O在抗药性稗草中的氨基酸 突变降低了乙烯生成反应中反应底物、辅助底物或辅助因子与EcACO蛋白的结合效率，进 而抑制了乙烯生物合成途径。
[0020] 综上可知，通过基因表达和蛋白酶活性分析，表明抗药性稗草中的1-氨基环丙 烷-1-羧酸氧化酶抑制了乙烯的生物合成途径，使得抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧 酸氧化酶及其编码基因在培育抗除草剂转基因品种中具有重要的应用价值。
[0021] 上述抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶及其编码基因的应用，包括提 取抗药性稗草总RNA及制备抗药性稗草CDNA模板，重组质粒以及相应基因工程菌的构建 和转化重组质粒到水稻中，在重组质粒以及相应基因工程菌的构建步骤中，以抗药性稗草 cDNA为模板，通过PCR反应获得含有抗药性稗草中1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因的 DNA片段的扩增序列，引物的核苷酸序列为：
[0022] 正向引物：5 ' -GGTATATAAGATCTATGGTGGTTCCAGTGAT-3 '
[0023]反向引物：5' -GGCTCTCAGGTGACCTTAAGCCGCCGGAG-3'，表达载体含有启动子，启动 子为35S启动子，将EcACO-R基因构建到表达载体质粒pCAMBIA1304中，获得重组质粒，该 重组质粒记为35S:EcACO-R。利用冻融法将重组质粒35S:EcACO-R转化到农杆菌中，然后采 用农杆菌介导法将35S:EcACO-R转化到水稻中，得到EcACO-R转基因水稻。以EcACO-R转 基因水稻为材料，空载体转基因水稻作为对照，检测EcACO-R转基因水稻对二氯喹啉酸的 抗性，如图5所示，与未经除草剂处理的水稻相比，空载体转基因水稻和EcACO-R转基因水 稻两个株系的生长均受到二氯喹啉酸的抑制，但是EcACO-R转基因水稻的叶片为绿色，仍 呈生长状态，其生长态势仅比未经除草剂处理的水稻稍显缓慢；空载体转基因水稻的叶片 卷曲，叶尖均发生凋萎，由此可知EcACO-R转基因水稻植株能够提高植株对二氯喹啉酸除 草剂的抗性。
[0024] 二氯喹啉酸属于激素类除草剂中的一种，激素类除草剂可以分为苯氧羧酸类、苯 甲酸类、吡啶羧酸类及喹啉羧酸类等4类，被广泛用于禾谷类作物田选择性防治杂草。苏少 泉等（2011)在"激素类除草剂的发展与杂草抗性"中研宄表明杂草对激素类除草剂的敏感 性正逐年下降，即杂草的抗性逐年增加。研宄表明，激素类除草剂的作用机制基本相同，均 是通过加大乙烯的生成量来使杂草凋萎。由此可知激素类除草剂能够作用于稗草等杂草中 的乙烯生物合成途径，稗草对激素类除草剂产生抗性也均与乙烯的生物合成途径发生变化 有密切关系。在稗草对激素类除草剂产生抗性这一过程中，AC0作为乙烯合成途径的关键 酶，其功能区域相应地发生了位点突变。这些位点突变也会导致乙烯生成反应中反应底物、 辅助底物或辅助因子与AC0蛋白的结合效率降低，进而抑制乙烯的合成途径，使稗草对激 素类除草剂产生抗性。因此针对激素类除草剂抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧 化酶及其编码基因，在培育抗激素类除草剂转基因品种方面具有重要的应用价值。
[0025] 本发明的抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶，与敏感性稗草相比，其 基因发生了突变，存在5个氨基酸突变位点差异，不仅可抑制乙烯的生物合成途径，进而提 高稗草对二氯喹啉酸的抗药性，是稗草抗二氯喹啉酸除草剂的新机制，还能够为培育除草 剂转基因作物品种提供服务。
【附图说明】
[0026] 图1是EcACO-S和EcACO-R的核苷酸序列及氨基酸序列差异比较图。
[0027] 图2是抗药性稗草和敏感性稗草中的EcACO基因的PCR分析。
[0028] 图3是融合蛋白MBP: :EcACO-R和MBP: :EcACO-S诱导表达后的电泳图。
[0029] 图4是抗药性稗草和敏感性稗草中的EcACO酶活差异比较图。
[0030] 图5是二氯喹啉酸对EcACO-R转基因水稻的影响。
【具体实施方式】
[0031] 下面通过实施例对本发明做进一步说明，但是本发明不仅限于这些例子。本发明 所用的抗药性稗草和敏感性稗草材料均是李永丰研宄员于2010年9月下旬采自安徽省合 肥市庐江县的水稻田中，水稻品种中花11来自于江苏省农业科学院粮食作物研宄所，本发 明所涉及的试剂均为市购。
[0032] 下述实施例所用的大肠杆菌菌株DH5a和BL21，以及农杆菌菌株H1105均购自南 京天为生物科技有限公司。
[0033] 下述实施例的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0034] 下述实施例的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
[0035] 实施例1.抗药性稗草和敏感性稗草中的EcACO基因的克隆及其序列差异分析
[0036] 选取2~3叶期的二氯喹啉酸抗药性稗草和敏感性稗草材料，并对其EcACO基因 进行核苷酸序列及氨基酸序列比较分析。
[0037] 1.稗草总RNA的提取。以二氯喹啉酸抗药性稗草和敏感性稗草为研宄材料，从培 养至2~3叶期的抗药性稗草单株苗和敏感性稗草单株苗中分别提取总RNA。稗草总RNA 的提取采用超纯总RNA快速提取试剂盒（购自原平皓生物技术有限公司），操作方法参照试 剂盒说明书。提取的稗草总RNA，经1%琼脂糖电泳检测RNA的质量和完整性，然后放入超 低温冰箱中在_80°C条件下冻存。
[0038] 2.cDNA模板的制备。取出超低温冰箱中冻存的抗药性稗草总RNA和敏感性稗草总 RNA分别置于冰上，以RNA为模板，采用反转录试剂盒（购自天根生物科技有限公司）分别 进行抗药性稗草及敏感性稗草cDNA第一链的合成。合成反应条件是25°C温度条件下，反应 时间为lOmin;42°C温度条件下，反应时间为30min;85°C温度条件下，反应时间为5min。
[0039] 3?引物的设计。在NCBI网站上（网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，分析各 个物种的ACO同源基因序列，然后设计EcACO基因克隆的引物。设计的两端引物为EcACO-F: 5 ' -CAGTTGCACAGAGACATTTCAC-3 ' ；EcAC〇-R: 5 ' -TTACTTTAAGCCGCCGGAGAT-3 '。引物EcACO-F 和引物EcACO-R均购自英潍捷基（上海）贸易有限公司。
[0040] 4.PCR扩增、回收纯化及测序。分别以抗药性稗草的cDNA和敏感性稗草的cDNA为 模板进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为50yL: 1yLcDNA，2yL引物EcACO-F(浓度为 10yM)，2yL引物EcAC〇-R(浓度为 10yM)，25yLTaqPlus2XMasterPCRMix(购自南 京天为生物科技有限公司），20yLddH20(重蒸水）。PCR反应程序为：95°C预变性3min; 94°C变性30s，58°C退火40s，72°C延伸2min，30个循环；72°C延伸lOmin。将PCR扩增后的 产物经1 %琼脂糖电泳回收纯化目的DNA片段，然后将纯化好的DNA片段送交英潍捷基（上 海）贸易有限公司进行DNA双向测序。
[0041] 5.测序结果分析。将测序所得的序列在NCBI网站上进行同源序列比对，序列比对 方法见MolBiolEvol.2〇〇7Nov;24(ll):2433_42 中"Mindthegaps:evidenceofbias inestimatesofmultiplesequencealignments" 部分所述。米用DNAman软件分析基 因的核酸序列和氨基酸序列，具体操作详见DNAman软件说明。将抗药性稗草中的EcACO记 为EcACO-R，其核苷酸序列和氨基酸序列如SEQIDNO: 1和SEQIDNO: 3所示。敏感性稗 草中的EcACO记为EcACO-S，其核苷酸序列和氨基酸序列如SEQIDN0:2和SEQIDN0:4 所示。EcACO-R和EcACO-S的核苷酸序列及氨基酸序列差异比较如图1所示（其中方框 标记为氨基酸突变位点，灰色部分显示为核苷酸突变位点），EcACO-R和EcACO-S的氨基酸 序列存在5个突变位点，即F98 -Y(氨基酸序列中的98位由苯丙氨酸突变为酪氨酸）， G101 -D(氨基酸序列中的101位由甘氨酸突变为天冬氨酸），Q206 -R(氨基酸序列中的 206位由谷氨酰胺突变为精氨酸），G270 -V(氨基酸序列中的270位由甘氨酸突变为缬氨 酸），A272 -G(氨基酸序列中的272位由丙氨酸突变为甘氨酸），与之相对应的碱基突变 为T293 -A(核苷酸序列中的293位由胸腺嘧啶突变为腺嘌呤），G302 -A(核苷酸序列中 的302位由鸟嘌呤突变为腺嘌呤），A617 -G(核苷酸序列中的617位由腺嘌呤突变为鸟嘌 呤），G809 -T(核苷酸序列中的809位由鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶），C815 -G(核苷酸序列 中的815位由胞嘧啶突变为鸟嘌呤）。其中F98 -Y，G101 -D及Q206 -R均处于蛋白保 守结构域DI0X_N和20G-FeII_0xy中，而DI0X_N和20G-FeII_0xy均和Fe2+的氧化有关。
[0042] 实施例2.抗药性稗草和敏感性稗草中的EcACO基因的实时定量PCR分析
[0043] 选取2~3叶