专利名称：低分子量壳聚糖的生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种低分子量壳聚糖的生产工艺。
背景技术：
根据现已掌握的科技知识，壳聚糖是由甲壳素经脱乙酰后的昆虫的外壳及藻类、菌类的细胞壁之中，是产量仅次于纤维素的第二大天然高分子。壳聚糖是由β-(1，4)-2-氨基-D-葡萄糖单元与β-(1，4)-2-乙酰胺基-D-葡萄糖单元组成的共聚物。由于壳聚糖的分子量很大，并且存在紧密的结晶区域，不溶于普通的溶剂，只能在酸性介质中溶解，这一性质限制了它的应用。另外，研究还表明不同分子量的壳聚糖的性质差异很大，有时甚至表现出截然相反的特性，壳聚糖的许多特殊功能只能在分子量降到一定程度时才能表现出来。相对于分子量低于1万的水溶性壳聚糖更具有独特的生理活性。例如，能够降低肝脏和血清中的胆固醇；降低血压、血糖和血脂；抑制肿瘤细胞生长；促进双岐杆菌的增殖、抑制大肠杆菌、防止胃溃疡等功能。
目前，降解壳聚糖的的方法主要有化学法和酶法。其中化学法存在显著的缺陷生产条件较为苛刻，常涉及到高温、高压，尤为重要的是水解程度不宜控制，产物的分子量分布宽，制备过程中要使用大量的化学试剂，对环境危害大等。而酶法则是在较为温和的条件下进行的，无须大量使用化学试剂，酶法的最大优点是酶具有很高的特异性，可以选择性地切断壳聚糖的β-(1，4)-糖苷键，降解过程和降解产物的分子量易于控制，可以得到分子量范围窄的低聚壳聚糖。目前，文献报道中的有可用于降解壳聚糖的酶，主要分为专一性水解酶如甲素酶、壳聚糖酶，以及非专一性水解酶如蛋白酶、脂肪酶及溶菌酶等，但这些酶制剂对壳聚糖的水解效率普遍较低。目前，有关于采用动物内脏制取脂肪酶的报道，其来源主要是猪胰脂肪酶，它不仅来源少，而且生产成本高。
技术内容本发明的目的是提供一种有效改善生产效率和降低生产成本的低分子量壳聚糖的生产工艺。
为实现上述目的，本发明采用的工艺包括以下步骤一种低分子量壳聚糖的生产工艺，本发明包括以下步骤提供或制备脂肪酶并构成壳聚糖溶液；在温度40～50℃，pH4.5～5.5，底物浓度10～100g/L，反应时间5～6小时的条件下进行酶解反应；上述反应完毕后升温至使酶失活；酶解液过滤去除固定化脂肪酶，滤液真空浓缩，过凝胶色谱柱，在脱盐的同时，得到低分子量壳聚糖。
本发明中采用的脂肪酶来自于微生物真菌，所述的脂肪酶的生产可以用固体和液体培养，再进一步分离获得，用于生产低分子量壳聚糖的酶制剂，可以是经部分纯化、纯化或固定化脂肪酶，即根据实际需要，可以制备不同类型的酶制剂来生产低分子量壳聚糖。
由本发明提供的生产低分子量壳聚糖的工艺可以清楚的得知，本发明提供了一种原料来源广泛、生产成本低并且加工过程便于控制的生产低分子量壳聚糖的方法，有利于将低分子量壳聚糖的生产推广到大规模的工业化生产中实施。
附图概述
图1是本发明的工艺流程图；图2是温度与酶解反应的关系图；图3是pH与酶解反应的关系图；图4是底物浓度与酶解反应的关系图；图5是酶量与酶解反应的关系图；图6是时间与酶解反应的关系图；图7是粘度与酶解反应的关系图。
具体实施例方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。低分子量壳聚糖的生产工艺首先要提供或制备脂肪酶并构成壳聚糖溶液；酶解反应应满足以下具体条件在温度40～50℃，pH4.5～5.5，底物浓度10～100g/L，反应时间5～6小时的条件下进行酶解反应；上述反应完毕后升温至使酶失活；之后，酶解液过滤去除固定化脂肪酶，滤液真空浓缩，过凝胶色谱柱，在脱盐的同时，得到低分子量壳聚糖。
本发明中所述的脂肪酶制剂，可以是经部分纯化、纯化或固定化脂肪酶。
所述的脂肪酶是通过以下过程制备的在以黄豆饼粉为主要成分的培养基中，接入根霉的孢子悬液，25～28℃培养2～3天，再用缓冲溶液浸提，过滤、收集滤液。
在28℃培养2天后浸提酶液经凝胶层析分离，收集高活力组分，冷冻干燥得酶粉。
所述的壳聚糖溶液是由壳聚糖细粉加入醋酸缓冲液得1％～2％溶液，之后进行酶解反应。
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
本发明中的材料和检测方法脂肪酶用德氏根酶(Rhizopus delemar)菌固态发酵2天，浸提酶液经凝胶层析分离，收集高活力组分，冷冻干燥得酶粉，平均酶活2000IU/g干粉。
壳聚糖虾壳壳聚糖，白色粉末，浙江玉环化工厂出品，粘均分子量6.0×105，脱乙酰度81％。
试剂标准α-氨基葡萄糖为Sigma公司产品，其它试剂均为分析纯。
粘均分子量测定依据《壳聚糖粘均分子量的测定》(《化学通报》，1996，457～58)。
脂肪酶活力测定依据Zhang J，Xu J L.Oleyl oleeate synthesisby immobilized lipase from candida sp 1619[J].Chinese J ofbiotechnol，1995，11(4)243～251.
还原糖含量测定按Miller方法测定。
参见图1酶解反应在250ml锥形瓶中加入0.1g干酶粉，再加入1％壳聚糖乙酸溶液20ml，调节pH值及反应温度，在150r/min下反应。
通过以下所述的固态发酵方法来制备微生物脂肪酶在以黄豆饼粉为主要成分的培养基中，接入根霉菌的孢子悬液，28℃下培养48h，用Hac-NaAc缓冲溶液(pH5.0)浸提固态培养曲，过滤、收集滤液，真空浓缩，经等电点聚集沉淀，冷冻干燥得酶粉。本发明中采用固态发酵法生产脂肪酶，原料来源丰富，生产条件温和，酶制剂产量大。
温度对酶解反应的影响结合图2可以看出，通常酶促反应受到温度的影响较大，提高温度可以加快反应，但温度过高会因蛋白质变性而使酶失活。将反应体系的温度pH值调节到5.0，反应时间定在6h，反应结果如图2所示，R delemar菌脂肪酶水解壳聚糖的适宜温度是40～50℃，尤以45℃为佳。
pH值对酶解反应的影响酶作为生物催化剂，具有完整的化学结构和空间结构。酶的结构决定了酶的性质和功能。溶液的pH值的变化会破坏酶的空间构象而使酶失活；另一方面，pH值的变化会使酶分子或底物分子的带电状况发生变化，影响酶与底物的结合。结合图3可以看出pH值对酶解反应的影响。图3是在取6份1％壳聚糖的乙酸溶液加酶反应的结果，加酶后用乙酸钠溶液分别调节溶液的pH值至3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，在温度45℃下反应6h，分别测定还原糖浓度。由图3可见，最为适当的pH值为5.0。
底物浓度对酶解反应的影响配置一系列不同浓度的壳聚糖的乙酸溶液，加酶后将pH值调至5.0，在温度45℃下反应6h，分别测定还原糖浓度，作反应速度与底物浓度的双倒数图如图4所示。由图4可知，R.delemar菌脂肪酶降解壳聚糖的反应不符合简单的一级反应动力学模型，该脂肪酶不具有米氏酶特征。
酶量对酶解反应的影响图5中，在200ml壳聚糖的乙酸溶液中，加入不同的酶量，在pH 5.0、45℃下反应6h，分别测定酶解液还原糖浓度，由图5可见，在有限的酶量范围内，随着酶量的增加，酶促反应速度随之加快，且基本呈线性关系，因此，适当加大酶量对加快壳聚糖的水解有利。
金属离子对酶解反应的影响在酶促反应体系中加入几种常见的金属离子的氯化物盐，使其浓度达到0.02mol/L，调节pH5.0、45℃下反应6h后，分别测定酶解液还原糖浓度，设未加金属离子的体系为100％酶活力，以加入金属离子后还原糖的变化计算相对酶活力，结果如下表所示。由此可见，Cu2+Mn2+的加入使壳聚糖发生絮凝，无法进行水解反应；Ni2+、Ca2+会使脂肪酶的活力显著下降；而Na+、K+、Fe3+、Mg2+等对酶活力无明显影响，这对脂肪酶的实际生产十分有利。
反应时间对对酶解反应的影响将反应体系在pH5.0、 45℃下反应，定时取样，测定还原糖浓度，结果如图6所示，在最初的5h内，反应速度很快，且速度大致相同，还原糖浓度呈线性增长，到5h后，反应速度开始下降，6h后还原糖的增加已经缓慢。
在酶解反应过程中壳聚糖的粘度变化如图7所示，分别取两份壳聚糖的乙酸溶液，一份加脂肪酶，一份不加酶，在相同的条件下保温反应，定时取样，测定溶液的粘度，结果是加脂肪酶的壳聚糖溶液的粘度在最初的1h内急剧下降，只有原溶液的36％；4h后粘度变化趋缓，至6h时粘度只有原溶液的8％。不加酶的溶液的粘度只有微弱变化，说明在微酸性溶液中，壳聚糖虽能自然降解，但速度很慢，脂肪酶的加入能够极大地加快壳聚糖的降解速度。
权利要求
1.一种低分子量壳聚糖的生产工艺，本发明包括以下步骤提供或制备脂肪酶并构成壳聚糖溶液；在温度40～50℃，pH4.5～5.5，底物浓度10～100g/L，反应时间5～6小时的条件下进行酶解反应；上述反应完毕后升温至使酶失活；酶解液过滤去除固定化脂肪酶，滤液真空浓缩，过凝胶色谱柱，在脱盐的同时，得到低分子量壳聚糖。
2.根据权利要求1所述的低分子量壳聚糖的生产工艺，其特征在于所述的脂肪酶制剂，可以是经部分纯化、纯化或固定化脂肪酶。
3.根据权利要求1或2所述的低分子量壳聚糖的生产工艺，其特征在于所述的脂肪酶是通过以下过程制备的在以黄豆饼粉为主要成分的培养基中，接入根霉的孢子悬液，25～28℃培养2～3天，再用缓冲溶液浸提，过滤、收集滤液。
4.根据权利要求3所述的低分子量壳聚糖的生产工艺，其特征在于在28℃培养2天后浸提酶液经凝胶层析分离，收集高活力组分，冷冻干燥得酶粉。
5.根据权利要求1所述的低分子量壳聚糖的生产工艺，其特征在于所述的壳聚糖溶液是由壳聚糖细粉加入醋酸缓冲液得1％～2％溶液，之后进行酶解反应。
6.根据权利要求5所述的低分子量壳聚糖的生产工艺，其特征在于在酶促反应体系中加入Na+、K+、Fe3+、Mg2+金属离子的氯化物盐，使其浓度达到0.02mol/L。
全文摘要
本发明涉及一种有效改善生产效率和降低生产成本的低分子量壳聚糖的生产工艺，提供或制备脂肪酶并构成壳聚糖溶液；在温度40～50℃，pH4.5～5.5，底物浓度10～100g/L，反应时间5～6小时的条件下进行酶解反应并升温至使酶失活；酶解液过滤去除固定化脂肪酶，滤液真空浓缩，过凝胶色谱柱，在脱盐的同时，得到低分子量壳聚糖。本发明中原料来源广泛、成本低且加工过程便于控制，有利于工业化生产。
文档编号C12P19/04GK1693474SQ20041001485
公开日2005年11月9日 申请日期2004年5月8日 优先权日2004年5月8日
发明者吴克, 蔡敬民, 杨本宏, 潘仁瑞, 刘斌, 吴茜茜, 张洁 申请人:合肥学院