专利名称：草鱼呼肠孤病毒快速检测试纸及其制备、使用方法
技术领域：
本发明涉及养殖病害病原检测技术的改进，具体讲是一种草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)快速检测试纸及其制备、使用方法，属于免疫学和病毒学交叉技术领 域。
背景技术：
草鱼呼肠孤病毒病是草鱼养殖中危害严重的疾病之一，导致很高的草鱼死亡率， 可达70-80 %的死亡率，给草鱼养殖业造成了巨大的损失。该病毒引起的疾病又称为草鱼出 血病，其出血症状常与细菌引起的出血很难鉴别，又鉴于草鱼出血病尚无有效的治疗方法， 因而简便、快速的检测方法尤显重要，以期达到早发现、早预防的目的。快速准确的病毒分 离检测技术已成为学者研究的焦点之一。目前，病毒性草鱼出血病的诊断主要是依靠实验室内对草鱼呼肠孤病毒检测来确 诊，现实验室检测方法有葡萄球菌A蛋白协同凝集试验(杨广智1991)；酶联免疫吸附检 测法(江育林1993)；荧光抗体技术检测法(江育林1993)；斑点免疫印迹检测法(邵健忠 1996)；免疫吸附电镜观察法(袁爱华1990)；逆转录聚合酶链式反应法(王铁辉1997)等。 这些方法，操作程式较为复杂，需要一定的实验室仪器设备，且耗时较长，整个过程需要几 个乃至十几个小时，达不到快速检测的目的。逆转录聚合酶链式反应法灵敏度高，可用于无 症状病鱼的检测，但其高灵敏度易导致假阳性结果；酶联免疫吸附检测法及斑点免疫印迹 检测法，是目前常用的检测方法，但被检组织的内源酶可以对其检测结果产生干扰，导致假 阳性的出现。因此一种适用于水产养殖病害病原的快速、准确、简便、快速、无假阳性的检测 方法的研制势在必行，以期达到早发现、早预防的目的。
发明内容
本发明针对草鱼呼肠孤病毒病严重危害草鱼养殖业的现状，针对水生生物生理特 点，设计发明提供一种能够达到快速、简便、准确检测目的的草鱼呼肠孤病毒快速检测试纸 及其制备、使用方法。本发明的技术方案实现如下草鱼呼肠孤病毒快速检测试纸，其包括保藏号为CCTCC_C201103杂交瘤细胞 所分泌的抗草鱼呼肠孤病毒、胶体金标记的单克隆抗体C(简称金标单抗C)；保藏号为 CCTCC-C201104杂交瘤细胞所分泌的抗草鱼呼肠孤病毒的单克隆抗体D (简称单抗D)和 羊抗小鼠IgG ；适当尺寸的不干胶载体板；其特殊之处在于在该载体板的中间部设有由粘 贴包被有单抗D (又称检测线)和羊抗小鼠IgG (又称质控线)的硝酸纤维膜制成的检测 层；与该层相延续的两端设置吸水纸分别构成加样端吸水层和手持端吸水层；在检测层的 检测线的远端与加样端吸水层交界处，设有载有金标单抗C的玻璃纤维膜，该膜一端部分 设置在加样端吸水层之下，其另一端部分设置在检测层之上。所述的金标单抗C制备
是以公知的胶体金的制备工艺制备胶体金溶液，胶体金的颗粒大小为10-20nm，将 单克隆抗体C加入到上述的胶体金溶液中，慢搅混勻，加入牛血清白蛋白，离心后的沉淀用 含有1-10%牛血清白蛋白和0. 3-3%吐温-20的磷酸盐缓冲液悬起，加入叠氮钠，制成金标 单抗C。所述的载有金标单抗C的玻璃纤维膜的制备将金标单抗C液体，按每平方厘米700-1000 μ 1喷在玻璃纤维膜上，冷冻干燥，40C
保存备用。草鱼呼肠孤病毒快速检测试纸的使用方法将该试纸的加样端吸水层插入或在其 上滴加被检测样品，5-10分钟内在位于检测层上的检测线和质控线处显示红色，即双红线， 表示草鱼呼肠孤病毒阳性和检测试纸有效。所述的检测样品制备的过程是取被检草鱼肾脏加入至离心管中，按质量/体积 1 (5-10) (g/ml)加入0. 01mol/L pH为6_8的磷酸盐缓冲液，用捣碎棒将草鱼肾脏捣碎， 使病毒释放于该离心管液体中，即制成检测样品。本发明草鱼呼肠孤病毒快速检测试纸的检测原理将草鱼呼肠孤病毒快速检测试纸的加样端吸水层插入或在其上滴加由磷酸盐缓 冲液从捣碎的草鱼肾脏提取含有病毒粒子的检测样品，根据夹心免疫层析原理，即由金标 单抗C同检测样品液中的抗原反应，形成由金标单抗C-草鱼呼肠孤病毒复合物，当该复合 物层析至硝酸纤维素膜上预先包被在检测线上的单抗D处时，此处的抗体会识别该复合物 中抗原，反应的结果便形成了金标单抗C+草鱼呼肠孤病毒抗原+单抗D的夹心结构，最终 是单抗C上标记的胶体金颗粒在此固定并累积出现肉眼可见的红色线，未反应的金标单抗 C则仍继续层析前行，当到达点预先包被在质控线羊抗鼠IgG处时，抗体类型为IgG的金标 单抗C被其结合住，从而在此处也出现由胶体金颗粒固定并累积而显现出肉眼可见的红色 线，结果是检测线显示红色表示草鱼呼肠孤病毒阳性；检测线不显示红色，表示草鱼呼肠 孤病毒阴性，即检测样品中不含草鱼呼肠孤病毒或是草鱼呼肠孤病毒含量极低。质控线显 示红色，表示试纸有效；质控线处不显示红色，说明试纸失效，即或是金标抗体C、或是羊抗 鼠IgG失活，检测结果无效。本发明具有以下优点1、本发明的草鱼呼肠孤病毒快速检测试纸，从实际的养殖需要出发，使用时无需 专门设施和操作技术，适合普通养殖户池边检测，应用简单，具有检测快速、简便、准确、灵 敏等特点，并具有较高的稳定性；2、本发明的草鱼呼肠孤病毒快速检测试纸使用方法中，无需加入特殊的裂解液； 只需将草鱼肾脏捣碎即可，与传统病毒提取研磨、离心等方法相比，此方法方便简单，可快 速提取病毒检测。
图1草鱼呼肠孤病毒快速检测试纸示意图；图2草鱼呼肠孤病毒快速检测试纸的检测结果示意图。杂交瘤细胞株GCRV-C，其保藏编号为CCTCC_C201103 ；保藏单位全称及简称中 国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏单位地址湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心；保藏日期2011年1月17日。杂交瘤细胞株GCRV-D，其保藏编号为CCTCC-C201104 ；保藏单位全称及简称中 国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏单位地址湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏 中心；保藏日期2011年1月17日。
具体实施例方式本发明的实施例结合附图进一步描述如下参见图1，2本发明草鱼呼肠孤病毒快速检测试纸，其包括保藏号为 CCTCC-C201103杂交瘤细胞所分泌的抗草鱼呼肠孤病毒、胶体金标记的单克隆抗体C(简 称金标单抗C)；保藏号为CCTCC-C201104杂交瘤细胞所分泌的抗草鱼呼肠孤病毒的单克 隆抗体D (简称单抗D)和羊抗小鼠IgG ；包被有单抗D和羊抗小鼠IgG的硝酸纤维膜；载 有金标单抗C的玻璃纤维膜2 ；带有不干胶的载体板7 (加样端为A，手持端为B)。在带有 不干胶的载体板7的中间部，粘贴包被有单抗D(又称检测线3)和羊抗小鼠IgG(又称质 控线4)的硝酸纤维膜为检测层5 ；与该层相延续的两端设置吸水纸分别构成加样端吸水层 1和手持端吸水层6 ；在检测层5的检测线3的远端与加样端吸水层1交界处，设有载有金 标单抗C的玻璃纤维膜2，该膜一端部分设置在加样端吸水层1之下，其另一端部分设置在 检测层5之上。实施例1.所述的单抗C胶体金标记方法为(1)胶体金的制备10-20nm胶体金颗粒制备，将0.01%氯金酸溶液IOOOml与 0. 1 %柠檬酸钠25-44ml混合，加热至100摄氏度，制成胶体金溶液，该溶液的pH值用 0.2%碳酸钾调至8. 0-8. 4，备用；(2)金标单抗C的制备单抗C浓度为3_5g/L时，IOOml胶体金标记的最适单抗量为120-150 μ 1，按此 比例将单抗C加入到胶体金溶液中，慢搅50-60分钟，加入牛血清白蛋白，4°C过夜；然 后将其在4°C下，17000g离心110-120分钟；取离心沉淀，用含有牛血清白蛋白和 0. 3-3% 吐温-20 的 0. 01mol/L磷酸盐缓冲液(KCLO. 2g，NaCL8. 0g，KH2PO4O. 2g, Na2HPO412H20 2. 9g，蒸馏水1000ml,pH 7. 4)悬起，再加叠氮钠将浓度调至0. 01-0. 03%，即制成金标单抗 C0实施例2.载有金标单抗C的玻璃纤维层块的制备将制成的金标单抗C，按每平方厘米 700-1000 μ 1喷在玻璃纤维膜上，冷冻干燥，4°C保存备用。实施例3.本发明的草鱼呼肠孤病毒快速检测试纸检测层制备方法为辛酸_硫酸铵法提纯 的抗草鱼呼肠孤病毒单抗D冷冻干燥后，制备成3-5mg/ml抗草鱼呼肠孤病毒单抗D液，用 划线机将其划于硝酸纤维素膜上，形成检测线3 ；同样，将羊抗小鼠IgG，制备成l-2mg/ml， 用划线机将其划于硝酸纤维素膜上，形成质控线4。两线相距4-6mm，质控线4近手持端吸 水层6，检测线3近加样端吸水层1，36-37°C烘干。实施例4.
本发明的分别分泌单抗C和D的两株杂交瘤细胞，其制备与选择的方法如下(1)利用草鱼肾细胞系体外扩增草鱼呼肠孤病毒，利用超速离心法纯化病毒。(2)用提纯的草鱼呼肠孤病毒液为抗原，免疫Balb/c小白鼠；(3)将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞的融合，培养得450株杂交瘤细胞；(4)采用间接免疫荧光法筛选出抗草鱼呼肠孤病毒的阳性杂交瘤细胞株；(5)采用有限稀释法对其中20株阳性杂交瘤细胞进行了克隆；(6)通过不同模式金标免疫层析方法选出2株不同的抗草鱼呼肠孤病毒的单抗C 和D，分别作为金标单抗与包被检测线单抗。其具体实验方法为通过间接免疫荧光法选出 抗病毒强阳性的5种单抗，单抗C、单抗E、单抗A、单抗B以及单抗D，金标单抗C与分别以 同浓度、同体积的这5种单抗为包被抗体，同时检测同一草鱼呼肠孤病毒样本，结果单抗D 为包被抗体时，效果最佳(见表1)。因而，选择单抗C作为金标单抗，而单抗D为包被检测 线的单抗。表1不同模式检测草鱼呼肠孤病毒的金标免疫层析结果
权利要求
1.草鱼呼肠孤病毒快速检测试纸，其包括保藏号为CCTCC-C201103杂交瘤细胞所 分泌的抗草鱼呼肠孤病毒、胶体金标记的单克隆抗体C(简称金标单抗C)；保藏号为 CCTCC-C201104杂交瘤细胞所分泌的抗草鱼呼肠孤病毒的单克隆抗体D (简称单抗D)和 羊抗小鼠IgG ；适当尺寸的不干胶载体板；其特征在于在该载体板的中间部设有由粘贴包被有单抗D(又称检测线)和羊抗小鼠 IgG (又称质控线)的硝酸纤维膜制成的检测层；与该层相延续的两端设置吸水纸，分别构 成加样端吸水层和手持端吸水层；在检测层的检测线的远端与加样端吸水层交界处，设有 载有金标单抗C的玻璃纤维膜，该膜一端部分设置在加样端吸水层之下，其另一端部分设 置在检测层之上。
2.根据权利要求1所述草鱼呼肠孤病毒快速检测试纸，其特征在于所述的胶体金标 记的单克隆抗体C，其制备方法如下(1)胶体金的制备以公知的方法，按一定的配比将氯金酸与柠檬酸三钠混合并加热 制备成胶体金溶液，制得的胶体金的颗粒大小为10-20nm ；(2)胶体金标记的单克隆抗体C的制备将单克隆抗体C加入到上述(1)步的胶体金溶 液中，慢搅混勻，加入牛血清白蛋白，离心后的沉淀用含有1-10%牛血清白蛋白和0. 3-3% 吐温-20的磷酸盐缓冲液悬起，加入叠氮钠，制成胶体金标记的单克隆抗体C;(3)载有胶体金标记的单克隆抗体C的玻璃纤维膜的制备将上述(2)步制成的胶体 金标记的单克隆抗体C，按每平方厘米700-1000 μ 1喷在玻璃纤维膜上，冷冻干燥，4°C保存
3.权利要求1所述草鱼呼肠孤病毒快速检测试纸的使用方法，其特征在于将该试纸 的加样端吸水层插入或在其上滴加被检测样品，5-10分钟内在位于检测层上的检测线和质 控线处显示红色，即双红线，表示草鱼呼肠孤病毒阳性和检测试纸有效。
4.根据权利要求3所述草鱼呼肠孤病毒快速检测试纸的使用方法，其特征在于所述 的检测样品制备的过程是取被检草鱼肾脏加入至离心管中，按质量/体积比1 (5-10) (g/ml)加入0. Olmol/LpH为6-8的磷酸盐缓冲液，用捣碎棒将草鱼肾脏捣碎，使病毒释放于 该离心管液体中，即制成检测样品。
全文摘要
一种草鱼呼肠孤病毒快速检测试纸，包括保藏号为CCTCC-C201103杂交瘤细胞所分泌的抗草鱼呼肠孤病毒、胶体金标记的金标单抗C；保藏号为CCTCC-C201104杂交瘤细胞所分泌的抗草鱼呼肠孤病毒的单抗D和羊抗小鼠IgG，不干胶载体板；在该载体板的中间部设有由粘贴包被有单抗D构成检测线和羊抗小鼠IgG构成质控线的硝酸纤维膜制成的检测层；与该层相延续的两端设置吸水纸，分别构成加样端吸水层和手持端吸水层；在检测层的检测线的远端与加样端吸水层交界处，设有载有金标单抗C的玻璃纤维膜，该膜一端部分设置在加样端吸水层之下，其另一端部分设置在检测层之上。该试纸稳定性好，具有简便、快速、准确、灵敏的特点。
文档编号G01N33/558GK102109526SQ20111003935
公开日2011年6月29日 申请日期2011年2月12日 优先权日2011年2月12日
发明者张莉, 杜蓉, 王晓洁 申请人:鲁东大学