专利名称：大蒜病毒检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明属于大蒜病毒RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，专用于大蒜花叶病毒(GMV)、大蒜潜隐病毒(GCLV)的检测。
二、技术背景大蒜(Alliμm sativum L.)是我国一种重要的出口蔬菜。但大蒜属花粉败育型植物，生产中主要靠鳞茎进行无性繁殖。因此，病毒在大蒜营养器官中不断积累增殖造成品种退化，使产量和质量下降，严重影响我国大蒜的生产和出口。大蒜病毒病属于难治疗病害，迄今还没有一种有效的药物。大蒜花叶病毒病是大蒜花叶病毒(GMV，Garlic mosaic virus)侵染大蒜植株引起的病害，其田间植株症状呈现出显著黄色条纹花叶，叶片呈扭曲、折叠及萎缩状态，病毒粒子体为700～800μm，以鳞茎、汁液、蚜虫、蓟马及线虫等传毒。大蒜潜隐病毒病是大蒜潜隐病毒(GCLV，Garlic commonlatent virus)侵染大蒜植株引起的病害，其田间植株不表现出任何带毒症状，即无症带毒，并不影响产量；但在自然条件下，该病毒多数与大蒜花叶病毒混合侵染大蒜植株，被侵染的病株常常呈现出系统花叶症状。病毒粒子体为580～720μm，以鳞茎、汁液和蚜虫等传毒。目前，解决大蒜病毒主要是通过组织培养方法来生产脱毒大蒜，故建立灵敏、快速、简便、商业化的检测技术成为脱毒大蒜生产中应迫切解决的问题。
自20世纪30代以来，大蒜病毒的检测主要是依据植株本身的外观症状和指示植物来进行，这些方法需时较长，灵敏度较低，且受季节限制。20世纪70年代至80年代初期，随着免疫学技术的发展，其在大蒜病毒检测上的应用也越来越广泛。免疫学方法检测大蒜病毒的灵敏性大大提高，特异性也增强，检测速度也有较大的提高，目前已成为最常用的大蒜病毒的检测方法。
20世纪80年代中期以后，分子生物学的技术得到了快速的发展，为大蒜病毒的检测提供了一种比上述几种方法灵敏度更高、特异性更强、速度更快的方法。
RT-PCR技术检测病毒的基本原理是首先弄清待检病毒RNA的全部或部分序列，并以此合成一对特异性引物(也可用随机引物)；然后对病毒RNA进行逆转录和PCR扩增；对扩增产物进行电泳、染色，产生特异DNA谱带，据此即可检测病毒。RT-PCR技术作为一种国际通用的病毒检测技术与其它检测方法比较具有以下优点①比ELISA更灵敏，特异性更好，结果更可靠；②与核酸分子杂交技术相比无放射性危险；③与dsRNA电泳技术相比可检测fg数量级的植物病毒及大规模样品。因此该技术在大蒜病毒检测方面具有广阔的应用前景。
国内外特别是日本近年来已开始采用分子生物学技术检测大蒜病毒，效果良好，报道利用RT-PCR技术检测的大蒜病毒有大蒜潜隐病毒(GCLV)等(ArchVirol.1998，1431093～1107)。但是，至今没有大蒜RT-PCR病毒检测试剂盒出现，市场上出售的一步RT-PCR试剂盒，反转录反应和PCR反应一步进行，一旦某一环节出错就必须从头开始而造成的时间和药品的浪费，同时常用的RT-PCR反应体系为100μl的大体系，造成大量药品的浪费，并且操作复杂容易造成污染，而导致试验失败。
发明内容
技术问题本发明的目的在于提供一种大蒜病毒RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，建立大蒜GMV、GCLV病毒的RT-PCR检测试剂盒和使用方法，为大蒜病毒检疫和大蒜脱毒苗病毒检测提供一种快速、准确、操作方便、灵敏、特异性好的检测方法。
技术方案1一种大蒜病毒RT-PCR检测试剂盒，包括反转录试剂盒，PCR试剂盒及阳性对照三部份1)反转录试剂盒，含有PCR试剂管1和无RNA酶的水，其中PCR试剂管1内含10×buffer，dNTP，MgCl2，RNA酶抑制因子，oligo-dT引物，反转录酶；每1支量7.5～15μl反转录试剂配制成分 试剂浓度 用量10×buffer15mmol/μl1～3μldNTP 10mmol/μl1～3μlMgCl225mmol/l 3～4μlRNA酶抑制因子 40U/μl 0.5～1μl
oligo-dT引物 0.1ug/μl1～2μl反转录酶 200U/μl 1～2μl2)PCR试剂盒，含有PCR试剂管2、试剂A及试剂B，其中PCR试剂管2内含10×PCR buffer，MgCl2，dNTP，Taq酶，每1支量2.7～8.5μl PCR试剂配制成分 试剂浓度 用量10×PCR buffer15mmol/μl 1～3μlMgCl225mmol/μl 1～3μldNTP 10mmol/μl 0.5～2μlTaq酶 5U/μl 0.2～0.5μl试剂A配制引物GMVP15’-TGGAAGGCAAAGTTACAGGAGG-3’和引物GMVP25’-GTCAAATGCGTACCGTGCGAGA-3’用纯水溶解到5～20pmol/μl；试剂B配制引物GCLVP15’-AGTTGCGACTGCTGAAGACC-3’和引物GCLVP25’-GCCATTACGCCTATTCCTAC-3’用纯水溶解到5～20pmol/μl；3)阳性对照，为从大蒜病叶中提取的，含有GMV、GCLV两种病毒RNA的RNA。2大蒜病毒RT-PCR检测试剂盒的检测方法(1)反转录反应向PCR试剂管1中加入0.1～1μg大蒜总RNA样品和无RNA酶的水，使总反应体系达20μl，然后进行反转录反应，得到cDNA，其条件为42℃、30分钟，95℃、5分钟，4℃、5分钟；(2)PCR反应取反转录得到的cDNA，加入PCR试剂管2中，再加入试剂A或试剂B，然后加入纯水使总反应体系达20μl，然后进行PCR反应，其参数为94℃变性1分钟，57℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，进行32个循环；(3)电泳检测在PCR反应结束的PCR试剂管2中加入电泳上样缓冲液，取反应液在含琼脂糖和溴化乙锭(EB)的凝胶上进行电泳，然后在凝胶成像系统上拍照观察含有GMV病毒大蒜样品的电泳检测结果为扩增出327bp的电泳条带，含有GCLV病毒大蒜样品的电泳检测结果为扩增出469bp的电泳条带。
有益效果本发明所提供的大蒜病毒RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，与现有技术相比，具有如下优点和积极效果1)本发明试剂盒经特异性和灵敏度鉴定，证明特异性和灵敏度较高。
2)试剂被分装在两个PCR试剂管中，避免了操作过程中的污染，使用方便。
3)试剂盒反转录和PCR分两步进行，与市场上出售的一步RT-PCR试剂盒相比，避免了一旦由于一部分出错就必须从头开始而造成的时间和药品的浪费，并且反转录后进行PCR反应时可以设置重复，与一步RT-PCR试剂盒相比，增加了结果的可靠性。
4)试剂盒PCR部分采用20μl小反应体系，与RT-PCR常用的100μl大反应体系相比节约药品，可降低成本。
本发明为大蒜病毒检测提供了一种快速、准确、操作方便、灵敏、特异性好的试剂盒，可以大大加速脱毒大蒜的推广和应用。
四
图1大蒜GMV病毒的RT-PCR扩增条带M为分子量marker，1、2、3、4为含有大蒜GMV病毒的大蒜样品图2大蒜GCLV病毒的RT-PCR扩增条带M为分子量marker，1、2、3、4为含有大蒜GCLV病毒的大蒜样品图3大蒜GMV病毒的RT-PCR灵敏性鉴定M为分子量marker，1、2、3、4、5分别为按1∶10∶20∶50∶100比例稀释图4大蒜GCLV病毒的RT-PCR灵敏性鉴定M为分子量marker，1、2、3、4、5分别为按1∶10∶20∶50∶100比例稀释五具体实施方式
1、PCR引物的设计与合成根据GMV的外壳蛋白基因(Genbank数据库编号AF500074)和GCLV的外壳蛋白基因(Genbank数据库编号AF228416)设计引物，利用DNA合成仪合成2对引物GMVP1、GMVP2和GCLVP1、GCLVP2。合成的引物GMVP1、GMVP2扩增位于GMV外壳蛋白基因的277bp～603bp之间的核苷酸序列，长度为327bp；合成的引物GCLVP1、GCLVP2扩增位于GCLV外壳蛋白基因的402bp～870bp之间的核苷酸序列，长度为469bp。
2、RT-PCR试剂盒的组装
(1)反转录试剂盒的组装反转录试剂按表1配制，并分装在PCR试剂管1(用DEPC处理并灭菌)中。
(2)PCR试剂盒的组装①PCR试剂按表2配制，并分装在PCR试剂管2中。
②试剂A配制，引物GMVP1(5’-TGGAAGGCAAAGTTACAGGAGG-3’)和引物GMVP2(5’-GTCAAATGCGTACCGTGCGAGA-3’)用纯水溶解到10pmol/μl。
③试剂B配制，引物GCLVP1(5’-AGTTGCGACTGCTGAAGACC-3’)和引物GCLVP2(5’-GCCATTACGCCTATTCCTAC-3’)用纯水溶解到10pmol/μl。
(3)阳性对照，从大蒜病叶中提取，含有GMV、GCLV两种病毒RNA的RNA。
3、大蒜病毒RT-PCR检测试剂盒的检测方法(1)反转录反应，向PCR试剂管1中加入0.1～1μg大蒜总RNA样品和无RNA酶的水，使总反应体系达20μl，然后进行反转录反应，其条件为42℃、30分钟，95℃、5分钟，4℃、5分钟。
(2)PCR反应，取1μl反转录得到的cDNA，加入PCR试剂管2中，再加入5μl试剂A或试剂B，然后加入纯水使总反应体系达20μl，然后进行PCR反应，其参数为94℃变性1分钟，57℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，进行32个循环。
(3)电泳检测，在PCR反应结束的PCR试剂管B中加入3μl 6倍电泳上样缓冲液0.25％(w/w)溴酚兰溶液，取10μl在含2.0％(w/w)琼脂糖和10μl/100ml溴化乙锭(EB)的胶上进行电泳，然后在凝胶成像系统上拍照观察。
实施结果如下1特异性鉴定利用多种病毒(OYDV、GCLV、GMV、SLV)复合侵染的大蒜叶片检测本试剂盒的特异性，结果表明，按照试剂盒的使用方法，GCLV和GMV都得到了清晰、准确的扩增条带，利用Labwork4.0根据分子量marker测定的序列长度与预期设计长度327bp(图1)和469bp(图2)相吻合，证明该试剂盒有较高的特异性。
2灵敏度鉴定将含有GCLV、GMV病毒RNA的大蒜总RNA提取液按1∶10∶20∶50∶100比例稀释，相当于0.8μg，0.08μg，0.04μg，0.016μg，0.008μg，利用本试剂盒并按使用方法经RT-PCR扩增，结果如图3、图4所示，由图3、图4可知，除了稀释100倍的RNA不能扩增出条带外，其它都可以扩增出来，表明用RT-PCR检测大蒜病毒有较高的灵敏度。
此外，本试剂盒反转录和PCR分两步进行，与市场上出售的一步RT-PCR试剂盒相比，避免了一旦由于一部分出错就必须从头开始而造成的时间和药品的浪费，并且反转录后进行PCR反应时可以设置重复，与一步RT-PCR试剂盒相比，增加了结果的可靠性。同时，本试剂盒PCR部分采用20μl小反应体系，与RT-PCR常用的100μl大反应体系相比节约药品，可降低成本，本试剂盒所有试剂被分装在两个PCR试剂管中，与常用的RT-PCR相比避免了操作过程中的污染，使用方便。
表1反转录试剂成分 试剂浓度 1支(μl)10×buffer15mmol/μl2dNTP 10mmol/μl2MgCl225mmol/l 4RNA酶抑制因子 40U/μl 0.5Oligo-dT引物 0.1ug/μl 1MMLV反转录酶 200U/μl 1总体积 10.5表2 PCR试剂成分 试剂浓度 1支(μl)10×PCR buffer 15mmol/μl 2MgCl225mmol/μl 1.6dNTP 10mmol/μl 0.5Taq酶5U/μl 0.2总体积4.权利要求
1.一种大蒜病毒RT-PCR检测试剂盒，包括反转录试剂盒，PCR试剂盒及阳性对照三部份1)反转录试剂盒，含有PCR试剂管1和无RNA酶的水，其中PCR试剂管1内含10×buffer，dNTP，MgCl2，RNA酶抑制因子，oligo-dT引物，反转录酶；2)PCR试剂盒，含有PCR试剂管2、试剂A及试剂B，其中PCR试剂管2内含10×PCR buffer，MgCl2，dNTP，Taq酶，试剂A内含引物GMVP15’-TGGAAGGCAAAGTTACAGGAGG-3’引物GMVP25’-GTCAAATGCGTACCGTGCGAGA-3’试剂B内含引物GCLVP15’-AGTTGCGACTGCTGAAGACC-3’，引物GCLVP25’-GCCATTACGCCTATTCCTAC-3’3)阳性对照，为从大蒜病叶中提取的，含有GMV、GCLV两种病毒RNA的RNA。
2.根据权利要求1所述的大蒜病毒RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，1)每1支量7.5～15μl反转录试剂配制成分 试剂浓度用量10×buffer 15mmol/μl 1～3μldNTP 10mmol/μl 1～3μlMgCl225mmol/l3～4μlRNA酶抑制因子 40U/μl 0.5～1μloligo-dT引物 0.1ug/μl 1～2μl反转录酶 200U/μl1～2μl2)每1支量2.7～8.5μlPCR试剂配制成分 试剂浓度用量10×PCR buffer 15mmol/μl 1～3μlMgCl225mmol/μl 1～3μldNTP 10mmol/μl 0.5～2μlTaq酶 5U/μl 0.2～0.5μl试剂A配制引物GMVP15’-TGGAAGGCAAAGTTACAGGAGG-3’和引物GMVP25’-GTCAAATGCGTACCGTGCGAGA-3’用纯水溶解到5～20pmol/μl；试剂B配制引物GCLVP15’-AGTTGCGACTGCTGAAGACC-3’和引物GCLVP25’-GCCATTACGCCTATTCCTAC-3’用纯水溶解到5～20pmol/μl；
3.权利要求1所述大蒜病毒RT-PCR检测试剂盒的检测方法，包括，(1)反转录反应向PCR试剂管1中加入0.1～1μg大蒜总RNA样品和无RNA酶的水，使总反应体系达20μl，然后进行反转录反应，得到cDNA，其条件为42℃、30分钟，95℃、5分钟，4℃、5分钟；(2)PCR反应取反转录得到的cDNA，加入PCR试剂管2中，再加入试剂A或试剂B，然后加入纯水使总反应体系达20μl，然后进行PCR反应，其参数为94℃变性1分钟，57℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，进行32个循环；(3)电泳检测在PCR反应结束的PCR试剂管2中加入电泳上样缓冲液，取反应液在含琼脂糖和溴化乙锭的凝胶上进行电泳，然后在凝胶成像系统上拍照观察含有GMV病毒大蒜样品的电泳检测结果为扩增出327bp的电泳条带，含有GCLV病毒大蒜样品的电泳检测结果为扩增出469bp的电泳条带。
全文摘要
本发明涉及大蒜病毒RT－PCR检测试剂盒及其检测方法，专用于大蒜花叶病毒(GMV)、大蒜潜隐病毒(GCLV)的检测。试剂盒包括反转录试剂盒，PCR试剂盒及阳性对照三部分。检测方法，包括反转录反应，PCR反应及电泳检测，含有GMV病毒大蒜样品的电泳检测结果为扩增出327bp的电泳条带，含有GCLV病毒大蒜样品的电泳检测结果为扩增出469bp的电泳条带。本试剂盒PCR部分采用小反应体系，节约药品，降低成本，使用方便。通过特异性和灵敏度鉴定，证明本试剂盒特异性和灵敏度较高。
文档编号C12Q1/25GK1563411SQ20041001472
公开日2005年1月12日 申请日期2004年4月22日 优先权日2004年4月22日
发明者侯喜林, 张昌伟, 史公军, 王建军 申请人:南京农业大学