专利名称：番鸭细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病二联活疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及番鸭细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病二联活疫苗，属于预防兽医学领域。
背景技术：
番鸭细小病毒病(俗称“三周病”)是1987年在我省首次发生的1-3周龄雏番鸭以喘泻为临床症状的一种新疫病。该病主要侵害7-21日龄的雏番鸭，发病率27-62%和病死率22-43%，病愈鸭大部分成为僵鸭，给番鸭业造成很大经济损失。番鸭呼肠孤病毒病(俗 称“肝白点病”、“花肝病”、“白点病”、“肝脾白点病”和“番鸭坏死性肝炎”等)是1997年以来，在福建省莆田、福清、福州、长乐和浙江金华、广东佛山等地番鸭饲养区发生一种临床上以软脚为主要症状，以肝、脾表面有多量白点、肾脏肿大、出血、表面有黄色条斑为主要病理变化的传染病。该病只发生于番鸭，发病日龄为7 45日龄，以10 30日龄的雏番鸭为最甚。发病率为30 90%，病死率为60 80%，发病未死鸭耐过后成为僵鸭，给番鸭业造成很大经济损失。目前，番鸭细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病仍是严重危害番鸭养殖业的重要传染病，疫苗的免疫接种可有效控制这二种新发疫病，而多次免疫对番鸭群易造成不良的应激反应。为此，本发明在国内外首次研制出番鸭呼肠孤病毒病和番鸭细小病毒病二联活疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供番鸭细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病二联活疫苗，本发明是通过如下技术方案来实现的a、来源于人工致弱的番鸭细小病毒弱毒Pl株(MPV-P1株)，保藏在中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,简称CCTCC),保藏单位CCTCC地址在中国武汉市武汉大学，保藏日2010年6月2日，保藏编号CCTCCN0 :V201013 ；b、来源于人工致弱的番鸭肝白点病(番鸭呼肠孤病毒病)弱毒MWCA株，该毒株保藏在在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中国科学院微生物研究所，保藏日2001年12月18日，保藏编号CGMCC0667 ；将上述的番鸭肝白点病弱毒MWCA株和番鸭细小病毒弱毒Pl株应用于制备番鸭细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病二联活疫苗。与现有技术相比，本发明以番鸭细小病毒弱毒Pl株(MPV-P1株)和番鸭肝白点病弱毒MWCA株(即番鸭呼肠孤病毒弱毒CA株)为种毒，分别应用番鸭胚成纤维细胞和SPF鸡胚成纤维细胞转瓶培养技术增殖病毒，收获细胞毒液，按适当比例混合后加冻干保护剂冷冻干燥，研制成遗传性稳定、安全性好、免疫原性强且成本低的二联活疫苗，在流行番鸭三周病和肝白点病的番鸭养殖地区应用，能达到一次免疫接种即可同时预防和控制这二种疫病的目的，1-2日龄雏番鸭免疫一次即可有效预防番鸭细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病，不仅减少了人力物力，也减少因多次免疫注射对鸭群造成的不良应激反应；本发明适于GMP条件下的大规模生产。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明进一步说明。(但不是对本发明的限制)。a、来源于人工致弱的番鸭细小病毒弱毒Pl株(MPV-P1株)，是利用番鸭胚和番鸭胚成纤维细胞交替传代等生物技术人工选育致弱而成，已失去对一日龄雏番鸭的致病性，并具有如下特性(I)病毒效价=MPV-Pl株对番鸭胚成纤维单层细胞TCID5tl彡10_5°/0. Iml ；(2)安全性用I日龄健康易感雏番鸭10羽，每羽腿部肌肉注射毒种原液0.2毫升，观察20天，应全部存活；(3)免疫原性一日龄健康敏感雏番鸭，腿部肌肉注射O. 2毫升，其最小免疫量为100TCID5(i。MPV-Pl株保藏在CCTCC，保藏日2010年6月2日，保藏编号CCTCCV201013； b来源于人工致弱的番鸭肝白点病(番鸭呼肠孤病毒病)弱毒MWCA株，是利用番鸭胚成纤维细胞和鸡胚成纤维细胞传代诱变选育致弱而成，已失去对一日龄雏番鸭的致病性，并具有如下特性(I)病毒效价=MWCA株对鸡胚成纤维单层细胞TCID5tl彡10_5°/0· Iml ；
(2)安全性用I日龄健康易感雏番鸭10羽，每羽腿部肌肉注射毒种原液O. 2毫升，观察20天，应全部存活；(3)免疫原性一日龄健康易感雏番鸭，腿肌注射O. 2毫升，其最小免疫量为300TCID5Q。该毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，(现名中国普通微生物菌种保藏管理中心，China General Microbiological Culture CollectionCenter，简称CGMCC)，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中国科学院微生物研究所，保藏H 2001年12月18日，保藏编号CGMCC0667。(见已授权中国专利号01144485. 1，授权公告号CN1179751C ;番鸭肝白点病(番鸭呼肠孤病毒病)弱毒MWCA株在该专利文献中也称CGMCCO667 毒株)；将上述的番鸭细小病毒弱毒Pl株和番鸭肝白点病(番鸭呼肠孤病毒病)弱毒MWCA株用于制备番鸭细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病二联活疫苗。上述的番鸭细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病二联活疫苗的具体制备方法如下(I)MPV-Pl株增殖，将MPV-Pl株种毒按培养液量的I %同步接种番鸭胚成纤维细胞(MDEF)，37°C旋转培养至细胞病变达75%以上，收获MPV-Pl细胞毒。(2)MDRV-CA株增殖，将MDRV-CA株种毒接培养液量的I %同步接种SPF鸡胚成纤维细胞(CEF)，37°C旋转培养至细胞病变述75%以上，收获MDRV-CA细胞毒。(3)病毒含量 TCID5tl 测定，MDRV-CA 和 MPV-Pl 的 TCID50 分别彡 1(Γ50/0· Iml 和彡10_4 5/0. Iml以上时，可用于配制疫苗。(5)疫苗配制，将MPV-Pl和MDRV-CA按适当比例混合后加冻干保护剂冷冻干燥而成。使每羽份疫苗中各种成份的病毒含量分别达MDRVCA103·5TCID5tl和MPV-Pl 103°TCID5(I。本发明的疫苗应用于防治番鸭细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病，其免疫学指标测定如下I.无菌检验按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行，无菌生长。2.安全性测定用I日龄健康易感雏番鸭10羽，每羽腿部肌肉注射10倍剂量三联疫苗，观察20天，接种鸭均未见饮食欲和精神异常，且生长发育良好，全部存活。
3.免疫力测定随机取一日龄易感雏番鸭20羽，腿肌接种I羽份二联活疫苗，其中10羽免疫鸭于接种O天、7天、14天、21天、28天、60天、90天、150天、180天连同不免疫对照鸭采血分离血清，供抗MPV-LPAI抗体效价测定；另10羽免疫鸭于接种后7天连同不免疫对照组同时攻击MDRV强毒，观察20天，记录发病死亡情况。结果①一日龄雏番鸭二联苗免疫后5天产生抗体，免疫后7天血清中的抗MPV-LPAI抗体均为22_1以上，能有效抵抗MPV强毒攻击，至免疫后28天达到高峰的抗体水平分别为26_°，随后抗体水平仍雏持在较高水平，并一直持续至免疫后180天，此时已超过番鸭出栏日龄。②一日龄雏番鸭二联苗免疫后7天连同不免疫对照组同时攻击MDRV强毒O. 2ml/羽，对照攻毒鸭的发病率80% (8/10)、死亡率30% (3/10);而免疫攻毒鸭的发病率10% (1/10)、死亡率0%;表明一日龄雏番鸭免疫二联疫苗后7天能有效抵抗MDRV强毒的攻击。③二联疫苗的免疫力测定结果表明，疫苗免疫力良好，免疫产生期7天，免疫持续期为180天以上。一次免疫即可保护雏番鸭安全渡过易感期，达到I次免疫注射可同时预防番鸭细小病毒病(番鸭三周病)和番鸭呼肠孤病毒病(番鸭肝白点病)，不仅减少人力物力财力，也减少因多次免疫注射导致的应激反应。本发明的应用效果评价在曾流行番鸭三周病和番鸭肝白点病的试验鸭场共免疫 注射6500多羽份一日龄雏番鸭，跟踪观察20d，未见免疫鸭出现不良反应；且免疫组番鸭未发生番鸭细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病，成活率达97. 5%以上；而650羽的对照组番鸭均不同程度发生番鸭肝白点病和三周病，成活率仅73%。进一步证明本发明的二联活疫苗安全、有效，可用于临床上预防番鸭呼肠孤病毒病(番鸭肝白点病)和番鸭细小病毒病(番鸭三周病)。
权利要求
1.番鸭细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病二联活疫苗，其特征在于，所述的番鸭细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病二联活疫苗是采用 a、来源于人工致弱的番鸭细小病毒弱毒Pl株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日2010年6月2日，保藏编号CCTCCNO V201013 ； b、来源于人工致弱的番鸭肝白点病弱毒MWCA株，该毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日2001年12月18日，保藏编号CGMCC0667 ； 将上述的番鸭细小病毒弱毒Pl株和番鸭肝白点病弱毒MWCA株用于制备番鸭细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病二联活疫苗。
2.根据权利要求I所述的番鸭细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病二联活疫苗，其特征在于，所述的番鸭细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病二联活疫苗制备方法如下
a.MPV-Pl株增殖，将MPV-Pl株种毒按培养液量的I %同步接种番鸭胚成纤维细胞，37°C旋转培养至细胞病变达75%以上，收获MPV-Pl细胞毒； b MDRV-CA株增殖，将MDRV-CA株种毒按培养液量的I %同步接种SPF鸡胚成纤维细胞，37°C旋转培养至细胞病变达75%以上，收获MDRV-CA细胞毒； c、病毒含量TCID50 测定，MPV-Pl 和 MDRV-CA 的 TCID50 分别彡 1(Γ4 5/0· Iml 和彡ΙΟ-5.0/。· Iml以上时，用于配制疫苗； e.疫苗配制，将MPV-Pl和MDRV-CA按适当比例混合后加冻干保护剂冷冻干燥而成，使每羽份疫苗中各种成份的病毒含量分别达MDRV CA IO3-5TCID50和MPV-Pl 103_°TCID5(I。
3.根据权利要求I或2所述的番鸭呼肠孤病毒病和番鸭细小病毒病二联活疫苗在防治番鸭细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病上的应用。
全文摘要
本发明公开了番鸭细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病二联疫苗的制备及应用，该二联疫苗以番鸭细小病毒弱毒P1株(保藏编号CCTCC V201013)和番鸭肝白点病(番鸭呼肠孤病毒病)弱毒MWCA株(保藏编号CGMCC 0667)为种毒，分别应用番鸭胚成纤维细胞和SPF鸡胚成纤维细胞转瓶培养技术增殖病毒，收获细胞毒液，按适当比例混合后加冻干保护剂冷冻干燥，制成二联活疫苗，在流行番鸭三周病和肝白点病的番鸭养殖地区应用。
文档编号A61K39/295GK102847147SQ201210046139
公开日2013年1月2日 申请日期2012年2月24日 优先权日2012年2月24日
发明者陈少莺, 程晓霞, 林锋强, 陈仕龙, 胡奇林, 林天龙, 程由铨 申请人:福建省农业科学院畜牧兽医研究所