一种重组呼肠孤病毒、其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，特别涉及一种能够表达乙肝表面抗原或抗原表位的重 组呼肠孤病毒、其制备方法及其在制备HBV疫苗中的应用。
【背景技术】
[0002] 我国是乙型肝炎流行区，乙肝表面抗原（HBsAg)携带率平均约10%，全国人群乙型 肝炎感染率更高达60%，由其引起的肝硬化和肝癌更是全世界尚未攻克的难题。目前临床使 用的乙型肝炎疫苗以生物工程生产的HBsAg为抗原，必须肌肉注射激活机体的体液免疫系 统。既不方便也不经济，人们一直期盼口服型乙型肝炎疫苗。美国科学家首先在土豆中成功 表达了 HBsAg，国内学者跟进在水稻中表达HBsAg，试图研发植物型口服乙型肝炎疫苗。但 最终未能通过临床试验的检验，未能成为成熟的产品。
[0003] 呼肠孤病毒是一种双链RNA病毒，具有稳定而裸露的二十面体外壳。通常可存在 于人的呼吸道和胃肠道，并不引起任何已知的疾病，自愿者人体感染实验研究结果也显示 一般呼肠孤病毒感染并无临床症状。正因为呼肠孤病毒的这些生物学特性和生物学上的 相对安全性，使我们尝试改造呼肠孤病毒基因组结构使之成为载体，用于基因治疗和生产 新型疫苗。Roner等成功将CAT(Chloramphenicalacetyltransferase)插入呼肠孤病毒 Sigma-2基因片段，稳定表达Sigma2-CAT炭合蛋白。本项目将利用呼肠孤病毒作为载体研 发口服型HBV疫苗，基本的设想是通过口服表达HBV抗原蛋白的重组呼肠孤病毒，后者感 染肠粘膜后进入淋巴结和血液激发机体的粘膜和体液免疫反应。
[0004] 本发明是利用基因工程技术将编码具有较强免疫原性和抗原性的HBsAg基因插 入呼肠孤病毒的外层或非结构蛋白的基因组，最终经筛选建立稳定复制、稳定表达HBV抗 原的重组病毒株，通过口服重组病毒刺激机体的粘膜和全身体液免疫。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种能够表达乙肝表面抗原或抗原表位的重组呼肠孤病毒、 其制备方法及其在制备HBV疫苗中的应用。
[0006] 本发明的第一个目的提供一种重组呼肠孤病毒，其特征在于所述重组呼肠孤病毒 能够表达乙肝表面抗原或抗原表位。
[0007] 优选的,所述重组呼肠孤病毒逆转录得到的cDNA具有SEQIDN0 :2所示的DNA序 列。
[0008] 本发明的第二个目的提供一种重组呼肠孤病毒的制备方法，其特征在于将编码 HBsAg的124-147位氨基酸(表1)的基因片段克隆入编码呼肠孤病毒的外层蛋白Sigma-3 的DNA (表2)的开放阅读框架中，采用逆向转录系统产生所述的重组呼肠孤病毒，产生表 达HBsAg抗原表位的Sigma3融合蛋白（图la、lb)。
[0009] 表1. HBsAg全长DNA序列，编码226个氨基酸，下划线部分编码"A"决定簇 (110-168)的中和免疫表位（124-147位氨基酸)。
[0010]
[0011] 表2. Sigma3的编码区cDNA序列(下划线部分编码其抗原决定簇）
[0012]
【主权项】
1. 一种重组呼肠孤病毒，其特征在于：所述重组呼肠孤病毒能够表达乙肝表面抗原或 抗原表位。
2. 如权利要求1所述的重组呼肠孤病毒，其特征在于：所述重组呼肠孤病毒逆转录得 到的cDNA具有SEQIDNO : 2所示的DNA序列。
3. -种如权利要求1或2所述的重组呼肠孤病毒的制备方法，其特征在于将编码 HBsAg的124-147位氨基酸的基因片段克隆入编码呼肠孤病毒的外层蛋白Sigma-3的DNA 的开放阅读框架中，采用逆向转录系统产生所述的重组呼肠孤病毒。
4. 一种如权利要求1或2所述的重组呼肠孤病毒的应用，其特征在于：所述重组呼肠 孤病毒用于制备HBV疫苗。
5. -种HBV疫苗，其特征在于：含有如权利要求1或2所述的重组呼肠孤病毒和辅料。
【专利摘要】本发明涉及一种重组呼肠孤病毒，特别涉及一种能够表达乙肝表面抗原或抗原表位的重组呼肠孤病毒、其制备方法及其在制备HBV疫苗中的应用。本发明利用基因工程技术将编码具有较强免疫原性和抗原性的HBsAg的中和表位的DNA插入呼肠孤病毒的外层或非结构蛋白的基因组，最终经筛选建立稳定复制、稳定表达HBV抗原的重组病毒株，与目前使用的肌肉注射型乙型肝炎病毒（HBV）疫苗相比较，口服型疫苗既方便，又经济，更利于推广。
【IPC分类】A61P31-20, A61K39-15, C12N7-01
【公开号】CN104651321
【申请号】CN201310578140
【发明人】孙逸武, 马洪宝
【申请人】孙逸武
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2013年11月18日