一种盐穗木金属硫蛋白发酵工艺及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物发酵技术领域，具体的，本发明设及盐穗木金属硫蛋白发酵工艺 及其应用的技术领域。
【背景技术】
[000引金属硫蛋白（必6紅心0(知'0打ei打，MT)是一类广泛存在于生物体内的低分子量、富 含半脫氨酸的金属结合蛋白。与其结合的金属主要是儒、铜和锋，广泛地存在于从微生物到 人类各种生物中，其结构高度保守。1957年Margoshes和Val Ies在研究儒的生物学作用时， 从蓄积儒的马肾中首次分离出该物质。MT具有W下几个特征：分子量低，一般为6~7kD; 能馨合金属离子，蛋白通过硫醋键与金属结合后，具有特殊的光吸收特征；半脫氨酸含量 高，约占氨基酸残基总数的239K33%，但不形成二硫键，分子中缺乏芳香族氨基酸和组氨 酸；半脫氨酸残基在氨基酸序列中具有较为保守的排列方式。金属硫蛋白丰富的琉基含量 及重金属结合能力决定了其功能的多样性。
[0003] 盐穗木（偏知6紅cawica)为襲科盐穗木属，是生长在荒漠、半荒漠盐碱地上 的重要盐生、旱生稀盐多汁半灌木植物，对盐分适应性极强，是盐±荒漠主要植物之一。在 高盐和重金属胁迫下，其体内的金属硫蛋白基因表达水平呈明显上升趋势。目前国内生产 MT的厂家，主要从兔肝中提取，由于MT原料需求特别，且生产工艺复杂，导致目前MT产量不 大且价格昂贵。现有文献已经披露了一种盐穗木金属硫蛋白基因及其重组蛋白与应用该U 忠渊，专利【申请号】2013105667426),现有技术公开了一种仅适用于实验室小规模制备盐穗 木金属硫蛋白的方法，实验室制备盐穗木金属硫蛋白具有成本高、提取率低等限制因素，且 现有文献中并未披露一种适于工业化生产盐穗木金属硫蛋白的技术方案，随着盐穗木金属 硫蛋白产品的用途不断扩大、用量不断增加，国内外盐穗木金属硫蛋白的产量远远不能满 足市场实际需求，所W急需一种高产量、低成本、安全性高、适宜于工业化生产盐穗木金属 硫蛋白的工艺方法。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术中未见有关工业化生产盐穗木金属硫蛋白的方法的研究现状，本 发明目的旨在于提供一种盐穗木金属硫蛋白发酵工艺及其应用，通过条件优化得到改良后 的发酵培养基，采用发酵罐放大生产，从而提高盐穗木金属硫蛋白产量，克服了目前盐穗木 金属硫蛋白制备领域中高成本低产量的现状。本发明改变了传统金属硫蛋白的生产方法， 通过使用本发明的盐穗木金属硫蛋白发酵工艺，可大幅度提高盐穗木金属硫蛋白的产量， 适于工业化生产。
[0005] 本发明为实现W上技术目的，提供一种盐穗木金属硫蛋白的发酵工艺及其应用， 具体发酵步骤如下： 将现有技术中获得的重组表达转化体在37°C培养过夜，再W 2%的比例接种到改良后 的发酵培养基，在全自动发酵罐进行发酵，装液系数为0. 5,添加消泡剂后整体灭菌，通气量 设为IL/min，保持溫度37°C、揽拌转速10化/min,发酵4h后，加入浓度为6mmol/L乳糖 进行诱导，继续发酵地后，将发酵液W8000巧m离屯、IOmin得到菌体，再用PBS洗涂离屯、S 次，105°C干燥1.化后恒重称量制备获得盐穗木金属硫蛋白的菌体干重。
[0006] 具体的，本发明还提供一种适于盐穗木金属硫蛋白发酵的改良培养基，通过条件 优化得到改良后的发酵培养基，按重量计包括两部分：一部分为900mL的培养基，含有4g 薦糖，24g酵母浸粉，Sg蛋白腺；另一部分为IOOmL的憐酸缓冲液，其中含有2. 31gKH2PO4， 12. 54gK2HPO4?抓2〇,将两部分分别高压灭菌后混合配制IL的改良培养基。
[0007] 本发明基于已有现有技术"一种盐穗木金属硫蛋白基因及其重组蛋白与应用 忠渊，专利【申请号】2013105667426)已公开了盐穗木金属硫蛋白基因与质粒祀T-32a(+)重 组构建了原核表达载体，重组的原核表达载体再转化至大肠杆菌E.COliBL21 (DE3)获得 了重组表达转化体。
[0008] 本发明基于已有现有技术"一种盐穗木金属硫蛋白基因及其重组蛋白与应用 忠渊，专利【申请号】2013105667426)提供的盐穗木金属硫蛋白，所述的盐穗木金属硫蛋白基 因全长为234bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA;该序列无内含子，具有完整的开放 阅读框，编码78个氨基酸；编码产物，即本发明盐穗木金属硫蛋白的氨基酸序列如表中SEQ IDNO. 2所示；分子量为7. 7kD，等电点为4. 78 ;含14个半脫氨酸和15个甘氨酸。
[0009] 本发明基于已有现有技术"一种盐穗木金属硫蛋白基因及其重组蛋白与应用 忠渊，专利【申请号】2013105667426)提供的盐穗木金属硫蛋白采用的重组表达载体，包含 本发明采用的盐穗木金属硫蛋白基因的核巧酸序列；该重组表达载体的载体骨架优选原核 表达载体，更优选祀T-32a(+)，该重组表达转化体优选细菌，更优选大肠杆菌E.COliBL21 (DE3)。
[0010] 本发明基于已有现有技术"一种盐穗木金属硫蛋白基因及其重组蛋白与应用"（?] 忠渊，专利【申请号】2013105667426)提供的盐穗木金属硫蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ IDNO. 2所示。获得的重组盐穗木金属硫蛋白属于II型金属硫蛋白，其所编码的盐穗木金 属硫蛋白成熟肤为78个氨基酸，分子量为7. 7kD，等电点为4. 78,含14个半脫氨酸和15个 甘氨酸。
[0011] 本发明提供所述的发酵盐穗木金属硫蛋白在医药、食品保健、化妆品添加剂、环保 等领域中的应用。
[0012] 通过实施本发明具体的
【发明内容】
，可W达到W下有益效果： (1)本发明提供一种盐穗木金属硫蛋白的发酵工艺及其应用，通过条件优化得到了改 良的发酵培养基，按重量计其成分包括两部分：一部分为900mL的培养基，含有4g薦糖， 24g酵母浸粉，Sg蛋白腺；另一部分为IOOmL的憐酸缓冲液，其中含有2. 31gKHzPO" 12. 54g K2HPO4? 3&0,将两部分分别高压灭菌后混合配制IL的改良培养基。经6mmol/L乳糖诱导 地后，经过发酵罐放大发酵，使得菌体量达到2.68g/l，比摇瓶培养提高了 31%，适宜放大培 养。
[0013] (2)本发明提供的一种盐穗木金属硫蛋白的发酵工艺及其应用，改变了盐穗木金 属硫蛋白制备过程中成本高、产量低的现状，能够大幅度提高盐穗木金属硫蛋白的产量，并 适于工业化大规模生产，对金属硫蛋白应用领域体现出深远的意义。
【附图说明】
[0014] 图1显示为重组大肠杆菌生长曲线的测定图。
[0015] 图2显示为不同碳源对菌体量的影响图。
[0016] 图3显示为不同浓度薦糖对生长量的影响图。
[0017] 图4显示为酵母粉浓度对菌体量的影响图。
[0018] 图5显示为蛋白腺浓度对菌体量的影响图。
[0019] 图6显示为憐酸盐浓度对菌体生物量的影响图。
[0020] 图7显示为优化培养基的验证试验图。
[0021] 图8显示为SDS-PAGE检测重组蛋白表达情况图，2、4、6、8、10、12代表不同单克隆 1-6重组菌诱导前总蛋白，1、3、5、7、9、11代表不同单克隆1-6重组菌诱导后总蛋白。
[0022] 图9显示为SDS-PAGE检测重组蛋白表达情况图，1、4、7、10、13、16代表重组菌诱导 前总蛋白，2-3、5-6、8-9、11-12、14-15、17-18:6、8、10、12、14和16臟〇1/1代表乳糖诱导 重组菌后总蛋白。
[002引图10显示为不同诱导时间重组蛋白表达情况图，1、11代表诱前总蛋白；2-4代表 诱导Ih;5-7代表诱导化；8-10代表诱导化；12-14代表诱导4h; 15-17代表诱导化；18-20 代表诱导化。
【具体实施方式】
[0024] 下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的 说明中，如无特别说明，％皆指m/m质量百分比。
[00巧]本发明W下提供的实施例是基于已有现有技术"一种盐穗木金属硫蛋白基因及其 重组蛋白与应用"该U忠渊，专利【申请号】2013105667426)已公开了盐穗木金属硫蛋白基 因与质粒祀T-32a(+)重组构建了原核表达载体，重组的原核表达载体再转化至大肠杆菌 E.COliBL21 (DE3)获得了重组表达转化体，并在采用已有的重组表达转化体基础上进行如 下盐穗木金属硫蛋白的发酵工艺。
[0026] 本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实 施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明W下实施方式的实施。
[0027] 实施例一：一种盐穗木金属硫蛋白的发酵工艺 一种盐穗木金属硫蛋白的发酵工艺，具体发酵工艺步骤如下： (1)培养基的配置和灭菌 通过条件优化得到了改良的发酵培养基，按重量计其成分包括两部分：一部分为900mL的培养基，含有4g薦糖，24g酵母浸粉，Sg蛋白腺；另一部分为IOOmL的憐酸缓冲液，其 中含有2. 31g皿2?〇4,12. 54gK2HPO4.SHzO,将两部分分别高压灭菌后混合配制IL的改良培 养基。
[0028] (2)发酵罐扩大培养 将现有发明中获得的重组表达转化体在37°C培养过夜，再W2%的比例接种到改良后 的发酵培养基，在全自动发酵罐进行发酵，装液系数为0. 5,添加消泡剂后整体灭菌，通气量 设为1L/min，保持溫度37°C、揽拌转速10化/min,发酵4h后，加入浓度为6mmol/L乳糖 进行诱导，继续发酵地后，将发酵液W8000巧m离屯、IOmin得到菌体，再用PBS洗涂离屯、S 次，105°C干燥I.化后恒重称量盐穗木金属硫蛋白的菌体干重。
[0029] 实施例二：盐穗木金属硫蛋白的发酵工艺中培养基的选择 采用的初始发酵培养基为TB培养基，初始发酵条件为：接种量1% (V/V)，装液量30/250 血，溫度37°C，转速200r/min摇床培养至