专利名称：一种草鱼呼肠孤病毒株的s7基因、编码的重组蛋白及其获取方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及一种草鱼呼肠孤病毒株的S7基因、编码 的重组蛋白及其获取方法和应用。
背景技术：
草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)隶属呼肠孤病毒科(Reoviridae) 水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus，ARV) (Franki，1991)，是我国从鱼类分离到的第一个 病毒，直径约70nm，球形颗粒，无囊膜，具双层衣壳，含有11个双链RNA片段，总分子量 15.46X 103kD。根据其基因片段大小，将基因组片段按分子量分为3个组，分别命名为 L1-L3，M4-M6，S7-S11。这11个双链RNA片段可以编码12种多肽，其中有7种结构多肽， 分别命名为VP1-VP7，其余为非结构性多肽，命名为NS1-NS5。由于病毒基因组是分节段 的，所以会造成不同病毒株的复杂性和高度可变性，草鱼出血病病毒目前已经报道了 10多 个分离株，包括 GCRV854、GCRV861、GCRV873、GCRV875、GCRV876、GCRV991、H962、ZV-8802、 GCHV-854 等。草鱼呼肠孤病毒主要侵染草鱼的肝脏、心脏、肌肉、肾脏、脾、鳃、肠道等组织的细 胞，引起草鱼出血病，导致化学药物难于达到治疗效果。当水温在27°C以上时为该病的流行 高峰期，可达80%以上的死亡率，严重地威胁草鱼的养殖生产。在草鱼出血病的免疫预防 中，研究最早并应用最广的是草鱼出血病组织灭活疫苗，但是须含有足够的病毒才能引起 免疫应答，而大剂量又可引起局部或全身的反应，并且所获得的免疫性一般是短暂的，须激 发注射，且疫苗研制受病鱼组织来源的限制，难于大批量生产。与其相比，基因疫苗有一些 明显优点，其抗原蛋白成份单一明确，能够刺激机体产生较强和较持久的免疫应答，并可规 模化生产。
发明内容
本发明的目的在于根据现有的草鱼出血病灭活疫苗中存在的剂量小不足以引起 免疫应答，剂量大又容易引起局部或全身反应，获得的免疫性多为短暂，需多次注射，且原 材料来源受限等问题，提供一种可作为基因工程疫苗的草鱼呼肠孤病毒株的S7基因。本发明另一目的在于提供上述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因编码的重组蛋白。本发明另一目的在于提供含有上述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因的重组表达载 体。本发明另一目的在于提供含有上述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因的重组菌株。本发明另一目的在于提供上述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因编码的重组蛋白的获 取方法。本发明还有一个目的在于提供上述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因及其编码的重组 蛋白的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现本发明所选择的草鱼呼肠孤病毒株GCRVGD108，采自广东省水产养殖场。将从病 鱼体上分离的病毒感染草鱼成纤维细胞，提取病毒RNA，以其为模板进行RT-PCR扩增，得 到1500bp的特异条带，切胶回收目的条带并连接到PMD19-T载体，并连接转化大肠杆菌 (E. coli) DH5 α，挑选阳性重组克隆。本发明通过对以上重组克隆进行序列测定，得到草鱼呼肠孤病毒株GCRVGD108的 S7基因的序列，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0:1所示，并通过基因工程方法表达出重组蛋白， 其氨基酸序列如SEQ ID Ν0:2所示。新基因编码512个氨基酸，等电点5. 08，分子量为 56.03kD。本发明通过设计了一对含有限制性内切酶酶切位点的引物，将草鱼呼肠孤病毒株 GCRVGD108的S7基因用PCR方法从T载体上扩增出来，克隆到原核表达载体pET30c上，构 建原核表达质粒PET-S7并将其转化到大肠杆菌BL21 (DE3)。此表达载体(pET_S7)以T7为 启动子，重组蛋白以包涵体的形式在大肠杆菌中表达，载体pET30c上有6XHis结构，便于 利用固定化金属配体亲和层析进行纯化。通过对培养时间，诱导时间，温度等条件的摸索和 优化，S7融合蛋白的表达量可以达到10mg/L。本发明还优化了 S7蛋白的纯化条件，表达产物的超声裂解液经Ni2+Chelating Sepharose亲和色谱层析，得到纯度较高的融合蛋白。本发明还通过间接Elisa法检测重组蛋白与草鱼抗GCRVGD108株抗体的结合反 应，显示该蛋白具有较强的抗原性。与现有技术相比，本发明具有如下效果本发明获得的重组蛋白对草鱼出血病具有较好的免疫效果。健康草鱼经S7重组 蛋白免疫后，用草鱼呼肠孤病毒株GCRV-GD108进行攻毒试验，相对成活率达70%以上。
图1为RNA提取结果，其中，1为GCRVGD108的RNA条带，M为markerIII ；图2为RT-PCR扩增结果，其中，1为GCRV⑶108的RT-PCR产物，M为marker III ；图3为pET-S7表达载体构建及酶切鉴定图，其中，1为pET30c_S7，2为pET-S7BamH I 单酶切，3 为 pET30c-S7Xho I 单酶切，4 为 pET_S7BamH I/Xho I 双酶切；图4为诱导表达图，其中，M为低分子量标准蛋白marker，1为空载pET ；2为未诱 导pET-S7 ；3为诱导后PET-S7 ；4为pET_S7上清；5为pET_S7沉淀；图5为重组蛋白过柱纯化图，其中，M为低分子量标准蛋白marker ；1为pET空质 粒；2为pET-S7未诱导；3为pET-S7诱导超声破碎上清；4为pET_S7诱导超声破碎沉淀；5 为蛋白过柱流通液；6为Elute Buffer流通液。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1草鱼呼肠孤病毒株GCRVGD108RNA的提取和RT-PCR扩增病毒RNA的提取和cDNA的合成草鱼成纤维细胞接种病毒7d后，细胞反复冻融2 3次，4°C，4000rpm,离心30min，取上清再以30，OOOrpm超高速离心沉淀病毒，然后用 Trizol试剂提取病毒dsRNA，步骤参见Trizol说明书。提取的dsRNA经SDS-PAGE电泳检 测可见清晰的11条带。利用“anchor primer”反转录合成cDNA(Maan et al，2007)，然后 利用S7特异引物进行扩增。 每20 μ 1 PCR反应体系中加入3 μ 1 cDNA单链作为模板，PCR扩增，电泳检测，发 现在约1540bp处出现预期的特异性扩增带，回收此带(图1 2)。PCR反应体系
权利要求
一种草鱼呼肠孤病毒株的S7基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.权利要求1所述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因编码的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2 所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体是将权利要求1所述草鱼呼肠孤 病毒株的S7基因克隆到原核表达载体pET30c上得到。
4.一种重组株，其特征在于所述重组株是将权利要求3所述重组表达载体转化至大肠 杆菌BL21中得到。
5.权利要求2所述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因编码的重组蛋白的获取方法，其特征在 于包括如下步骤将草鱼呼肠孤病毒株的S7基因克隆到原核表达载体pET30c上，得到重组 表达载体PET-S7，转化至大肠杆菌BL21中，经诱导表达，得到草鱼呼肠孤病毒株的S7基因 编码的重组蛋白。
6.根据权利要求5所述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因编码的重组蛋白的获取方法，其特 征在于所述诱导为IPTG诱导。
7.根据权利要求5所述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因编码的重组蛋白的获取方法，其特 征在于所述诱导表达后，所述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因编码的重组蛋白以包涵体的形 式表达。
8.权利 要求1所述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因在防治草鱼出血病中的应用。
9.根据权利要求8所述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因的应用，其特征在于所述草鱼呼肠 孤病毒株的S7基因作为基因疫苗，通过重组表达获得重组蛋白，用于防治草鱼出血病。
10.权利要求2所述草鱼呼肠孤病毒株的S7基因编码的重组蛋白在防治草鱼出血病中 的应用。
全文摘要
本发明公开了一种草鱼呼肠孤病毒株的S7基因、编码的重组蛋白及其获取方法和应用。本发明草鱼呼肠孤病毒株的S7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，该核苷酸序列编码的重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。将本发明草鱼呼肠孤病毒株的S7基因克隆到原核表达载体上，构建重组表达载体，转化至大肠杆菌中，经诱导表达，所得蛋白为草鱼呼肠孤病毒株的S7基因编码的重组蛋白。该蛋白对草鱼出血病具有较好的免疫保护作用。
文档编号C12N15/46GK101979581SQ20101050586
公开日2011年2月23日 申请日期2010年10月12日 优先权日2010年10月12日
发明者叶星, 江小燕, 田园园, 白俊杰, 白岳强, 迟妍妍, 邓国成 申请人:中国水产科学研究院珠江水产研究所