一种利用酶法制备特定分子量水溶性壳聚糖的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别设及一种利用酶法制备特定分子量水溶性壳聚糖 的方法。
【背景技术】
[0002] 壳聚糖（Chitosan)又称脱乙酷甲壳素，是自然界中唯一的碱性多糖，来源广泛。 壳聚糖具有很多优良性能和生物活性，如生物相容性、生物可降解性、缓释和控释作用、成 纤性、可纺丝性、抗癌性、止血性、抗菌性等等，因此，在医药、农业、环保、食品、化妆品等诸 多领域具有很大的应用价值，尤其在医学领域可W作为医用敷料、药物载体、牙科材料等， 市场潜力巨大。但是，普通的壳聚糖分子量多为几十万甚至上百万，具有较强的氨键和较高 的结晶性，难溶于水和一般的有机溶剂，进而导致其研究及推广应用受到了很大的限制。研 究表明，当壳聚糖分子量降到一定程度时，其许多特殊功能才表现出来。因此，水溶性壳聚 糖乃至不同分子量、不同功能的壳聚糖成为近年来研究的热点。
[0003] 据文献报道，水溶性壳聚糖的制备方法可归纳为=种：一是通过控制甲壳素的脱 乙酷度及脱乙酷条件，获得较高分子量的水溶性壳聚糖；二是在壳聚糖分子链上引入亲水 性基团或进行接枝，获得不同结构的水溶性壳聚糖；=是在适当条件下，将壳聚糖解聚，获 得分子量较低的水溶性壳聚糖。目前，前两种方法的应用居多，但存在过程复杂、试剂消耗 量大、分子量不可控等缺点。第=种方法是将壳聚糖降解，获得水溶性壳聚糖。壳聚糖降解 的方法主要有化学法、物理法和酶法，其中化学降解法是一类广泛应用于大规模生产的方 法，主要有酸降解法和氧化降解法，但此法同样存在较多缺点，如试剂消耗量大，水解程度 不易控制，产物分子量不集中，产物不易溶解，易造成环境污染等。相比而言，酶法具有明显 的优势，如工艺简单，对设备要求不高，反应条件溫和，反应速度快、专一性强，水解程度及 水解产物相对分子质量易于控制，产品纯度高、水溶性好，安全环保等，但是现有技术中相 应酶法解聚壳聚糖的报道还很少，如何开发出更好且更利于控制的酶法来解聚壳聚糖成为 亟待解决的问题之一。
[0004] 目前，市场上有酶法制备的壳寡糖产品、化学法制备的水溶性壳聚糖或壳聚糖衍 生物产品（也称水溶性壳聚糖）。从产品特性来看，它们都存在不同程度的缺陷或不足，或 水溶性好、生物活性不高、应用效果不显著，或水溶性较差、应用范围有限等等。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种利用酶法制备特定分子量水溶性壳 聚糖的方法，该方法W脱乙酷度高于80%的壳聚糖为原料，溶胀后经专一性酶水解、控制反 应终点、水解液浓缩、冷冻干燥等过程制备出特定分子量的水溶性壳聚糖。该方法通过控制 酶添加量、反应时间和溶液粘度，可获得含量高、水溶性好、特定分子量的壳聚糖，且具有工 艺简单、反应速度快、专一性强、成本低、安全环保等优点。
[0006] 本发明的具体技术方案是：
[0007] W脱乙酷度高于80%的壳聚糖为原料，利用酶法制备特定分子量水溶性壳聚糖， 具体步骤如下：
[000引 （1)粘均分子量曲线的获得
[0009] 先配制w/v2 %的壳聚糖溶液，之后利用已知酶和技术将其水解制备成一系列 特定分子量的壳聚糖，测定反应液粘度和粘均分子量，W反应液粘度和粘均分子量绘制曲 线；
[0010] 似溶胀：取壳聚糖原料于反应容器中，用水配制成w/v2%~8%的壳聚糖溶液， 加酸调节溶液的抑为4~6,不断揽拌，于40°C~60°C水浴中溶胀60~120分钟； W11] 做水解：按照壳聚糖质量W0.lU/g~抓/g的比例在反应容器中加入酶，开始 反应，至理论酶解完全时间之前10~15分钟，开始每间隔5分钟取样一次，取样稀释至反 应液浓度为w/v2 %，测定其溶液粘度，至预定粘度后水解过程结束，之后利用沸水浴灭酶 10-30分钟，结束反应，即得特定分子量的壳聚糖溶液；上述水解过程控制在60~150分 钟；
[0012] (4)干燥：将上述壳聚糖溶液冷却，经4000r/min~1200化/min离屯、机离屯、或滤 布过滤，获得的壳聚糖澄清溶液直接喷雾干燥，或经旋转蒸发器浓缩至1/2~1/4体积后冷 冻干燥，即得固体水溶性壳聚糖；
[0013] 最终获得的固体水溶性壳聚糖，其含量为91. 5-98. 5 % (w/w);
[0014] 在上述溶胀过程中，配制的壳聚糖溶液浓度应根据制备的目标水溶性壳聚糖的粘 均分子量而定。若制备5kDa~ISOkDa的目标产物，配制的壳聚糖溶液浓度应为w/v6%~ 8% ;若制备ISOkDa~350kDa的目标产物，配制的壳聚糖溶液浓度应为w/v2%~4%。
[0015] 在上述壳聚糖的水解过程中，可采用液体酶，也可采用固定化酶，均能达到高效降 解壳聚糖的目的，若制备5kDa~ISOkDa的目标产物，按照壳聚糖质量W0.抓/g~抓/g的 比例加入酶；若制备ISOkDa~350kDa的目标产物，按照壳聚糖质量W0.lU/g~0.抓/g的 比例加入酶。所述的酶一般选自固体发酵壳聚糖酶粗酶粉、液体发酵壳聚糖酶粗酶、含有壳 聚糖酶粗酶的发酵液、吸附树脂固定化壳聚糖酶、壳聚糖内切酶等可从市场上直接购得的 壳聚糖酶。
[0016] 在上述反应过程控制中，加酶量和反应时间的控制：酶的用量越大反应时间越短， 对于制备特定分子量的壳聚糖（尤其是大分子量的壳聚糖）来说，反应越不易控制。因此， 水解反应时间最好控制在60~150分钟，根据反应时间和酶活，按W上所述加入酶；
[0017] 溶液粘度的控制：先配制一定浓度的壳聚糖溶液，制备一系列特定分子量的壳聚 糖，测定该浓度下反应液粘度和粘均分子量，W反应液粘度和粘均分子量绘制曲线，再根据 反应液粘度可制备任意特定分子量的壳聚糖。
[0018] 在具体测定实时粘度时，壳聚糖原料溶液的浓度应该与测定曲线时壳聚糖溶液的 浓度相同，不同时则需要对其进行调整。
[0019] 上述制备的5kDa~350kDa特定粘均分子量的壳聚糖与市场上水溶性壳聚糖 (实为壳聚糖衍生物，且分子量和应用范围有限）的不同之处在于，其均溶于水，且水溶性 好（溶解性见表1)，为真正意义上的水溶性壳聚糖，产品分子量不同，功能也不同，可满足 各种应用需求。同时，与专利CN201210300863中的壳寡糖相比，反应过程加酶量要缩小 2. 4-40倍，且反应时间短，能耗和成本低，生物活性好，产品多样，应用广泛。
[0020] 且与现有技术相比，本发明所采用的酶均为市