一种利用溶氧参数控制毕赤酵母发酵生产抗菌肽的方法

专利名称：一种利用溶氧参数控制毕赤酵母发酵生产抗菌肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用溶氧参数控制毕赤酵母发酵生产抗菌肽的方法，属于生物工 程技术领域。
背景技术：
抗菌肽(antibacterial peptides, ABP)是多细胞真核生物在外源性病原体诱导 条件下，其先天免疫系统产生的一类防御性肽类活性物质，其分子质量一般在2-5ku。与传 统抗生素相比，抗菌肽不易使细菌产生耐药性。近年来，以酵母为基因工程受体菌的研究引起人们的重视，酵母具有比大肠杆菌 更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力，并且不会产生内毒素， 是基因工程中良好的真核基因受体菌。自1978年Hirmen等首先试验酵母转化成功后，已 有人干扰素基因、乙型肝炎表面抗原基因、α-淀粉酶基因等数十种外源基因在酵母中获得 表达。国内研究者大量研究表明，利用酵母表达抗菌肽是一条可行的道路，如能在表达产率 上得到进一步提高，将为抗菌肽早日进入临床应用奠定良好的基础。南京农业大学的申艳敏、张素芳等系统研究了各种抗菌肽的构建并通过体外药 敏试验进行了活性的初步判断，得到了有意义的几种抗菌肽。本专利中的抗菌肽以其中 的LL-37为例，具体构建过程为根据GenBank CAA86115中的LL-37氨基酸序列，选择毕 赤酵母偏好密码子，采用SOE-PCR方法合成基因。所合成的LL-37基因全长为141bp，并 在其N端引入kex2裂解位点，以保证表达抗菌肽具有天然N端。基因克隆入pPICZa-A质 粒，构建出分泌型重组酵母表达载体pPICZa-A-LL-37。表达载体经SacI酶切线性化后电 转化导入毕赤酵母菌株X-33，在博来霉素抗性固体平板上长出酵母单菌落后，提取酵母基 因组，进行PCR阳性鉴定，再进一步使用摇床进行发酵，取上清液进行药敏试验，结果发现， 抗菌肽对指示菌株金黄色葡萄球菌Cowan I (Staphylococcus aureus)、致病性大肠杆菌 K99 (Enteropathogenic E. coli)和鸡白痢沙门氏茵(Salmonella pullorum)的最小抑菌浓 度(Minimal InhibitoryConcentration, MIC)分另Ij 为 1. 56 μ g/mL, 3. 12 μ g/mL, 1. 56 μ g/
mLo由于在实际农业生产中，畜禽养殖规模大，发病病原体种类多，发病季节频繁，摇 瓶发酵无法满足养殖需要，这成为制约抗菌肽进入实际应用的最大障碍。因此，该发明对抗 菌肽早日实现发酵罐生产具有重要的指导意义。中国专利申请CN101270339(申请号:200710027210.x)公开了一种分泌表达蛋
白酶的酵母菌培养方法，其特征在于采用无机盐培养基对重组甲醇营养型酵母进行发酵培 养，发酵培养包括酵母菌的生长期和蛋白酶的分泌表达期，在蛋白酶的分泌表达期内根据 发酵液溶氧值变化实时控制甲醇的流加补料，用氨水调节发酵液PH值，从而实现蛋白酶的 高效表达。该方法需要根据酵母菌所处的不同生长时期，根据溶氧的变化来对酵母的生长 进行调控。在目前公布的与抗菌肽有关的专利中，主要侧重点均集中在以下三个方面1、各类抗菌肽基因的构建、电转、鉴定和筛选的分子生物学过程；2、抗菌肽的人工化学合成以及天 然抗菌肽的化学提取法；3、抗菌肽作为杀虫剂、饲料添加剂以及各类昆虫抗菌肽有效成分 的深加工和应用。鲜有报道发酵过程规律和利用参数反馈进行过程控制的专利，同时到目 前为止，国内没有抗菌肽LL-37基因工程酵母菌的发酵生产方法。

发明内容
本发明提供一种利用溶氧参数指导毕赤酵母发酵生产抗菌肽的方法。发明概述本发明根据发酵开始后培养基的溶氧变化判断诱导开始和诱导继续的时间点，最 大程度地减少了甲醇的使用量，在保证足够抑菌活性的同时也最大程度地缩短了发酵周 期。本发明使用的培养基采用了最简单的制备工序和最简单的合理配方，在保证营养成分 满足毕赤酵母的同时也降低了大规模生产的成本。发明详述本发明的技术方案如下一种利用溶氧参数控制毕赤酵母发酵抗菌肽的生产方法，其特征在于，步骤如 下(1)向发酵罐中加入培养基，实消并冷却后，调节发酵温度为27 30°C，在通气量 为0. 3 1. 5vvm、搅拌速度为250 400rpm的条件下，标定溶氧(DO)的百分点，得到发酵
培养基；(2)将活化后的基因酵母菌株接种于发酵培养基中，接种量为10% (ν/ν)，同时标 记为O点，开始发酵，发酵条件为通气量为0. 3 1. 5vvm、搅拌速度为100 400rpm、罐压 为 0. 02 0. IMPa ；(3)当DO值由10%以下上升至50%以上时，开始流加甲醇至DO值回落至10% 30%，停止流加甲醇，当DO值再次稳定升高至50%以上时，再次开始流加甲醇至DO值回落 至10% 30 %，停止流加甲醇，循环操作，通过流加甲醇、调节通风和转速控制DO值始终维 持在10% 30% ；(4)当流加甲醇后DO值不再回落时，发酵结束。所述步骤(1)中的培养基为0. 5%甲醇的BMMY培养基或甘油的BMGY培养基。所述步骤(2)的活化，采用如下方法将基因工程酵母菌在含有博莱霉素抗性的YPDS液体培养基进行摇床活化，培养 条件为28 30°C，100 200rpm，培养20 26小时，以OD65tl不超过4为限度。所述的含有博莱霉素抗性的YPDS液体培养基组分如下酵母浸粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L、山梨糖醇lmol/L、博来霉素25ug/ ml ο所述步骤(3)中流加甲醇的量为培养基中甲醇终浓度不超过0.2% (ν/ν) 0所述步骤(3)中循环操作的次数为3 6次。所述步骤(3)中流加甲醇时DO值回落至大于30%时，通过降低搅拌转速和/或降 低通风量来调节DO值，但通风量不低于0. 3vvm ；DO值回落至小于10%时，通过提高搅拌转 速和/或提高通风量来调节DO值。
所述的基因酵母菌株可采用市售毕氏酵母，按现有技术或毕氏酵母使用说明书将 目的基因导入毕氏酵母中获得。本发明有益效果如下1、本发明通过调节搅拌转速、通风量和流加甲醇来控制DO值长期在一个区间内 运行，相比传统溶氧值调控，更易于操作，条件易于掌握。2、本发明与传统方法相比，省略了使用氨水作为氮源和调节pH的步骤，在BMGY培 养和BMMY转换培养中任由其自由变化，通过趋势变化了解不同碳源引起的菌体生长速度 的不同和判断菌体处于好氧或厌氧阶段。3、本方法便于操作，现象明显。使用BMGY培养基富集菌体阶段，若溶氧一直在低 位运行，则PH会持续下降，例如从发酵初始阶段的pH6. 0可以下降到pH4. 8，溶氧反弹时，pH 亦趋步上升。使用BMMY诱导成功后，由于抗菌肽是碱性蛋白，pH也会保持平稳或非常缓慢 的上升，但决不会下降。大型发酵生产中通过趋势的重复性观察可以增强生产人员的信心。4、本发明所述方法发酵周期短，甲醇用量少。实际发酵过程中，在发酵到36小时 后，就会检测到有活性，此时甲醇用量约1 % 2%。


图1抗菌肽LL-37 tricine-SDS-PAGE电泳图片。Ml、超低分子量蛋白Marker ；M2、 低分子量蛋白Marker ；UpPICZa-A阴性对照；2、抗菌肽LL-37。图2本发明工艺得到的抗菌肽LL-37对野毒大肠杆菌的抑制作用图片。1、发酵22 小时抑菌圈大小；2、发酵24小时抑菌圈大小；3、发酵26小时抑菌圈大小；4、发酵28小时 抑菌圈大小；5、发酵30小时抑菌圈大小；6、发酵32小时抑菌圈大小；7、发酵34小时抑菌 圈大小；8、发酵36小时抑菌圈大小；constrast为4000U/ml的氨苄青霉素。图3固定溶氧值8%得到的抗菌肽LL-37对野毒大肠杆菌的抑制作用图片。1、发 酵22小时抑菌圈大小；2、发酵26小时抑菌圈大小；3、发酵30小时抑菌圈大小；4、发酵34 小时抑菌圈大小；5、发酵38小时抑菌圈大小；6、发酵42小时抑菌圈大小；7、发酵46小时 抑菌圈大小；8、发酵50小时抑菌圈大小；9、发酵52小时抑菌圈大小；constrast为4000U/ ml的氨苄青霉素。图4固定溶氧值40%得到的抗菌肽LL-37对野毒大肠杆菌的抑制作用图片。1、发 酵14小时抑菌圈大小；2、发酵16小时抑菌圈大小；3、发酵18小时抑菌圈大小；4、发酵20 小时抑菌圈大小；5、发酵22小时抑菌圈大小；6、发酵24小时抑菌圈大小；7、发酵26小时 抑菌圈大小；8、发酵28小时抑菌圈大小；9、发酵30小时抑菌圈大小constrast为4000U/
ml的氨苄青霉素。图5是对照例得到的抗菌肽LL-37对野毒大肠杆菌的抑制作用图片。其中，9. 80是30小时取样抑菌圈大小；33、44、49、53分别为33小时、44小时、49 小时、53小时取样抑菌圈大小；
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明所保护范围不限于此。实验试剂说明
每升1 %甘油的BMGY培养基中含有如下组分磷酸二氢钾10. 941g、磷酸氢二钾缓4. 473g、酵母浸粉10g、蛋白胨20g、甘油10ml、 YNB 3. 4g、硫酸铵 IOg ；每升0. 5%甲醇的BMMY培养基中含有如下组分磷酸二氢钾10. 941g、磷酸氢二钾缓4. 473g、酵母浸粉10g、蛋白胨20g、YNB 3. 4g、 硫酸铵10g，甲醇5ml ；上述YNB为市售产品，也可采用如下自配有机物溶液和自配无机盐溶液替代，自 配有机物溶液，每IL培养基中需添加如下组分①硫胺素盐酸盐Img②核黄素2mg③吡哆醇盐酸盐Img④尼克酰胺6mg⑤泛酸钙IOmg⑥生物素40 μ g⑦叶酸40 μ g⑧对氨基苯甲酸Img⑨肌醇2mg以上有机物混合物使用自来水配制，然后无菌条件下0. 22um微滤一遍即可使用；自配无机盐溶液，每IL培养基中需添加如下组分①硫酸锰(MnSO4· H2O)IOmg②硫酸锌(ZnSO4)IOmg③硫酸铜(CuSO4· 7H20) Img④碘化钠(NaI)320 μ g⑤钼酸钠(Na2MoSO4· 2H20) 800 μ g⑥硫酸亚铁(FeSO4· 7H20) IOmg⑦硼酸(H3BO3)80 μ g⑧硫酸铵((NH4)2SO4)IOg以上无机盐混合物使用自来水配制，然后无菌条件的0. 22um微滤一遍即可使用；含有博莱霉素抗性的YPDS液体培养基组分如下酵母浸粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L、山梨糖醇lmol/L、博来霉素25ug/ ml ο实施例中的基因酵母菌株采用如下方法构建1、抗菌肽基因设计与合成根据抗菌肽的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，利用DNA Star, primer premier5. 0软件设计了 4个基因片段F1、RU F2和R2。Fl和Rl的3，端、Rl和F2的 5，端、F2和R2的3，端分别有21bp的互补序列，符合gene SOEing(gene splicing by overlapextension)的要求。序列如下
Xha I Kex2Fl :5，-GCT 歡知 TTGTTGGGTGACTTCTTCAGAAAGTCCAAGGAAA-3，，
Rl 5，-CTGGACGATTCTCTTGAACTCCTTACCGATCTTTTCCTTGGACTTTCTGAAGA-3，，F2 :5’ -GAGTTCAAGAGAATCGTCCAGAGAATCAAGGACTTCTTGAGGAACTTGGTC-3，，R2 5 ’ -ACT 姐!，TCATTGGGATTCAGTTCTTGGGACCAAGTTCCTCAAGAAGTC-3 ’。
Xba I四条引物中，Fl含49bp, Rl含53bp, F2和R2各含51bp,由Invitrogen上海分公 司合成。2. PCR 扩增四条引物两两互为模板、引物，反应体系(50ul) 10XPCR Buffer 5uL， MgCl2 (25mmol/L) 3uL, dNTPs (lOmmol/L) luL，Fl、Rl、F2 和 R2(10pmol/L)各 luL,Taq 0. 5uL, ddH20 36. 5uL。混勻，离心。为了保证SOE合成的特异性，采用(touchdown，TD)PCR技术进 行优化(具体步骤可参见申艳敏，魏建超，尚书文等.《人源抗菌肽LL-37在毕赤酵母中的 高效表达及其活性检测》.微生物学通报，2008. 35 (4) :539-544)。94°C 30s，退火温度从 65°C降至50°C，每循环1分钟，每一个循环降低0. 5°C，72°C 45s，共30个循环后温度降至 50°C，再在最适退火温度52°C的条件下进行15个循环。最后72°C延伸7min，取TD-PCR产 物2. OuL, 1. 5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下观察并记录拍照。3、重组酵母表达载体的构建PCR产物和pPICZ alpha-A (invitrogen公司上海分公司)均用XHol、XbaI双酶 切，T4 DNA连接酶连接连接，连接产物转化E. coli DH5alpha，重组表达质粒进行PCR、缺失 酶切位点鉴定。缺失酶切位点鉴定阳性的质粒送Invitrogen上海分公司测序。构建正确 的重组表达质粒命名为pPICZalpha-A-LL-37。4、X-33及Mut+转化子的筛选和鉴定^ ^ S Pichia pastoris X-33 (Mut+) 80ul 与 SacI _ 个生 it pPICZalpha-A-LL-37 (5ug)相混合，置冰上5min，转移至预冷的0. 2cm电转杯(Bio-Rad) 中，1. 5KV、25yF、200Q电击，立即加入Iml预冷的lmol/L山梨醇，取200 μ L涂布于YPDS 平板上，30°C培养至单菌落出现。详细步骤参见毕氏酵母产品使用说明书一《毕氏酵母表达 手册》(((PichiaExpression Kit)))。采用PCR方法分析P. pastoris转化子，用煮_冻-煮 法制备PCR模板，以PI、R2为引物，其中Pl为鉴定阳性转化子的毕赤酵母两条通用引物之 一，其序列为 5，-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3，(SEQ ID N0. 6)，反应体系同上，PCR 反应条 件94°C 5min ；94°C 45s, 48°C 45s, 72°C 45s，25 个循环；72°C 6min。以能扩增出 467bp 的 克隆定为阳性转化子。实施例一种利用溶氧参数控制毕赤酵母发酵抗菌肽的生产方法，步骤如下1)基因酵母菌株的活化将基因酵母菌株在含有博莱霉素抗性的YPDS液体培养基进行摇床活化，培养条 件为28 30°C，100 200rpm，培养24小时，以OD65tl不超过4为限度；2)基因酵母菌株的富集将上述活化后的基因酵母菌株以体积百分比2%的接种量接入到BMGY培养基中， 在摇床中进行菌体的富集，培养条件为28 30°C，150 200rpm，培养过夜即可，培养结束 后，得种子液，等待接种使用，或放置于冰箱4度存放，但不可超过三天；
3)发酵罐的准备进行发酵罐清洗、空消、管路连接和各个电极的校正工作；4)发酵开始以及过程控制将配好的甘油的BMGY培养基在IOL机械搅拌通风发酵罐中进行实消，冷却 后加入YNB溶液，设置发酵需要的温度28 29°C，此时标定溶氧(DO)的百分点(0. 3vvm， 300rpm)。以无菌方式将种子液接入上述发酵罐中，接种量为10% (ν/ν)，此时发酵开始，记 为0点，软件记录各参数历史数据。 发酵开始后从控制面板上可以看到的明显变化是DO呈现快速下降趋势，在4个小 时之内，由开始时的100%快速下降到10%以下(若菌体在4°C冰箱中储存时间较长，则DO 下降趋势缓和，但同样会在4小时之内下降到10%以下)，此阶段保持0. 3vvm的空气通风 量，转速在80 200rpm,罐压0. 02 0. IMPa0当溶氧历史曲线持续一段时间的走低并平衡后，在1.5小时时DO值会快速反弹， 并在10分钟之内最大反弹到80%。此时发酵罐设备的补料泵以最小速度8ml/小时流加甲 醇，每启动一波甲醇流加，其甲醇流加的最大终浓度为1%，流加过程和流加结束后注意观 察溶氧曲线的走向，一般正常情况下，此时溶氧开始缓慢下降并在某一个数据点附近企稳， 企稳后DO有以下3种可能状态a DO彡30%，则适当降低搅拌转速，若转速已经调低而DO依旧不能降到30%以 下，则降低通风量，但不能低于0. Ivvm ；b. 10%<D0< 30%，不进行任何操作，等待溶氧曲线的下一波升高；c. DO彡10%，则适当提高转速，若转速已经上调达到标定溶氧百分点时的数值， 则适当提高通风量。当第一波DO历史曲线企稳后，会出现上述状态b或者状态C，而状态a较少出现。发酵过程继续进行，进行4小时后，发现溶氧曲线会再次走出10% 30%的区间， 并持续走高(在实际发酵过程中，DO不会稳定在狭窄的区间内，应根据实际情况判断溶氧 曲线是否已经在持续走高，例如已经走高超出50%，并不再回落)，此时启动第二波的甲醇 流加，同样，本次流加的甲醇终浓度不能高于5%，缓慢流加过程中注意观察溶氧曲线的变 化，操作同上。经过两波甲醇流加后，溶氧曲线不再回落，在原标定条件甚至通风和搅拌转速均 减半的条件下，溶氧曲线仍居高不下，标志着发酵生产的结束，此时发酵约30 34小时，药 敏定性试验发现发酵液有活性，且较稳定。见图2。经tricine-SDS-PAG电泳，得到一条4. 5KD的条带，如图1所示，具有如下氨基酸 序列L-L-G-D-F-F-R-K-S-K-E-K-I-G-K-E-F-K-R-I-V-Q-R-I-K-D-F-L-R-N-L-V-P-R-T -E-S (SEQ ID NO. 1)，即为抗菌肽 LL-37。溶氧控制区间探索试验低溶氧方案溶氧值控制在8%左右，加甲醇时间点、罐压、温度、接种量与具体实时方式同步骤 4)。直到发酵进行46小时，药敏试验才发现有较明显的抑菌圈。见图3。高溶氧方案
溶氧值控制在40%左右，加甲醇时间点、罐压、温度、接种量与具体实时方式4) 同。发酵只需24小时，药敏试验就发现有较明显的抑菌圈。继续进行下去，30小时时活性 消失。见图4。使用本专利中介绍的方法进行发酵，进行到30小时左右时，即可使用药敏试验定 性检测到抗菌肽的活性，通常情况下，使用真空旋蒸原理的设备进行浓缩4 5倍，可以使 原发酵液的活性得到增强。经计算，每100L发酵液的生产成本约为70元左右，远远低于现有技术的200元。对照实验根据中国专利申请CN101270339(申请号200710027210.x)的记载，按照溶氧波 动曲线进行诱导生产抗菌肽的方法，步骤如下1)基因酵母菌株的活化将基因酵母菌株在含有博莱霉素抗性的YPDS液体培养基进行摇床活化，培养条 件为28 30°C，100 200rpm，培养24小时，以OD65tl不超过4为限度；2)基因酵母菌株的富集将以上YPDS菌株以2% (ν/ν)的接种量接入到BMGY培养基中，在摇床中进行菌体 的富集，培养条件为28 30°C，150 200rpm，培养过夜。3)发酵罐的准备进行发酵罐清洗、空消、管路连接和各个电极的校正工作；4)发酵开始以及过程控制将配好的甘油的BMGY培养基在IOL机械搅拌通风发酵罐中进行实消，冷却 后加入YNB溶液，设置发酵需要的温度28 29°C，此时标定溶氧(DO)的百分点(0. 2vvm， 300rpm)。以无菌方式将种子液接入上述发酵罐中，接种量为10% (ν/ν)，此时发酵开始，记 为0点，软件记录各参数历史数据。发酵开始后从控制面板上可以看到，发酵进行到7小时后，实测溶氧值在0. 3%到 1 %左右浮动，并在此位置持续到发酵24小时左右，然后开始反弹，并在10分钟之内最大可 以反弹到80%。此时发酵罐设备的补料泵以8ml/小时的速度流加甲醇，并密切关注溶氧， 待溶氧下跌到10%后，停止流加甲醇，统计甲醇用量为50ml，密切关注溶氧，发现溶氧继续 下跌，直到2%左右，并在此稳定到40小时，发现出现第二波溶氧峰，再次以同样的速度流 加甲醇，并密切关注溶氧，发现第二次溶氧峰下降的极其缓慢，流加甲醇两小时后，将补料 泵流加甲醇的速度提升到16ml/小时，继续观察溶氧下降速度，并没有明显的变快，流加甲 醇4小时后，将补料泵速度提升到24ml/小时，继续观察溶氧的下降速度，还是没有明显的 变快，于是以16ml/小时的速度流加，统计第二次峰用时20小时，甲醇用量360ml，待溶氧下 降到10%后停止流加甲醇并密切关注溶氧，发现溶氧继续下降到5%左右，在83小时之后， 溶氧反弹到56%，结束发酵。通过观察溶氧峰起峰落进行甲醇流加，在发酵进行到30h、33h、44h、49h、53h后， 取样经10，OOOrpmUOmin的离心后能够观察到活性，分别为0、2086U、2530U、2765U、2637U， 见图5。(活性的检测方法可参见张秀英，孙玉梅.抗生素微生物检定法，《兽药检验操作规 程》，中国兽医药品监察所，二〇〇五年三月，209-217)分析
对控溶氧区间进行甲醇流加的实施例与对照实验进行比较，得到以下结果1、能够最早出现活性的时间差不多，都是在30小时之后，活性值的大小考虑到药 敏试验半定量方法的系统误差，可以认为相差不大，在2000U左右，以后随发酵的进行，活 性也随之提高，最高都可以达到2700U左右。2、对照实验中甲醇最终用量在6% 8%，第二次诱导后发酵进行到约80h后，溶 氧峰重新反弹起，就可以结束发酵；实施例中，甲醇最终用量在 6%，能够以适量的甲 醇控制溶氧区间的平稳运行，发酵进行到48小时，就可以结束发酵。3、对照实验实施过程中，发现抗菌肽活性值有一个最高值，然后会有一个变小的 过程，究其原因，抗菌肽是小肽，不稳定，长时间的发酵有可能被酶降解，也有可能被酵母重 新利用。综合考虑，可以认为，实施例更适合抗菌肽的发酵。
权利要求
一种利用溶氧参数控制毕赤酵母发酵抗菌肽的生产方法，其特征在于，步骤如下(1)向发酵罐中加入培养基，实消并冷却后，调节发酵温度为27～30℃，在通气量为0.3～1.5vvm、搅拌速度为250～400rpm的条件下，标定溶氧的百分点，得到发酵培养基；(2)将活化后的基因酵母菌株接种于发酵培养基中，接种量为10％(v/v)，同时标记为0点，开始发酵，发酵条件为通气量为0.3～1.5vvm、搅拌速度为100～400rpm、罐压为0.02～0.1MPa；(3)当DO值由10％以下上升至50％以上时，开始流加甲醇至DO值回落至10％～30％，停止流加甲醇，当DO值再次稳定升高至50％以上时，再次开始流加甲醇至DO值回落至10％～30％，停止流加甲醇，循环操作，通过流加甲醇、调节通风和转速控制DO值始终维持在10％～30％；(4)当流加甲醇后DO值不再回落时，发酵结束。
2.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤(1)中的培养基为0.5%甲醇 的BMMY培养基或1 %甘油的BMGY培养基。
3.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤(2)的活化，采用如下方法将基因工程酵母菌在含有博莱霉素抗性的YPDS液体培养基进行摇床活化，培养条件为28 30°C，100 200rpm，培养20 26小时，以OD65tl不超过4为限度。
4.如权利要求3所述的生产方法，其特征在于，所述的含有博莱霉素抗性的YPDS液体 培养基组分如下酵母浸粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L、山梨糖醇lmol/L、博来霉素25ug/ml。
5.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤(3)中流加甲醇的量为培养基 中甲醇终浓度不超过0. 2% (ν/ν)。
6.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤(3)中循环操作的次数为3 6次。
7.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤(3)中流加甲醇时DO值 回落至大于30 %时，通过降低搅拌转速和/或降低通风量来调节DO值，但通风量不低于 0. 3vvm ；DO值回落至小于10%时，通过提高搅拌转速和/或提高通风量来调节DO值。
全文摘要
本发明涉及一种利用溶氧参数控制毕赤酵母发酵生产抗菌肽的方法，属于生物工程技术领域。步骤如下(1)标定溶氧(DO)的百分点，得到发酵培养基；(2)同时标记为0点，开始发酵；(3)当DO值由10％以下上升至50％以上时，开始流加甲醇至DO值回落至10％～30％，停止流加甲醇，当DO值再次稳定升高至50％以上时，再次开始流加甲醇至DO值回落至10％～30％，停止流加甲醇，循环操作，通过流加甲醇、调节通风和转速控制DO值始终维持在10％～30％；(4)当流加甲醇后DO值不再回落时，发酵结束。本发明所述方法发酵周期短，甲醇用量少，相比传统溶氧值调控，更易于操作，条件易于掌握。
文档编号C12P21/00GK101979649SQ20101050532
公开日2011年2月23日 申请日期2010年10月13日 优先权日2010年10月13日
发明者姜正军, 孙大明, 朱孟豪, 王希凤, 田建国, 苏晓明, 袁永, 陈溥言 申请人:山东华辰生物科技有限公司