%憐酸碳酸巧0. 33g/l，屯水硫酸儀7. 4g/l，硫酸锭6.Og/L，氨氧化钟2.Og/L， 甘油 40.Og/l，PTMl溶液 4. 35ml/l，抑为 5. 5。
[0060] 毕赤酵母发酵生产人膜岛素原的步骤（1)~（3)同实施例1，步骤（4)中诱导溫度 降为25°C，诱导抑为3.5,步骤巧）同实施例2。检测结果表明，诱导6化时，发酵上清液中 人膜岛素原的表达量达到最大值3435mg/l，和对照实验相比，培养时间减少30h，表达量提 局 33 %。
[00川实施例10
[0062] 本实施例的产人膜岛素原的毕赤酵母发酵培养基为：蛋白腺20g/l，黄豆粉IOg/ 以85%憐酸141111/1，碳酸巧0.4邑/1，屯水硫酸儀7.0邑/1，硫酸锭6.0邑/1，氨氧化钟2.5邑/1， 甘油 40.Og/l，PTMl溶液 4. 35ml/l，抑为.5。
[0063] 毕赤酵母发酵生产人膜岛素原的步骤（I)~（3)同实施例1，步骤（4)中诱导溫度 降为25°C，诱导抑为3. 25,步骤巧）同实施例2。检测结果表明，诱导72h时，发酵上清液 中人膜岛素原的表达量达到最大值3544111旨/1，和对照实验相比，培养时间减少2地，表达量 提高37%。
[0064] 实施例11
[0065] 本实施例的产人膜岛素原的毕赤酵母发酵培养基为：蛋白腺20g/l，黄豆粉Ig/L， 85%憐酸131111/1，碳酸巧0.4邑/1，屯水硫酸儀7.0邑/1，硫酸锭6.0邑/1，氨氧化钟2.5邑/1，甘 油 40.Og/l，PTMl溶液 4. 35ml/L，抑为 5. 5。
[0066] 毕赤酵母发酵生产人膜岛素原的步骤（1)~（3)同实施例1，步骤（4)中诱导溫度 降为25°C，诱导抑为3. 25,步骤巧）同实施例2。检测结果表明，诱导69h时，发酵上清液 中人膜岛素原的表达量达到最大值3253mg/l，和对照实验相比，培养时间减少27h，表达量 提高26. 5%。
[0067] 实施例12
[0068] 本实施例的产人膜岛素原的毕赤酵母发酵培养基为：蛋白腺20g/l，黄豆粉Ig/L， 85 %憐酸13. 3ml/l，碳酸巧0. 3g/L，屯水硫酸儀8.Og/l，硫酸锭10.Og/l，氨氧化钟1. 5g/L， 甘油 40.Og/l，PTMl溶液 4. 35ml/l，抑为 5. 5。
[0069] 毕赤酵母发酵生产人膜岛素原的步骤（1)~（3)同实施例1，步骤（4)中诱导溫度 降为25°C，诱导抑为3. 25,步骤巧）同实施例2。检测结果表明，诱导69h时，发酵上清液 中人膜岛素原的表达量达到最大值3499mg/l，和对照实验相比，培养时间减少27h，表达量 提局36%。
[0070] 实施例13
[0071] 本实施例的产人膜岛素原的毕赤酵母发酵培养基为：蛋白腺20g/l，黄豆粉IOg/ L85 %憐酸碳酸巧0. 4g/L，屯水硫酸儀8.OgA,硫酸锭10.Og/l，氨氧化钟2. 5g/L， 甘油 40.Og/l，PTMl溶液 4. 35ml/l，抑为 5. 5。
[0072] 毕赤酵母发酵生产人膜岛素原的步骤（1)~（3)同实施例1，步骤（4)中诱导溫度 降为28°C，诱导抑为5.0,步骤巧）同实施例2。检测结果表明，诱导6化时，发酵上清液中 人膜岛素原的表达量达到最大值3054mg/l，和对照实验相比，培养时间减少27h，表达量提 高 18. 7%。
[0073] 表1为各实施例及对照实验中的培养基配方及表达量结果。表中的结果表明：本 发明中提供的培养基，相对于常规使用的BSM培养基，通过改变无机盐组分或浓度，降低培 养基中的总盐含量，并添加毕赤酵母发酵所需的氮源，既缩短了培养时间，又能得到高表达 量的人膜岛素原，提高了生产的效率。
[0074] 表一各实施例及对照实验中的培养基配方及表达量结果对比
[00巧]
【主权项】
1. 一种产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基，其特征在于，配方为：蛋白胨1~20g/L， 黄豆粉1~l〇g/L，85%磷酸13~14ml/L，碳酸钙0? 3~0? 4g/L，七水硫酸镁7. O~8. Og/ L，硫酸铵6~10g/L，氢氧化钾L 5~2. 5g/L，甘油40.0 g/L，PTMl溶液4. 35ml/L，pH为5~ 6〇2. 根据权利要求1所述的一种产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基，其特征在于，配 方为：蛋白胨l〇g/L，黄豆粉5g/L，85%磷酸13ml/L，碳酸钙0. 33g/L，七水硫酸镁7. 4g/L， 硫酸铵 8g/L，氢氧化钾 2g/L，甘油 40.0 g/L，PTMl 溶液 4. 35ml/L，pH 为 5. 5。3. 根据权利要求1所述的一种产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基，其特征在于，配 方为：蛋白胨20g/L，黄豆粉10g/L，85%磷酸14ml/L，碳酸钙0. 4g/L，七水硫酸镁7g/L，硫 酸铵 6g/L，氢氧化钾 2. 5g/L，甘油 40.0 g/L，PTMl 溶液 4. 35ml/L，pH 为 5. 5。4. 根据权利要求1-3任一项所述的一种产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基，其特征 在于，所述蛋白胨为微生物蛋白胨或酵母蛋白胨。5. 利用权利要求1-3任一项所述的毕赤酵母发酵培养基进行毕赤酵母发酵产人胰岛 素原的方法，其特征在于，包含以下步骤： (1) 种子液的制备：将保存的毕赤酵母甘油菌种接于含100ml YH)培养基的500ml摇 瓶，30°C，250rpm摇床培养19~20h，作为种子液； (2) 分批培养发酵：IL种子液接入含19L发酵培养基的50L发酵罐中，起始培养条件为 30°C，pH 5. 0,转速300rpm，通气量0. 5m3/h。随着培养的进行，相应增大转速和通气量，控 制溶氧20~30%，培养19~21h ; (3) 分批甘油补料培养：分批培养结束后，以l〇ml/h/L的速率流加含12ml/LPTMl溶液 的50 %甘油5~6h，培养过程中调整转速和通气量控制溶氧20~30% ; (4) 甲醇诱导培养：分批甘油补料结束后，诱导温度降为25~28°C，诱导pH调为3. 0~ 5. 0,以3. 6ml/h/L的速率流加含12ml/L PTMl溶液的甲醇5~6h后，增大甲醇补料速率为 10ml/h/L，直至发酵结束。诱导过程中调整转速和通气量控制溶氧20~30% ; (5) 取样及发酵结束：甲醇诱导培养开始后，每3~12小时取发酵液样品一次，3000~ 12000rpm离心5~10min，测定上清液中人胰岛素原表达量，待表达量增加缓慢或减少时， 结束发酵。6. 根据权利要求5所述的一种进行毕赤酵母发酵产人胰岛素原的方法，其特征在于， 步骤（2)中使用权利要求1-3中任一项所提供的培养基。7. 根据权利要求5所述的一种进行毕赤酵母发酵产人胰岛素原的方法，其特征在于， 步骤（4)中诱导温度为25°C。8. 根据权利要求5所述的一种进行毕赤酵母发酵产人胰岛素原的方法，其特征在于， 步骤（4)中所述的适宜毕赤酵母发酵的诱导pH为3. 25。9. 根据权利要求1所述的一种产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基，其特征在于，该 培养基用于毕赤酵母发酵产人胰岛素原。10. 根据权利要求1所述的一种产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基，其特征在于，毕 赤酵母以巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)GS115作为表达宿主的基因重组菌，所述的发 酵为在发酵罐中利用毕赤酵母进行甲醇诱导表达外源蛋白人胰岛素原。
【专利摘要】本发明涉及一种产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基，该培养基配方为：蛋白胨1～20g/L，黄豆粉1～10g/L，85％磷酸13～14ml/L，碳酸钙0.3～0.4g/L，七水硫酸镁7.0～8.0g/L，硫酸铵6～10g/L，氢氧化钾1.5～2.5g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为5～6；本发明还包括基于上述培养基利用毕赤酵母产人胰岛素原的发酵方法，利用本方法，人胰岛素原表达量可提高43％，并且大幅减少发酵时间24～42小时，获得了比常规方法更高的产率。
【IPC分类】C12R1/84, C12P21/02
【公开号】CN105154500
【申请号】CN201510641590
【发明人】张颖, 孔凡楼, 孙健, 闫飞, 孙剑峰
【申请人】济南康和医药科技有限公司
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年9月30日