一种产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物发酵技术领域，具体而言，本发明设及一种产人膜岛素原的毕 赤酵母发酵培养基W及利用该培养基生产人膜岛素原的方法。
【背景技术】
[0002] 膜岛素是最为有效的糖尿病治疗药物，生产人膜岛素的方法分为化学合成法和基 因重组法，基因重组法先生产人膜岛素原，再进行后续工艺转变为人膜岛素或人膜岛素类 似物。基因重组法主要使用两种方法生产人膜岛素原，一种方法使用原核生物大肠杆菌，另 一种方法使用真核生物酿酒酵母。
[0003]毕赤酵母既具有类似原核生物大肠杆菌的繁殖快、易培养、便于遗传操作的特 性，又具有真核生物酿酒酵母的蛋白可翻译后修饰、蛋白正确折叠的特性，应用十分广泛， 毕赤酵母已成为多种蛋白的理想表达体系化inCere曲inoGP,LinCere曲inoJ,Ilgen C,CreggJM(2002)Productionofrecombinantproteinsinfermenterculturesofthe yeastPichiapastoris.CurrOpinBiotechnol13:329 - 332)。
[0004] 在毕赤酵母表达外源蛋白需要利用培养基中的营养成分，培养基除了必须含有菌 体生长代谢所必需的物质和元素外，还必须含有构成外源蛋白所需要的物质和元素，如，碳 源、氮源、无机盐等；碳源对酵母生长代谢的作用主要是提供细胞及产物的碳骨架，提供细 胞生命活动所需的能量，碳源可W分为无机碳源物质和有机碳源物质，包括葡萄糖、果糖、 薦糖、淀粉、纤维素等糖类，还包括有机酸，氨基酸，醇类，醒，酪等含碳化合物；毕赤酵母常 利用的碳源一般为甘油、葡萄糖、甲醇等。氮源为酵母细胞提供构成蛋白质、核酸及其他氮 元素化合物的材料，氮源可W分为无机氮源和有机氮源，无机氮源包括锭盐、硝酸盐等，有 机氮源包括牛肉膏、蛋白腺、酵母膏、鱼粉、血粉、赠蛹粉、豆（饼）粉、花生（饼）粉等。
[0005] 毕赤酵母发酵产人膜岛素原可W采用多种培养基，一般为BSM培养基及BSM基 础上改进的培养基。BSM(基础盐）培养基是Invitrogen公司提供的毕赤酵母发酵常规 使用的培养基，其配方为：85 %憐酸26. 7ml/l，二水硫酸巧0. 93g/l，硫酸钟18. 2g/l，屯 水硫酸儀14. 9g/l，氨氧化钟4. 13g/l，甘油40.Og/L;董鹏等使用BSM培养基进行发酵罐 培养产人膜岛素原，诱导溫度30°C，诱导抑为5. 5~6. 0,诱导96h，表达量256mg/L(董 鹏等，表达膜岛素的毕赤酵母生长动力学及诱导策略。北京化工大学学报，2006, 33(3): 37~41) ;Pais-化an化au等在BSM培养基中分别添加酪蛋白水解物、酵母提取物、蛋白腺 及硫酸锭用于表达膜岛素原，诱导溫度22°C，诱导抑6. 3,诱导12化后表达量达到0. 3g/ L(P3ls-Ch3nfr3UJM,et曰I.Improvingtheexpressionofmini-proinsulininPichi曰 pastoris.Biotechno]_Lett. , 2004, 26 (16) : 1269-1272)!Gurramkonda等将BSM培养基中的 二水硫酸巧0. 93g/L换为二水合氯化巧0. 28g/l，将憐酸和氨氧化钟换为憐酸二氨钟9. 4g/ 以甘油含量增为95. 2旨/1，并添加了 15. 7g/L的硫酸锭，利用此培养基进行人膜岛素前体的 发酵，诱导溫度30°C，诱导抑为5. 5,诱导表达12化，表达量达到3-4g/L(Gu;rramkondaet al.Applicationofsimplefed-batchtechniquetohigh-levelsecretoryproduction ofinsulinprecursorusingPichiapastoriswithsubsequentpurificationand conversiontohumaninsulin.MicrobialCellFactories2010,9:31 ~41)。
[0006] 上述培养基或者表达量不高，或者诱导培养时间过长，导致生产效率不高，并 且，有研究表明BSM培养基盐浓度高，使得培养基渗透压过高，导致菌体死亡率增加，不 仅影响表达量的提高，释放出脂类物质还增加了下游纯化工艺的难度度radyCP，Shimp RL,MilesAR,etal.High-levelproductionandpurificationofP30P2MSP1(19),an importantvaccineantigenform曰I曰ri曰，expressedinthemethylotropicyeast Pichiapastoris.ProtExpresPurif. 2001,23, 468 - 475)，因此，有必要对培养基进行改 进，提供一种既能缩短培养时间，又能得到高表达量的人膜岛素原的培养基，W提高工业化 生产的效率。
【发明内容】
[0007] 本发明为解决利用毕赤酵母发酵常规使用的BSM培养基发酵产人膜岛素原表达 量不高、诱导培养时间过长等导致生产效率不高的问题，提供了一种适于毕赤酵母发酵产 人膜岛素原的培养基，并在此基础上，本发明还提供了一种进行毕赤酵母发酵产人膜岛素 原的方法。
[0008] 本发明的目的通过W下方案实现：
[0009] -种产人膜岛素原的毕赤酵母发酵培养基，该培养基配方为：蛋白腺1~20g/l， 黄豆粉1~l〇g/l，85%憐酸13~碳酸巧0. 3~0. 4g/L，屯水硫酸儀7. 0~8.Og/ L硫酸锭6~lOg/l，氨氧化钟1. 5~2. 5g/l，甘油40.Og/l，PTMl溶液4. 35ml/l，抑为5~ 6。
[0010] 优选地，培养基配方为：蛋白腺lOg/L黄豆粉5g/L，85%憐酸13mlA，碳酸巧 0. 33g/L，，屯水硫酸儀7. 4g/l，硫酸锭8g/L，氨氧化钟2g/l，甘油40.Og/l，PTMl溶液 4. 35ml/L，抑为 5. 5。
[0011] 优选地，培养基配方为：蛋白腺20g/L，黄豆粉10g/L，85%憐酸14ml/L，碳酸巧 0. 4g/l，屯水硫酸儀7g/l，硫酸锭6g/L，氨氧化钟2. 5g/l，甘油40.Og/l，PTMl溶液4. 35ml/ L，抑为5. 5。
[0012] 所述蛋白腺为微生物来源或者酵母蛋白腺。本发明按照Invitrogenlife technologies公司《Pichiafermentationprocessguidelines》中的调控方法进行毕赤 酵母的发酵培养。所述的毕赤酵母指W己斯德毕赤酵母（Pichiapastoris)GSllS作为表达 宿主的基因重组菌，所述的发酵为在发酵罐中利用毕赤酵母进行甲醇诱导表达外源蛋白人 膜岛素原。
[0013] 一种基于本发明所述培养基进行毕赤酵母发酵产人膜岛素原的方法，具体包含W 下步骤：
[0014] (1)种子液的制备：将保存的毕赤酵母甘油菌种接于含100mLYPD培养基的500ml 摇瓶，30°C，250巧m摇床培养19~20h，作为种子液；
[0015] (2)分批培养发酵：IL种子液接入含1化发酵培养基的5化发酵罐中，起始培养条 件为30°C，pH5. 0,转速30化pm，通气量0.Sm3A。随着培养的进行，相应增大转速和通气 量，控制溶氧20~30%，培养19~2Ih;
[0016] (3)分批甘油补料培养：分批培养结束后，WlOmlA/L的速率流加含12ml/LPTMl 溶液的50%甘油5~化，培养过程中调整转速和通气量控制溶氧20~30%;
[0017] (4)甲醇诱导培养：分批甘油补料结束后，控制溫度为25~28°C，抑为3.O~5. 0， W3. 6ml/h/L的速率流加含12ml/LPTMl溶液的甲醇5~化后，增大甲醇补料速率为IOml/ h/l，直至发酵结束。诱导过程中调整转速和通气量控制溶氧20~30%;
[001引 妨取样及发酵结束：甲醇诱导培养开始后，每3~12小时取发酵液样品一次， 3000~1200化pm离屯、5~lOmin，测定上清液中人膜岛素原表达量，待表达量增加缓慢或 减少时，结束发酵。
[0019] 步骤（1)的YTO培养基由W下方法制备：酵母粉10邑/1，膜蛋白腺20g/l，葡萄糖 20g/L，12rC灭菌 20min。
[0020] 步骤（4)的溫度优