PCR扩增程序为：95 °C预变性3min;94°C变性30s，58 °C退火40s，72 °C延 伸2min，重复33个循环；72°C延伸10min。两端含有酶切位点的EcACO-R全长基因回收纯 化后，采用限制性内切酶BglII和BstEII进行双酶切，得到目的片段一EcACO-R基因片 段；同时采用限制性内切酶BglII和BstEII对表达载体pCAMBIA1304质粒进行双酶切， 得到回收纯化的线性载体，线性载体含有35S启动子。在16°C条件下通过T4-DNA连接酶 将EcACO-R基因片段与线性载体连接过夜，并转化大肠杆菌DH5a。经酶切鉴定，得到重组 质粒，记为35S:EcAC0-R。利用冻融法将重组质粒35S:EcAC0-R转化到农杆菌菌株EHA105 中，然后采用农杆菌介导法将重组质粒35S:EcAC0-R转化水稻中花11中。
[0055] 2.农杆菌介导的水稻转化。⑴愈伤组织的诱导和培养，将成熟水稻种子去壳后，在 70%乙醇溶液中浸泡lmin进行表面消毒，再采用1. 25%次氯酸钠溶液浸泡30min进行灭 菌处理，然后采用无菌水洗净，将洗净后的种子置于NBD诱导培养基（见表1)上，在26°C、 避光条件下培养愈伤组织，10~15天后剥取盾片处长出的愈伤组织，并将愈伤组织转入新 的NBD固体培养基，进行继代培养。⑵农杆菌的培养，将农杆菌EHA105划板于YEB培养基 (内含50mg/L卡那霉素）上，28°C温度条件下培养2~3天后，采用金属匙收集农杆菌菌 体，并将其悬浮于NBCI液体培养基（见表1)中。调整农杆菌的菌体浓度使NBCI培养基 〇D_值约为0. 5,即可得到供转化用的农杆菌悬浮液。⑶愈伤组织与农杆菌的共培养，将继 代培养3~5天的愈伤组织转移到无菌三角瓶中（选用色泽淡黄、质地坚硬的胚性愈伤组 织），向无菌三角瓶加入适量的农杆菌悬浮液，室温下放置15~20min，并不时摇晃，使菌液 与材料充分接触。取出浸染过农杆菌的愈伤组织，并采用无菌滤纸吸去多余菌液后，转入 NBCII固体培养基（见表1)上（表面铺有一张无菌滤纸），在25°C、避光条件下共培养2~ 3天。⑷抗性愈伤的获得，将共培养后的愈伤组织移到NBSI选择培养基（见表1)上，两周 后，在已褐化的愈伤组织上长出许多白色新鲜的抗性愈伤组织，将这些新鲜抗性愈伤组织 置于NBSII选择培养基（见表1)上进行一次复筛。（5)抗性植株的再生，挑选1~2mm生长 良好、结构致密的抗性愈伤组织，并将其转到RM培养基（见表1)上，先暗培养3天，然后转 至15h/d光照条件下培养，经过15~25天，得到Hyg(潮霉素，hygromycin)抗性小苗。（6) 生根培养，Hyg抗性小苗长到2cm高时，将其移入ShM培养基（见表1)中生根培养2~3 周，待小苗长出粗壮而发达的根系后，将其移植到花盆中生长2~3周，再将花盆中的小苗 种于温室或大田直至收获I；代种子，T^代种子繁种后收获Ti种子，用于后续实验。
[0056] 3.检测EcACO-R转基因水稻对二氯喹啉酸的抗性。以EcACO-R转基因水稻（中 花11)为材料，以空载体转基因水稻（CK)作为对照。将EcACO-R转基因水稻和空载体转基 因水稻播种于石英砂中，待两组水稻生长至2叶期时，采用喷雾法进行除草剂二氯喹啉酸 喷施，其喷施的有效剂量为稻田中最高推荐剂量（即25克/亩）的5倍。除草剂喷施处理 10天后，观察两组水稻的生长情况。如图5所示，与未经除草剂处理的水稻相比，空载体转 基因水稻CK和两个EcACO-R转基因水稻株系EcACOR-1、EcACOR-2的生长均受到二氯喹啉 酸的抑制，但是EcACO-R转基因水稻的叶片为绿色，仍呈生长状态，只是比未经除草剂处理 的水稻生长稍显缓慢；而对照组CK的每个植株的叶片卷曲，叶尖均发生凋萎。上述结果表 明，EcACO-R转基因水稻植株对二氯喹啉酸表现出极高的抗性。
[0057] 表1水稻组织培养用培养基
[0058]
【主权项】
1. 抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶，其特征是：该氧化酶的氨基酸残基 序列如SEQ ID NO :3所示。
2. 权利要求1所述抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的编码基因，其特征 是：所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
3. 根据权利要求2所述抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的编码基因，其 特征是：所述编码基因的开放阅读框为自序列1的5'端第60位到第995位碱基。
4. 权利要求1所述抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶功能区域的突变位 点。
5. 根据权利要求4所述抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的突变位点， 其特征是：所述1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的功能区域包括蛋白保守结构域DI0X_ N和20G-Fe II _0xy ;所述1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的氨基酸突变位点为F98 - Y， GlOl - D，Q206 - R，G270 - V，A272 - G，其中所述氨基酸突变位点 F98 - Y，GlOl - D 和 Q206 - R处于蛋白保守结构域DI0X_N和20G-Fe II _0xy中；与所述氨基酸突变相对应的 碱基突变位点为 T293 - A，G302 - A，A617 - G，G809 - T，C815 - G。
6. 权利要求1所述抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶及其编码基因在培 育抗除草剂转基因品种中的应用，尤其是抗激素类除草剂转基因品种中的应用。
7. 根据权利要求6所述抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶及其编码基 因的应用，包括提取抗药性稗草总RNA及制备抗药性稗草cDNA模板，重组质粒以及相应基 因工程菌的构建，转化重组质粒到水稻中，其特征是，在重组质粒以及相应基因工程菌的构 建步骤中，以抗药性稗草cDNA为模板，通过PCR反应获得含有抗药性稗草中1-氨基环丙 烷-1-羧酸氧化酶基因的DNA片段的扩增序列，引物的核苷酸序列为： 正向引物：5 ' -GGTATATAAGATCTATGGTGGTTCCAGTGAT-3 ' 反向引物：5' -GGCTCTCAGGTGACCTTAAGCCGCCGGAG-3'，质粒 pCAMBIA1304 为表达载体质 粒，表达载体含有启动子，所述启动子为35S启动子。
8. 根据权利要求7所述抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的应用，其特征 是，制备抗药性稗草cDNA模板后还可有以下步骤：提取敏感性稗草总RNA及制备敏感性稗 草cDNA模板，以抗药性稗草cDNA和敏感性稗草cDNA为模板进行PCR扩增获得抗药性及敏 感性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因，并对二者进行序列差异分析，在PCR扩 增步骤中，引物的核苷酸序列为： 引物 EcACO-F :5' -CAGTTGCACAGAGACATTTCAC-3' 引物 EcACO-R: 5' -TTACTTTAAGCCGCCGGAGAT-3'。
9. 根据权利要求8所述抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的应用，其特征 是：所述敏感性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的氨基酸残基序列如SEQ ID NO : 4所示，所述敏感性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，该基因的开放阅读框为自序列2的5'端第60位到第995位碱基。
10. 根据权利要求8所述抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的应用，其特 征是，PCR扩增获得抗药性及敏感性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因后，还可 有以下步骤：构建原核表达载体以及原核表达融合蛋白，纯化蛋白并对融合蛋白进行活性 分析，在构建原核表达载体以及原核表达融合蛋白步骤中，质粒pMAL-c5x为原核表达载体 质粒，质粒pMAL-C5x含有原核表达标签，所述原核表达标签为麦芽糖结合蛋白标签。
【专利摘要】本发明公开了抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶及其编码基因、突变位点与应用。该抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶，其氨基酸残基序列如SEQ ID NO：3所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶及其编码基因在培育抗除草剂转基因品种中的应用。
【IPC分类】A01H5-00, C12N15-53, C12N15-82, C12N9-02
【公开号】CN104651326
【申请号】CN201510078406
【发明人】杨霞, 李永丰, 董明超, 张自常, 裴涛
【申请人】江苏省农业科学院
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月13日