专利名称：新型鸭呼肠孤病毒病疫苗及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型鸭呼肠孤病毒病疫苗及其在预防新型鸭呼肠孤病毒病上的应用，属于预防兽医学领域。
背景技术：
2005年以来在中国福建、广东和浙江等省番鸭、半番鸭和麻鸭等鸭群发生的一种以肝脏不规则坏死和出血混杂为主要特征的疫病，因其主要病变为肝出血块/斑和坏死点/灶，俗称“鸭出血坏死性肝炎”。该病无明显季节性，各种品种鸭(如番鸭、半番鸭、麻鸭、北京鸭等)均可发生，并有逐年增加的趋势；发病日龄约为3 25日龄，其中以5 10日龄居多，病程5 7d，发病率5% 20%、死亡率2% 15%，日龄愈小或并发感染时其发病率死亡率愈高，给养鸭业造成一定的经济损失。福建省农业科学院畜牧兽医研究所从病毒理化生物学、动物回归试验、基因组特性及分子水平上首次证实鸭出血坏死性肝炎的病原是一种有别于番鸭呼肠孤病毒、禽呼肠孤病毒的病毒-命名为新型鸭呼肠孤病毒(NovelDuck Reovirus, NDRV),至今为止,该病尚无有效的防治方法。
发明内容
本发明目的之一是提供新型鸭呼肠孤病毒病(鸭出血坏死性肝炎)疫苗并将其应用于预防新型鸭呼肠孤病毒病。本发明是通过如下技术方案来实现的首先应用鸭呼肠孤病毒NDRV-JM85株，经尿囊腔接种11日龄番鸭胚增殖病毒，收获含毒尿囊液；或接种番鸭胚成纤维细胞单层，当细胞病变达75%以上时收获细胞毒；将上述病毒适当浓缩并经甲醛灭活后，按适当比例与白油佐剂混匀，制成新型鸭呼肠孤病毒病灭活疫苗然后将上述灭活疫苗应用于预防新型鸭呼肠孤病毒病取灭活疫苗免疫种鸭一次，I. Oml/羽；4周后加强免疫一次，I. Oml/羽。与现有技术比较，本发明的创新点在于本发明通过种鸭免疫提高子代母源抗体水平，使雏鸭在易感日龄能抵抗新型鸭呼肠孤病毒的感染；用上述灭活疫苗免疫开产前的种鸭，IOml/羽，间隔28天加强免疫，使免疫种鸭的子代含有较高母源抗体，种鸭免疫所产的子代雏鸭在15日龄内能够抵抗新型鸭呼肠孤病毒的感染。本发明简便可行、实用性强，为防治新型鸭呼肠孤病毒病(鸭出血坏死性肝炎)提供了一种安全有效的方法。
具体实施例方式以下结合具体实例对本发明进一步说明。(但不是对本发明的限制)。首先应用鸭呼肠孤病毒NDRV-JM85株经尿囊腔接种11日龄番鸭胚增殖病毒，收获含毒尿囊液；或接种番鸭胚成纤维细胞单层，当细胞病变达75%时收获细胞毒；将上述病毒适当浓缩并经甲醛灭活后，按适当比例与白油佐剂混匀，制成新型鸭呼肠孤病毒病灭活疫苗，然后将上述灭活疫苗应用于预防新型鸭呼肠孤病毒病；种鸭免疫及中和抗体取灭活疫苗免疫种鸭一次，IOml/羽；4周后加强免疫一次，IOml/羽。所述的鸭呼肠孤病毒NDRV-JM85株保藏在中国典型培养物保藏中心(China Center for Type CultureCollection,简称CCTCC)，保藏单位CCTCC地址在中国武汉市武汉大学，保藏日2011年7月29 日，保藏编号=CCTCC NO V201127所述的疫苗制备方法具体步骤如下(I)抗原制备将病毒NDRV-JM85株接种MDEF或11日龄的番鸭胚，收获细胞病变达75%的细胞毒或24h后死亡番鸭胚的尿囊液病毒，-20°C冻存。当尿囊液病毒对番鸭胚的ELD5tl彡1(Γ45/0. Iml或细胞毒对MDEF细胞的TCID5tl彡10,/0. Iml时，可用于病毒灭活。将收获的尿囊液或细胞毒，按总体积的O. 06%加入纯甲醛，37°C灭活24h。取灭活后的病毒液接种9日龄SPF鸡胚或11日龄番鸭胚，鸡胚及番鸭胚应全部存活。(2)疫苗制备按I : I的比例加入白油佐剂和灭活的病毒液，搅拌均匀制成油包水型乳剂疫苗。该疫苗无菌检验应无菌生长。实验证明7日龄健康易感番鸭，每羽颈部皮下注射1.0ml的疫苗后，接种鸭应全部存活，采食、饮水、生长发育等均正常；随机剖杀鸭，心、肝、脾等内脏应未见异常。于二免后不同时间(PI 7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天、56天、63天、70天、77天、84天、91天)连同对照鸭采血，测定中和抗体效价。结果表明，种鸭在第二次免疫后7天就有一定的抗体，二免后14天抗体效价上升明显，于二免后28-49天时达到25°，直到91天时抗体水平为2425。雏鸭(免疫种鸭子代)被动保护取二免后种鸭在60天内所产的种蛋，挑选同一时间孵化出壳的一日龄含NDRV母源抗体的番鸭20羽为母源抗体组(A组)；同时设非免疫种鸭子代(无NDRV母源抗体)的I日龄番鸭20羽为非母源抗体组(B组);将A组和B组雏鸭经腿肌注射NDRV强毒05ml/羽，观察21天。并在攻毒后第7天，随机剖杀5羽，观察各器官病变情况。结果A组雏番鸭注射强毒后全部存活，吃料、饮水、精神等方面正常，随机剖杀5羽番鸭的肝、脾等脏器均正常，未见出血坏死等变化。而B组雏番鸭注射强毒后，吃料、饮水减少，精神沉郁，整个观察期对照鸭体重比母源抗体组轻且差异明显，随机剖杀5羽鸭肝、脾均观察到严重的出血坏死斑。结果表明种鸭经两次免疫NDRV灭活苗后，其子代雏鸭能有效抵抗NDRV强毒感染。雏鸭(免疫种鸭子代)母源抗体消长规律取种番鸭二免后60天内所产种蛋，孵化出壳后采血测定雏番鸭NDRV母源抗体消长情况。I日龄雏番鸭NDRV母源抗体较高，中和抗体效价达23 ;之后逐渐下降，在15日龄时还有一定的母源抗体，中和抗体效价为215，在21日龄时母源抗体基本消失。临床应用效果评价在NDRV流行疫区挑选3个种鸭养殖场进行该方法的防制试验。种鸭在开产前两次免疫NDRV灭活苗，所孵化的小鸭跟踪观察30天，试验种鸭及雏鸭都没有出现NDRV感染。而周边未采取以上措施养鸭场不同程度出现雏鸭因发生该病而死亡。进一步证明该方法安全、有效，可用于临床上预防新型鸭呼肠孤病毒病(鸭出血坏死性肝炎)。
权利要求
1.新型鸭呼肠孤病毒病疫苗及应用，其特征在于，首先应用鸭呼肠孤病毒NDRV-JM85株，经尿囊腔接种11日龄番鸭胚增殖病毒，收获含毒尿囊液；或接种番鸭胚成纤维细胞单层，当细胞病变达75%时收获细胞毒；将上述病毒适当浓缩并经甲醛灭活后，按适当比例与白油佐剂混匀，制成新型鸭呼肠孤病毒病灭活疫苗；然后将所述的新型鸭呼肠孤病毒病疫苗应用于预防新型鸭呼肠孤病毒病，具体如下取灭活疫苗免疫种鸭一次，I. Oml/羽；4周后加强免疫一次，I. Oml/羽；所述的鸭呼肠孤病毒NDRV-JM85株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日2011年7月29日，保藏编号CCTCCNO :V201127。
全文摘要
本发明公开了新型鸭呼肠孤病毒病疫苗的制备及应用，首先应用鸭呼肠孤病毒NDRV-JM85株，经尿囊腔接种11日龄番鸭胚增殖病毒，收获含毒尿囊液；或接种番鸭胚成纤维细胞单层，当细胞病变达75％以上时收获细胞毒；将上述病毒适当浓缩并经甲醛灭活后，按适当比例与白油佐剂混匀，制成新型鸭呼肠孤病毒病灭活疫苗；然后将该新型鸭呼肠孤病毒病灭活疫苗应用于预防新型鸭呼肠孤病毒病取灭活疫苗免疫种鸭一次，1.0ml/羽；4周后加强免疫一次，1.0ml/羽。
文档编号A61P31/14GK102631674SQ20121005583
公开日2012年8月15日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者朱小丽, 李兆龙, 林锋强, 王劭, 程晓霞, 陈仕龙, 陈少莺, 黄梅清 申请人:福建省农业科学院畜牧兽医研究所