选为25 °C。
[00引]步骤（4)的抑优选为3. 25。
[0022] 本发明相对于现有技术具有W下优点和有益效果：
[0023] 本发明提供的培养基，用于毕赤酵母发酵产人膜岛素原，相对于毕赤酵母发酵常 规使用的BSM培养基及现有技术提供的其他培养基，能够更有效地进行毕赤酵母发酵生产 人膜岛素原。基于本发明提供的培养基，使用本发明提供的毕赤酵母发酵产人膜岛素原的 方法，人膜岛素原表达量大大提高，可达43 %，并大幅减少培养时间24~42h，从而提高了 生产效率。
【附图说明】
[0024] 图1为实施例1对照实验中人膜岛素原表达量随诱导时间变化的曲线图。
[0025] 图2为实施例2中人膜岛素原表达量随诱导时间变化的曲线图。
[0026] 图3为实施例8中人膜岛素原表达量随诱导时间变化的曲线图。
【具体实施方式】
[0027]W下通过具体实施例进一步阐释本发明，实施例仅用于说明本发明而不限制本发 明所要求保护的范围。
[0028] 实施例1:对照实验
[0029] 本实施例的产人膜岛素原的毕赤酵母发酵培养基为BSM培养基，配方为：85%憐 酸26. 7ml/l，二水硫酸巧0. 93g/l，硫酸钟18. 2g/l，屯水硫酸儀14. 9邑/1，氨氧化钟4. 13g/ L，甘油40.Og/L，PTMl溶液4. 35ml/l，用氨氧化钟和憐酸调节抑为5. 5。
[0030] 使用Invitrogenlifetechnologies公司《Pichiafermentationprocess guidelines》中提供的毕赤酵母发酵的常规技术，按照如下步骤进行毕赤酵母发酵生产人 膜岛素原：
[003。（1)种子液的制备：将保存的毕赤酵母甘油菌种接于含100mLYPD培养基的500ml 摇瓶，30°C，250巧m摇瓶培养20h，作为种子液。
[0032]似分批培养发酵：IL种子液接入含19L发酵培养基的50L发酵罐中，起始培养条 件为30°C，pH5. 0,转速30化pm，通气量0.Sm3A。随着培养的进行，相应增大转速和通气 量，控制溶氧20~30 %，培养20h。
[0033] (3)分批甘油补料培养：分批培养结束后，WlOml/h/L的速率流加含12ml/LPTMl 溶液的50%甘油5~化，培养过程中调整转速和通气量控制溶氧20~30%。
[0034] (4)甲醇诱导培养：分批甘油补料结束后，诱导溫度降为25。诱导抑为3. 25,W 3. 6ml/h/L的速率流加含12ml/LPTMl溶液的甲醇化后，增大甲醇补料速率为lOml/h/L， 直至发酵结束。诱导过程中调整转速和通气量控制溶氧20~30%。
[0035] (5)取样及发酵结束：甲醇诱导培养开始后，每12小时取发酵液样品一次，待诱导 表达84h后每3~化取样一次，12000巧m离屯、5min，测定上清液中人膜岛素原表达量，待 表达量增加缓慢或减少时，结束发酵。
[0036] 检测结果表明，诱导96h时，发酵上清液中人膜岛素原的表达量达到最大值 2571mg/L(图 1)。
[0037] 实施例2
[0038] 本实施例的产人膜岛素原的毕赤酵母发酵培养基为：蛋白腺IgA,黄豆粉Ig/L， 85%憐酸131111/1，碳酸巧0.3肖/1，屯水硫酸儀7.0肖/1，硫酸锭6肖/1，氨氧化钟1.5肖/1，甘油 40.Og/L，PTMl溶液 4. 35ml/L，抑为 5. 5。
[0039] 毕赤酵母发酵生产人膜岛素原的步骤（1)~（3)同实施例1，步骤（4)中诱导溫度 降为25°C，诱导抑为3. 0,步骤巧）中取样时间为诱导表达4化后每3~化取样一次，其 他同实施例1。检测结果表明，诱导57h时，发酵上清液中人膜岛素原的表达量达到最大值 2682mg/L(图2)，和对照实验相比，培养时间减少3她，表达量提高4. 3%。
[0040] 实施例3
[0041] 本实施例的产人膜岛素原的毕赤酵母发酵培养基为：蛋白腺lOg/l，黄豆粉Ig/L， 85%憐酸13.31111/1，碳酸巧0.4邑/1，屯水硫酸儀8.0邑/1，硫酸锭6.0邑/1，氨氧化钟2.5邑/1， 甘油 40.Og/l，PTMl溶液 4. 35ml/l，抑为 5. 5。
[0042] 毕赤酵母发酵生产人膜岛素原的步骤（1)~（3)同实施例1，步骤（4)中诱导溫度 降为28°C，诱导抑为5.0,步骤巧）同实施例2。检测结果表明，诱导54h时，发酵上清液中 人膜岛素原的表达量达到最大值2580mg/l，和对照实验相比，培养时间减少42h，表达量提 高 0. 3%。
[004引实施例4
[0044] 本实施例的产人膜岛素原的毕赤酵母发酵培养基为：蛋白腺lOg/l，黄豆粉Ig/L， 85%憐酸131111/1，碳酸巧0.3邑/1，屯水硫酸儀7.0邑/1，硫酸锭6.0邑/1，氨氧化钟1.5邑/1，甘 油 40.Og/l，PTMl溶液 4. 35ml/l，抑为 5 ~6。
[0045] 毕赤酵母发酵生产人膜岛素原的步骤（1)~（3)同实施例1，步骤（4)中诱导溫度 降为26°C，诱导抑为3. 25,步骤巧）同实施例1。检测结果表明，诱导60h时，发酵上清液 中人膜岛素原的表达量达到最大值3278mg/l，和对照实验相比，培养时间减少36h，表达量 提高27. 4%。
[004引实施例5
[0047] 本实施例的产人膜岛素原的毕赤酵母发酵培养基为：蛋白腺IgA,黄豆粉lOg/l， 85 %憐酸碳酸巧0. 4g/L，屯水硫酸儀7.Og/l，硫酸锭10.Og/l，氨氧化钟1. 5g/l，甘 油 40.Og/l，PTMl溶液 4. 35ml/L，抑为 5. 5。
[0048] 毕赤酵母发酵生产人膜岛素原的步骤（1)~（3)同实施例1，步骤（4)中诱导溫度 降为27°C，诱导抑为5.0,步骤巧）同实施例2。检测结果表明，诱导5化时，发酵上清液中 人膜岛素原的表达量达到最大值2808mg/l，和对照实验相比，培养时间减少4比，表达量提 高 9. 2%。
[004引实施例6
[0050] 本实施例的产人膜岛素原的毕赤酵母发酵培养基为：蛋白腺IgA,黄豆粉lOg/l， 85 %憐酸碳酸巧0. 3g/L，屯水硫酸儀8.Og/l，硫酸锭10.Og/l，氨氧化钟2. 5g/l，甘 油 40.Og/l，PTMl溶液 4. 35ml/L，抑为 5. 5。
[0051] 毕赤酵母发酵生产人膜岛素原的步骤（1)~（3)同实施例1，步骤（4)中诱导溫度 降为25°C，诱导抑为3. 25,步骤巧）同实施例2。检测结果表明，诱导57h时，发酵上清液 中人膜岛素原的表达量达到最大值3137mg/l，和对照实验相比，培养时间减少3她，表达量 提高22%。
[00閲实施例7
[0053] 本实施例的产人膜岛素原的毕赤酵母发酵培养基为：蛋白腺lOg/l，黄豆粉5g/L， 85%憐酸131111/1，碳酸巧0.33邑/1，屯水硫酸儀7.4邑/1，硫酸锭10.0邑/1，氨氧化钟2.0邑/1， 甘油 40.Og/l，PTMl溶液 4. 35ml/l，抑为 5. 5。
[0054] 毕赤酵母发酵生产人膜岛素原的步骤（1)~（3)同实施例1，步骤（4)中诱导溫度 降为26°C，诱导抑为4,步骤巧）同实施例2。检测结果表明，诱导6化时，发酵上清液中人 膜岛素原的表达量达到最大值3390mg/l，和对照实验相比，培养时间减少36h，表达量提高 31.8%。
[00财实施例8
[0056] 本实施例的产人膜岛素原的毕赤酵母发酵培养基为：蛋白腺lOg/l，黄豆粉5g/L， 85 %憐酸碳酸巧0. 33g/l，屯水硫酸儀7. 4g/l，硫酸锭8.Og/L，氨氧化钟2.Og/l，甘 油 40.Og/l，PTMl溶液 4. 35ml/L，抑为 5. 5。
[0057] 毕赤酵母发酵生产人膜岛素原的步骤（1)~（3)同实施例1，步骤（4)中诱导溫度 降为25°C，诱导抑为3. 25,步骤巧）同实施例2。检测结果表明，诱导63h时，发酵上清液 中人膜岛素原的表达量达到最大值3678mg/L(图3)，和对照实验相比，培养时间减少33h， 表达量提高43%。
[00则实施例9
[0059] 本实施例的产人膜岛素原的毕赤酵母发酵培养基为：蛋白腺lOg/l，黄豆粉IOg/ L85