单管同时检测四种牛传染病rna病毒的pcr方法
【专利摘要】本发明公开了一种在单个PCR反应管中同时检测四种靶核酸的实时荧光PCR方法，用于检测样品中牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹泻病毒、牛呼肠孤病毒。本方法操作快速、一步完成。另外，本发明还涉及上述PCR方法中所涉及的试剂，用于上述方法的检测试剂盒和该检测试剂盒的制备应用等。
【专利说明】单管同时检测四种牛传染病RNA病毒的PCR方法
【技术领域】
[0001]本发明属于病原体检测领域，具体说，是涉及一种牛常见传染病病原体的多重荧光定量PCR检测方法，更具体地说，涉及一种在同一 PCR管中快速平行地检测四种牛传染病RNA病毒(牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹泻病毒、牛呼肠孤病毒)的荧光定量PCR方法。
【背景技术】
[0002]牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹泻病毒、牛呼肠孤病毒是四种常见的牛传染病病原体。
[0003]牛副流感病毒属于副流感病毒3型(PIV3)，属于RNA病毒，在自然条件下，仅感染牛，病牛及带毒牛是主要的传染源，通过牛间接触传染，也可通过呼吸道感染。此病可导致牛不育。且感染BPIV3的牛常因呼吸道上皮受损而致常见病菌趁虚而入，侵入患病牛的呼吸道，从而引起严重的肺炎，使死亡率大大增加。口蹄疫病毒属于小RNA病毒科，口疮病毒属，传染力强。口蹄疫病毒在病畜的水泡皮内和淋巴液中含毒量最高。排病毒量以在病畜的内唇、舌面水泡或糜烂处，在蹄趾间、蹄上皮部水疱或烂斑处以及乳房处水泡最多。患口蹄疫的牛会出现发热、跛行和在皮肤与皮肤黏膜上出现泡状斑疹等症状。恶性口蹄疫还会导致病畜心脏麻痹并迅速死亡。人一旦受到口蹄疫病毒传染，经过2-18天的潜伏期后突然发病，表现为发烧，口腔干热，唇、齿龈、舌边、颊部、咽部潮红，出现水泡(手指尖、手掌、脚趾)，同时伴有头痛、恶心、呕吐或腹泻，有时可并发心肌炎。牛腹泻病毒为黄病毒科。是一种单股RNA、有囊膜的病毒。病毒可随分泌物和排泄物排出体外。持续感染牛可终生带、排毒，因而是本病传播的重要传染源。本病主要是经口感染，易感动物食入被污染的饲料，饮水而经消化道感染，也可由于吸入由病畜咳嗽、呼吸而排出的带毒飞沫而感染，还可通过胎盘发生垂直感染。病牛表现为体温突然升高到40°C以上，持续2-3天，伴有一过性的白细胞减少。怀孕母牛可能表现为胚胎早期死亡、流产或先天异常。呼肠孤病毒基因组为线形dsRNA，最初从人和动物的呼吸道和肠道分离出来，能够引起牛腹泻等症状。
[0004]现在对牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹泻病毒、牛呼肠孤病毒的检测主要以培养法和免疫学检测为主。培养法检测需要的时间长；灵敏度低，受环境因素影响较大，易出现假阴性；操作烦琐，对操作者技术要求高。免疫学方法相比培养法有了很大进步，但是也容易受到其它因素影响，出现假阳性反应，带来误判的可能。
[0005]实时荧光定量PCR技术具有敏感、快速、 特异性强的优点，适合于病原体的快速准确诊断。该方法主要是在常规PCR基础上添加荧光探针，通过荧光信号积累来实时监测整个PCR的过程，然后利用生成的标准曲线对未知浓度的模板进行定量分析。在PCR反应过程中可以连续不断的检测体系中荧光信号的变化。该方法具有特异性强，而且有效地解决了 PCR污染的问题，自动化程度高，适合于大量的样本检测等特点。目前，实时荧光定量PCR的方法已得到广泛应用。
[0006]畜牧业上的病原体检测需要及时准确，操作方便，一次处理大量样本，以利于疫情的防控；但现有的病原体检测水平尚不能满足此种需要。在同一 PCR管中进行一次反应即可检测几种牲畜常见病病原体，尤其是牛传染病病原体的存在与否，快速给出结果并适用于大型自动化分析仪器以指导下一步防疫工作进行的相关方法和产品目前在市面上实属空缺。
【发明内容】
[0007]针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的之一是提供一种单管同时检测四种牛传染病RNA病毒的PCR方法。本发明的多重荧光PCR检测方法中逆转录与基因扩增一步完成，具有较高的特异性和灵敏度，操作简便，并且可应用在大型自动化检测分析仪器上。
[0008]为实现上述发明目的，本发明首先针对牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹泻病毒、牛呼肠孤病毒这四种病原体设计了互相干扰程度在实时PCR检测中可接受的引物对和探针。引物设计原则为:引物应该非常特异:Tm在58-65°C之间；GC含量在30~80% ;不要有连续相同的碱基，尤其是G超过4个的情况；两条引物的退火温度应该比较接近；避免引物二聚体以及发夹结构等等。探针设计的原则为:Tm比引物高8~10°C ;GC含量在20~80%;G连续必须小于4个；探针不能形成发夹结构或者不能和引物形成二聚体等等。使用杂交探针进行试验时，往往会形成引物-探针二聚体，主要是因为探针可与引物的3’末端杂交，以此为基础，会进一步导致二聚体扩增，从而同目的基因竞争反应的原料，导致反应效率下降。探针由于其本身可以同目的基因结合，且解链温度高于引物，所以它可能作为引物而引发延伸反应，鉴于此，应对探针精心设计，并且将其末端磷酸化以避免延伸反应。
[0009]为排除PCR反应的假阴性，即确定阴性结果不是由于PCR反应失败造成的，还需要选择一个合适的内源参照基因(即内源模板)进行扩增检测。本发明内标所用模板来源于肠杆菌噬菌体MS2 (Genebank FJ799612.1)，并设计相应引物和探针(即RNA内标探针)，加到每一个反应容器中，进行全程监控。
[0010]本发明具体采用的技术方案如下:
[0011]一种在单个PCR反应容器中四重检测核酸提取液中靶核酸的实时定量PCR方法，所述靶核酸来自牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹泻病毒和牛呼肠孤病毒，步骤包括:
[0012](I)分别提取样品中的核酸，获得核酸提取液，为病毒的总RNA ；
[0013](2)在所述单个PCR反应容器中混合核酸提取液、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物对和靶核酸探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中，
[0014]靶核酸引物对包括:
[0015]牛副流感病毒(BPIV):
[0016]BPIV-L:GGA TGT TAT TTG ACG CCA ACA A
[0017]BPIV-R:TCC CTC TAT CGA GTG GAA GAC ACT
[0018]口蹄疫病毒(FMDV):
[0019]FMDV-L:GAACACATTCTTTACACCAGGAT
[0020]FMDV-R: CATTCTTTGCCAATCAACATCAG
[0021]牛腹泻病毒(BVDV):
[0022]BVDV-L: TGGTTCGACGCCTTGGTATA
[0023]BVDV-R: CCCCGCTCAGGTTAAGATGT[0024]牛呼肠孤病毒(REO):
[0025]REO-L: GATCCTGATGTCTTGCGTCTAA
[0026]REO-R: CAGCAGTATTCCCGTCGATAAT
[0027]内对照:
[0028]IC-F-L:CTCGAGAACGCAAGTTC
[0029]IC-F-R:GGTGATTTCACCTCCAGTAT
[0030]靶核酸探针包括:
[0031]牛副流感病毒(BPIV):
[0032]BPIV-P:TTG CGC TTG CAC C
[0033]口蹄疫病毒(FMDV):
[0034]FMDV-P:ACAACCTACCGCCGAGCCAATTC
[0035]牛腹 泻病毒(BVDV):
[0036]BVDV-P: TGGTTCGACGCCTTGGTATA
[0037]牛呼肠孤病毒(REO):
[0038]REO-P:AATTACGTGTGTCAAGGTGACGATGGA
[0039]内标:
[0040]IC-F-P: CACGACAGTGGTCGCTACATA
[0041](3)进行PCR反应，实时检测不同波长的荧光信号；
[0042](4)根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有靶核酸存在于样品中。
[0043]Ct值为扩增产物的荧光信号达到设定的阈值所经历的扩增循环数。此时扩增是呈对数期增长。
[0044]在本发明样品中的核酸系采用磁珠提取法提取，提取样品中的核酸的过程为:向样品加入核酸萃取液(优选核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液(如，Tris-HCl))，保温后加入磁珠，混合均匀后，施加磁场后，弃去其中液体，然后洗涤(优选洗涤两次，更优选其中第一次洗涤所用的洗涤液包含高氯酸钠和乙醇，也更优选其中第二次洗涤所用的洗涤液包含乙醇)，并洗脱(优选洗脱所用的洗脱液包含PH缓冲液(如，Tris-HCl)。
[0045]在本发明提供的荧光PCR方法中，考虑到，当四种牛传染病病毒模板同时扩增时，会竞争酶、引物和探针，对扩增产生影响，因此对整个反应体系和反应条件进行了优化研究。取四种病毒核酸提取液，以前文介绍的相应引物和探针进行荧光PCR共扩增，经优化，本发明荧光PCR体系(即在单个PCR反应容器中)中各组分的浓度为:
[0046]PCR反应体系为:反应体系总体积为60 μ 1，其中各组分的浓度分别为:Tris.HClpH8.310mM ；KC150mM ；MgC125mM ；dNTP0.2mM ；Taq DNA 聚合酶 5U ;M_MLV 反转录酶 150U ；RNasin20U ;各种引物15pM/种；各种荧光探针5pM/种；甘油5% (v/v);各种靶核酸提取液。其中各种把核苷酸提取液浓度为1000IU/mL，用量为Iul。
[0047]各种探针标记有不同的荧光基团，优选荧光基团是FAM，TAMRA, ROX, Cy5, HEX。
[0048]其中，优选的反转录和PCR条件为:
[0049]420C 30 分钟 50°C 2 分钟 94°C 3 分钟
[0050](940C 10 秒 52°C 10 秒 65°C 45 秒)45 个循环[0051]反应结束后，荧光采集FAM、TAMRA, ROX、Cy5和HEX。
[0052]结果分析条件设定:ABI7500荧光仪的基线自动设定，荧光阈值设定在(dR=1000)。
[0053]I) FAM层Ct值>45且HEX层Ct值〈40，则判定为BPIV RNA阴性；
[0054]FAM层Ct值>45且HEX层Ct值≥40，则需要重检；
[0055]FAM层Ct值≥40，则判定为BPIV RNA阳性。
[0056]2) TAMRA 层 Ct 值 >45 且 HEX 层 Ct 值〈40，则判定为 FMDV RNA 阴性；
[0057]TAMRA层Ct值>45且HEX层Ct值≥40，则需要重检；
[0058]TAMRA层Ct值≥45，则判定为FMDV RNA阳性。
[0059]3) Rox层Ct值>45且HEX层Ct值〈40，则判定为BVDV RNA阴性；
[0060]Rox层Ct值>45且HEX层Ct值≥40，则需要重检；
[0061]Rox层Ct值≥45，则判定为BVDV RNA阳性。
[0062]4) Cy5层Ct值>45且HEX层Ct值〈40，则判定为REO RNA阴性；
[0063]Cy5层Ct值>45且HEX层Ct值≥40，则需要重检；
[0064]Cy5层Ct值≥45，则判定为REO RNA阳性。
[0065]本发明的目的之二是提供了一种在单个PCR反应容器中四重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法的检测试剂盒，主要成分如下:
[0066](I)磁珠法提取核酸所需试剂，包括:
[0067]核酸萃取液，优选核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液(如，Tris-HCl)；
[0068]第一次洗涤所用的洗涤液，优选其包含高氯酸钠和乙醇；
[0069]第二次洗涤所用的洗涤液，优选其包含乙醇；和，
[0070]洗脱所用的洗脱液，优选其包含pH缓冲液(如，Tris-HCl)。
[0071 ](2)反转录和荧光PCR反应所需试剂
[0072]反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物对和靶核酸探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同。
[0073]试剂盒中各种探针标记有不同的荧光基团，优选荧光基团是FAM，TAMRA, ROX, Cy5，HEX。
[0074]试剂盒靶核酸引物对包括:
[0075]牛副流感病毒:
[0076]BPIV-L:GGA TGT TAT TTG ACG CCA ACA A
[0077]BPIV-R:TCC CTC TAT CGA GTG GAA GAC ACT
[0078]口蹄疫病毒:
[0079]FMDV-L:GAACACATTCTTTACACCAGGAT
[0080]FMDV-R: CATATCTTTGCCAATCAACATCAG
[0081]牛腹泻病毒:
[0082]BVDV-L: TGGTTCGACGCCTTGGTATA
[0083]BVDV-R: CCCCGCTCAGGTTAAGATGT[0084]牛呼肠孤病毒:
[0085]REO-L: GATCCTGATGTCTTGCGTCTAA
[0086]REO-R: CAGCAGTATTCCCGTCGATAAT
[0087]内对照:
[0088]IC-F-L:CTCGAGAACGCAAGTTC
[0089]IC-F-R:GGTGATTTCACCTCCAGTAT
[0090]靶核酸探针包括:
[0091]牛副流感病毒:
[0092]BPIV-P:TTG CGC TTG CAC C
[0093]口蹄疫病毒:
[0094]FMDV-P:ACAACCTACCGCCGAGCCAATTC
[0095]牛腹泻病毒:
[0096]BVDV-P: TGGTTCGACGCCTTGGTATA
[0097]牛呼肠孤病毒:
[0098]REO-P:AATTACGTGTGTCAAGGTGACGATGGA
[0099]内对照:
[0100]IC-F-P: CACGACAGTGGTCGCTACATA
[0101]试剂盒中每种靶核酸探针在在所述反应体系总体积为60 μ I单个PCR反应容器中的浓度优选5pmol/反应。
[0102]在本文中，所检测的“样品”是潜在可能含有靶核酸或微生物的离体样品。本发明的方法优选仅限于对离体样品的检测，检测的直接结果是靶核酸或微生物的存在性与否。
[0103]在本文中，“单个PCR反应容器”指所述实时PCR方法在技术上是在同一个容器中进行的。在同一个容器中就可以完成PCR扩增和实时检测的步骤，实现对四种病毒靶核酸的检测。
[0104]在本文的实时荧光PCR反应中，Ct值表示每个PCR反应管内荧光信号到达实时荧光PCR仪所默认设定的阈值时所经历的循环数，用作判读结果的指标。在本发明的检测方法中，对于步骤(4)，靶核酸的的Ct值〈45，则这种靶核酸存在于样品中；Ct值>45，则不存在于样品中。
[0105]本发明的有益效果在于:能够单管检测样品中是否存在牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹泻病毒、牛呼肠孤病毒，四种引物/探针无交叉污染及干扰，保证了准确性、可靠性、特异性、灵敏度和重复性，而且可以使用目前常规的市售实时荧光PCR设备完成。
【专利附图】
【附图说明】
[0106] 图1本发明实施例对牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹泻病毒、牛呼肠孤病毒的实时PCR扩增曲线图，图中五种曲线能够清晰区分。
【具体实施方式】
[0107]下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整地说明。
[0108]如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子克隆实验指南》(第三版)(Cold Spring Harbor laboratory Press)、《细胞实验指南》(科学出版社,北京，中国，2001年)、《RNA实验技术手册》(科学出版社，北京，中国，2004年)、《免疫检测技术》(科学出版社，北京，中国，1991)等实验手册所列方法来实施。
[0109]所用的探针、引物委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0110]所用耗材及工具均经过无RNase处理以确保RNA的完整与高纯度。
[0111]牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹泻病毒、牛呼肠孤病毒假病毒颗粒均为本实验室合成并保存；本领域普通技术人员通过常规手段也可获得。
[0112]实施例1
[0113]1、核酸提取
[0114]利用基因工程的技术手段，将牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹泻病毒、牛呼肠孤病毒毒株制成相应的假病毒颗粒，供核酸提取。
[0115]核酸的提取按照常规磁珠提取法进行提取，方法如下:向10 μ I标准样本(假病毒颗粒l*104IU/ml)加入90μ I核酸萃取液(配方及终浓度为:异硫氰酸胍12Μ、乙二胺四乙酸钠(ρΗ8.0) IOmM,吐温-202 % (W/W)、高氯酸钠1.0Μ、乙醇40 % (V/V)、Tris-HCl (ρΗ8.0) IOmM)，于 42°C保温 lOmin，然后加入 10 μ I MagDNA?彳磁珠悬浮液(50mg/mL，购自北京艾比根生物技术有限公司)，振荡混合均匀后，套在磁架上施加磁场，弃去其中液体，然后加入200 μ I洗涤液A(配方及终浓度为:高氯酸钠1Μ、乙醇30% (V/V))，洗涤后弃去洗涤液Α，再加入200 μ I洗涤液B (配方及终浓度为:乙醇70 % (V/V))，洗涤后弃去洗涤液B，最后加入洗脱液 (配方及终浓度为=Tris-HCl (ρΗ8.0) IOmM)，于42°C保温lOmin，吸出并保留液体，即为核酸提取液，为每种病毒的基因组总RNA。
[0116]2、荧光PCR反应体系确定
[0117]通过摸索，确定PCR反应体系中各个组分，尤其是探针和引物的组合浓度。
[0118]2.1引物及探针序列
[0119]本发明中所有引物和探针合成所参照的模板DNA或RNA序列分别为:
[0120]各种病毒及内标所用模板的在Genebank上的编号分别为:
[0121]牛副流感病毒:HQ530159.1
[0122]口蹄疫病毒:AF5110391
[0123]牛腹泻病毒:KC695815.1
[0124]牛呼肠孤病毒:ΑΥ007393.I
[0125]内标基因:FJ799612.1
[0126]以上模板信息本领域技术人员根据Genebank编号均可通过公开途径获知，本发明中不再列出具体序列。
[0127]靶核酸的引物对包括:
[0128]检测牛副流感病毒的引物对:
[0129]BPIV-L:GGA TGT TAT TTG ACG CCA ACA A
[0130]BPIV-R:TCC CTC TAT CGA GTG GAA GAC ACT
[0131]检测口蹄疫病毒的弓丨物对:
[0132]FMDV-L: GAACACATTCTTTACACCAGGAT
[0133]FMDV-R: CATATCTTTGCCAATCAACATCAG[0134]检测牛腹泻病毒的引物对:
[0135]BVDV-L: TGGTTCGACGCCTTGGTATA
[0136]BVDV-R: CCCCGCTCAGGTTAAGATGT
[0137]检测牛呼肠孤病毒的引物对:
[0138]REO-L: GATCCTGATGTCTTGCGTCTAA
[0139]REO-R: CAGCAGTATTCCCGTCGATAAT
[0140]内标引物对:
[0141]IC-F-L:CTCGAGAACGCAAGTTC
[0142]IC-F-R: GGTGATTTCACCTCCAGTAT
[0143]靶核酸探针包括:
[0144]牛副流感病毒探针:
[0145]BPIV-P:TTG CGC TTG CAC C
[0146]口蹄疫病毒探针:
[0147]FMDV-P:ACAACCTACCGCCGAGCCAATTC
[0148]牛腹泻病毒探针: [0149]BVDV-P: TGGTTCGACGCCTTGGTATA
[0150]牛呼肠孤病毒探针:
[0151]REO-P:AATTACGTGTGTCAAGGTGACGATGGA
[0152]内标探针:
[0153]IC-F-P: CACGACAGTGGTCGCTACATA
[0154]2.2突光标记
[0155]在上述探针BPIV-P、FMDV-P、BVDV-P、REO-P和IC-F-P的5’端分别委托合成标记荧光标记FAM、TAMRA, ROX、CY5和HEX，并在3’端标记相应的淬灭基团。
[0156]2.3引物和探针的组合浓度
[0157](I) PCR反应体系总体积为60 μ I，其中各组分的浓度分别为:Tris.HClpH8.310mM ；KC150mM ；MgCl25mM ；dNTP0.2mM ；Taq DNA 聚合酶 5U ;M_MLV 反转录酶 150U ；RNasin20U ;各种引物15pmol/种；各种突光探针5pmol/种；甘油5% (v/v);各种祀核酸提取液。其中各种把核苷酸提取液浓度为1000IU/mL，用量为Iul。
[0158]2.4反转录和PCR条件
[0159]420C 30 分钟 50°C 2 分钟 94°C 3 分钟
[0160](940C 10 秒 52°C 10 秒 65°C 45 秒)45 个循环
[0161]2.5试验结果
[0162]荧光采集FAM、TAMRA, ROX、Cy5 和 HEX。
[0163]结果分析条件设定:ABI7500荧光仪的基线自动设定，荧光阈值设定在(dR=1000)。
[0164]FAM层Ct值大于40，牛副流感病毒(BPIV) RNA阳性。
[0165]TAMRA层Ct值大于45，口蹄疫病毒(FMDV) RNA阳性。
[0166]Rox层Ct值大于45，牛腹泻病毒(BVDV) RNA阳性。
[0167]Cy5层Ct值大于45，牛呼肠孤病毒(REO)RNA阳性。[0168]各种病毒及内标的PCR扩增曲线参见附图1。
[0169]3.荧光定量PCR条件优化结果
[0170]四种假病毒颗粒(104IU/ml)在荧光PCR体系中进行扩增后，
[0171]当引物探针比例为3:1时，BPIV、FMDV、BVDV和REO的Ct值分别为29.18-31.78、28.25-30.86、2433-2563 和 25.84-28.57 ;当引物探针比例为 2:1 时，BPIV、FMDV、BVDV和 REO 的 Ct 值分别为 31.22-33.55,32.06-33.95,25.83-26.25 和 28.98-29.67 ;当引物探针比例为 4:1 时，BPIV、FMDV、BVDV 和 REO 的 Ct 值分别为 32.02-34.68,29.77-31.53、24.83-26.29 和 27.98-30.31。
[0172]实施例2试剂盒特异性检测
[0173]以牛瘟病毒、牛白血病病毒、牛流行热病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹泻病毒、牛呼肠孤病毒等样品的总RNA为模板，采用本实验设计的引物和探针进行实时荧光PCR反应，结果只有牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹泻病毒、牛呼肠孤病毒产生荧光信号，扩增情况参见表1。证明本方法对于牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹泻病毒、牛呼肠孤病毒的检测具有特异性。
[0174]表1单管检测四种牛RNA病毒方法特异性荧光PCR扩增结果
[0175]
【权利要求】
1.在单个PCR反应管中同时检测四种靶核酸的实时荧光PCR方法，所述靶核酸来自牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹泻病毒、牛呼肠孤病毒，同时用RNA内标进行全程监控，步骤主要包括: (1)提取样品中的核酸，获得病毒总核酸提取液； (2)在所述单个PCR反应管中混合核酸提取液、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物对和探针、内标引物对及探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中， 靶核酸引物对包括: 牛副流感病毒:
BPIV-L:GGA TGT TAT TTG ACG CCAACAA
BPIV-R:TCC CTC TAT CGA GTG GAA GAC ACT 口蹄疫病毒:
FMDV-L: GAACACATTCTTTACACCAGGAT
FMDV-R: CATATCTTTGCCAATCAACATCAG 牛腹泻病毒:
BVDV-L: TGGTTCGACGCCTTGGTATA
BVDV-R: CCCCGCTCAGGTTAAGATGT
牛呼肠孤病毒:
REO-L:GATCCTGATGTCTTGCGTCTAA
REO-R:CAGCAGTATTCCCGTCGATAAT
内标:
IC-F-L:CTCGAGAACGCAAGTTC
IC-F-R:GGTGATTTCACCTCCAGTAT
靶核酸探针包括: 牛副流感病毒:
BPIV-P:TTG CGC TTG CAC C
口蹄疫 病毒:
FMDV-P:ACAACCTACCGCCGAGCCAATTC 牛腹泻病毒:
BVDV-P: TGGTTCGACGCCTTGGTATA
牛呼肠孤病毒:
REO-P:AATTACGTGTGTCAAGGTGACGATGGA
内标:
IC-F-P: CACGACAGTGGTCGCTACATA (3)进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光信号； (4)根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有靶核酸存在于样品中。
2.根据权利要求1所述的方法，使用该方法提取样品中的核酸系采用磁珠提取法提取，其特征在于步骤如下:向样品加入核酸萃取液，该核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液Tris-HCl，保温后加入磁珠，混合均匀，施加磁场后，弃去其中液体，然后两次洗涤，第一次洗涤使用包含高氯酸钠和乙醇的洗涤液，第二次洗涤使用包含乙醇的洗涤液，最后采用包含PH缓冲液Tris-HCl洗脱。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:每种靶核酸探针在所述单个PCR反应管中的浓度优选为5pmol/test。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:各种探针标记有不同的荧光基团，优选荧光基团是 FAM，TAMRA, ROX, Cy5, HEX。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于反转录和PCR的条件为: 420C 30分钟50°C 2分钟94°C 3分钟 (940C 10 秒 52°C 10 秒 65°C 45 秒)45 个循环，
荧光采集 FAM，TAMRA, ROX, Cy5, HEX。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于根据荧光检测结果计算出的Ct值判断靶核酸的方法为: 1)FAM层Ct值>45且HEX层Ct值〈40，则判定为BPIV RNA阴性； FAM层Ct值>45且HEX层Ct值<40，则需要重检； FAM层Ct值<40，则判定为BPIV RNA阳性。 2)TAMRA层Ct值>45且HEX层Ct值〈40，则判定为FMDVRNA阴性； TAMRA层Ct值>45且HEX层Ct值<40，则需要重检； TAMRA层Ct值<45，则判定为FMDV RNA阳性。 3)Rox层Ct值>45且HEX层Ct值<40，则判定为BVDV RNA阴性； Rox层Ct值>45且HEX层Ct值〈40，则需要重检； Rox层Ct值<45，则判定为BVDV RNA阳性。 4)Cy5层Ct值>45且HEX层Ct值〈40，则判定为REO RNA阴性； Cy5层Ct值>45且HEX层Ct值<40，则需要重检； Cy5层Ct值< 45，则判定为REO RNA阳性。
7.用于在单个PCR反应管中同时检测四种靶核酸的实时荧光PCR方法的检测试剂盒，主要包括: (1)磁珠提取法所需试剂，包括: 核酸萃取液，包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液Tris-HCl: 第一次洗涤所用的洗涤液，包含高氯酸钠和乙醇； 第二次洗涤所用的洗涤液，包含乙醇； 洗脱所用的洗脱液，包含PH缓冲液Tris-HCl。 (2)PCR反应所需试剂 反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物对和探针、内标引物对及探针，其中所述探针两端标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特诊在于:各种探针标记有不同的荧光基团，优选荧光基团是 FAM，TAMRA, ROX, Cy5, HEX。
9.根据权利要求7所述的试剂盒靶核酸引物对和探针包括:牛副流感病毒:
BPIV-L:GGA TGT TAT TTG ACG CCA ACAA
BPIV-R:TCC CTC TAT CGA GTG GAA GAC ACT 口蹄疫病毒:
FMDV-L:GAACACATTCTTTACACCAGGAT
FMDV-R:CATATCTTTGCCAATCAACATCAG 牛腹泻病毒:
BVDV-L: TGGTTCGACGCCTTGGTATA
BVDV-R: CCCCGCTCAGGTTAAGATGT
牛呼肠孤病毒:
REO-L:GATCCTGATGTCTTGCGTCTAA
REO-R:CAGCAGTATTCCCGTCGATAAT
内标:
IC-F-L:CTCGAGAACGCAAGTTC
IC-F-R:GGTGATTTCACCTCCAGTAT
靶核酸探针包括: 牛副流感病毒:
BPIV-P:TTG CGC TTG CAC C
口蹄疫病毒:.
FMDV-P:ACAACCTACCGCCGAGCCAATTC 牛腹泻病毒:
BVDV-P: TGGTTCGACGCCTTGGTATA
牛呼肠孤病毒:
REO-P:AATTACGTGTGTCAAGGTGACGATGGA
内标:
IC-F-P:CACGACAGTGGTCGCTACATA。
10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特诊在于:每种靶核酸探针在所述单个PCR反应管反应体系总体积为60 μ I中的浓度为5pmol/反应。
【文档编号】G01N21/64GK103468828SQ201310419281
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月16日 优先权日:2013年9月16日
【发明者】王奕江, 曹振国, 齐洁婷, 刘明霞 申请人:上海卓润生物科技有限公司