具有减少的发泡的发酵工艺的制作方法
【专利说明】具有减少的发泡的发醒工艺 发明领域
[0001] 本发明设及减少用于从可易于发酵的糖材料生产发酵产物、例如乙醇的发酵工艺 中的发泡。
[000引对序列表的引用
[0003] 本申请包含一个计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在 此。
[0004] 发明背景
[0005] 可W从各式各样的可再生的原料生产发酵产物，例如乙醇。运些可W被分类为Ξ 个主要组：（1)可易于发酵的糖材料，例如甘薦（即甘薦汁汁和糖蜜）、甜菜、甜高梁；（2)淀 粉性材料，例如玉米、马铃馨、稻、小麦、龙舌兰；W及（3)纤维素材料，例如賴杆、草类、玉米 忍、木头和甘薦渣。可易于发酵的糖材料包含可W容易地被酵母发酵的单糖，例如薦糖、葡 萄糖和果糖。与淀粉性和纤维素原料相反，不需要多糖类，例如淀粉和/或纤维素/半纤维 素的预先水解。
[0006] 可易于发酵的糖材料，例如甘薦汁和糖蜜，被用作例如己西乙醇生产中的底物。 酵母，例如尤其是酿酒酵母，被用作发酵有机体。通常使用酵母再循环系统，其中高达 90% -95%的酵母被从一个发酵循环再用于下一个发酵循环。运导致发酵池内非常高的细 胞密度（例如8%-17%w/v，湿量基准）并且导致非常短的发酵时间。在约32。在6-11 小时的时段内，达到(v/v)的乙醇浓度。在每一次分批发酵后，通过离屯、收集酵母 细胞，酸洗（例如在抑1.5-3. 0用硫酸洗涂1-2小时）并且发送回发酵池。现今，在每一 循环后，在酸洗期间按固定剂量添加化学消泡剂（分散剂），并且将另一种化学消泡剂（止 泡剂）直接自动地（当泡沫达到料位探测器时）或手动地添加至发酵池，直至完全控制泡 沫。
[0007] US3, 959, 175披露了包含液体聚下締的水性消泡剂组合物。消泡剂组合物可W进 一步包括部分地疏水性二氧化娃和娃酬油。
[0008] US5, 288, 789披露了已经被聚烷氧基化的烷基酪和醒的缩合物用来减少发酵液 中的泡沫的用途。
[0009] US6, 083, 998用于醇发酵的消泡剂组合物，该组合物是水基的并且包括聚二甲基 硅氧烷油、环氧乙烧/环氧丙烷嵌段共聚物和娃酬/二氧化娃渗合物。
[0010] 当从可易于发酵的糖材料，例如甘薦汁和糖蜜生产乙醇时，由发酵有机体产生的 泡沫是严重问题。
[0011] 即使可W使用化学消泡剂，但是仍希望并且需要提供用于生产发酵产物，例如乙 醇的工艺，在运些工艺中泡沫产生是被减少/控制的。
[001引发明概述
[0013] 当从可易于发酵的糖材料，例如甘薦汁和糖蜜生产发酵产物，尤其例如是乙醇时， 由发酵有机体产生的泡沫是严重问题。因此，本发明的目标是当从可易于发酵的糖材料，例 如甘薦糖蜜生产发酵产物，尤其例如是乙醇时，减少在发酵期间由发酵有机体产生的泡沫。 诸位发明人令人惊讶地发现蛋白酶可w用于有效地解决发泡问题。
[0014] 本发明设及使用发酵有机体，在包含发酵培养基的发酵池中，从可易于发酵的糖 材料生产发酵产物的工艺，该工艺包括
[0015] i)将可易于发酵的糖材料进料至包含发酵有机体的浆料的发酵池中；
[0016] ii)将可易于发酵的糖材料发酵为希望的发酵产物，
[0017] 其中在W下时刻添加蛋白酶
[001引a)在步骤U中的进料之前、期间和/或之后，和/或 [001引b)在步骤ii)中的发酵期间。
[0020] 在一个实施例中，将可易于发酵的糖材料作为进料流而进料至发酵池中。蛋白酶 可W与可易于发酵的糖材料的进料流混合。在一个优选实施例中，在进料步骤i)之前，将 蛋白酶与进料流混合。
[0021] 在步骤ii)中的发酵之后，例如通过离心收集/分离（用过的）发酵有机体。然 后酸洗收集的发酵有机体，例如使用硫酸，在抑1. 5-3. 0,例如2. 0-2. 5,酸洗1-2小时。此 后使发酵有机体返回发酵池，并且在一个或多个随后的发酵循环中（重新）用于发酵。因 此，在一个实施例中，可W通过在水中再悬浮酸处理的酵母生物质，来制备发酵有机体的浆 料，例如酵母浆料。在本发明的一个实施例中，在进料至步骤i)中的发酵有机体的浆料中 之前，可W将蛋白酶添加至W下项或与W下项混合：可易于发酵的糖材料，例如甘薦糖蜜。 在另一实施例中，在将可易于发酵的糖材料进料至步骤i)中的发酵有机体的浆料期间，可 W将蛋白酶添加至发酵有机体的浆料。在另一实施例中，可W在步骤ii)的发酵期间添加 蛋白酶。在一个优选实施例中，作为一个分批工艺或分批进料工艺来进行发酵。然而，还可 W作为半连续的或连续的工艺来进行发酵。
[0022] 在一个优选实施例中，蛋白酶是细菌蛋白酶，例如细菌丝氨酸蛋白酶，例如源自火 球菌属的菌株，例如强烈火球菌的菌株的细菌丝氨酸蛋白酶，尤其是在此的SEQIDN0:2中 示出的蛋白酶，或具有与US6, 358, 726中的SEQIDNO: 1或在此的SEQIDNO: 2具有至少 60 %，例如至少70 %、例如至少80 %、例如至少85 %、例如至少90 %、例如至少95 %、例如至 少96%、例如至少97%、例如至少98%、例如至少99%-致性的蛋白酶。
[002引在另一优选实施例中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，例如肤酶家族S53蛋白酶。肤酶家 族S53的丝氨酸蛋白酶包括两种不同类型的肤酶肤氨肤酶（外切型）和内切肤酶；如在 1993,生物化学杂志度iochem. )J. 290:205-218和在MER0PS蛋白酶数据库，发行9. 4(2011 年1月31日）（WWW.merops.ac.uk)中所述的。该数据库描述于罗林斯（Rawlings)，N.D.， 己雷特度arrett)，A.J.和贝特曼度ateman)，A.，2010，"MER0PS:肤酶数据库（MER0PS:the P巧tidasedat油ase)"，核酸研究（Nucl.AcidsRes. )38:D227-D233 中。在一个优选实施 例中，蛋白酶是源自亚灰树花菌属的菌株，优选是大型亚灰树花菌的菌株的肤酶家族S53 蛋白酶。在一个实施例中，蛋白酶是W0 2014/037438中的实例2中设及的并且示出为在此 的SEQIDNO: 7的、来自大型亚灰树花菌蛋白酶3 (肤酶家族S53蛋白酶）的成熟序列。在 一个实施例中，蛋白酶是示出为在此的SEQIDN0:6和W0 2014/037438中的SEQIDN0:5 的、来自大型亚灰树花菌的成熟蛋白酶3序列。在一个实施例中，蛋白酶（例如丝氨酸蛋白 酶）能够切割在发酵有机体（例如酵母，具体地是酿酒酵母）的表面上的细胞壁蛋白，在步 骤ii)中，发酵可易于发酵的糖材料为希望的发酵产物，具体地是乙醇。在一个实施例中， 蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶，能够切割在发酵有机体的表面上的细胞壁蛋白，例如甘露糖蛋 白。在一个实施例中，蛋白酶，例如丝氨酸蛋白，能够降解释放自发酵有机体的蛋白，例如甘 露糖蛋白。在一个实施例中，蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶，能够水解发酵的可易于发酵的糖 材料，例如发酵的糖蜜（酒）中的蛋白。本发明还设及当从可易于发酵的糖，例如，如权利 要求书中所限定，生产希望的发酵产物时，蛋白酶用于减少由发酵有机体产生的泡沫的用 途。在一个优选实施例中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，具体地是强烈火球菌蛋白酶或家族S53 蛋白酶，尤其是大型亚灰树花菌蛋白酶3。
[0024] 附图简述
[0025] 图1示出了伴随9个循环的发酵，对照（无酶添加）中的平均生物质和蛋白酶处理 的样品的平均生物质之间的比较（对于循环9和10,2. 5、5和lOppm;1. 9、3. 7和7. 5ppm)。 在最后一个发酵批次后，取点10。
[0026] 图2示出了伴随9个循环的发酵，对照（无酶添加）样品中的平均生存力和经处理 的样品的平均生存力之间的比较（对于循环9和10, 2. 5、5和lOppm;1. 9、3. 7和7. 5ppm)。
[0027] 图3示出了经5个循环的发酵，对照（既无止泡剂添加也无酶添加）、两种工业止 泡剂（止泡剂1和止泡剂2)、化及蛋白酶（P化巧的平均乙醇生产量[g化0田之间的比较。
[0028] 图4示出了经5个循环的发酵，对照（既无止泡剂添加也无酶添加）、两种工业止 泡剂（止泡剂1和止泡剂2)、W及蛋白酶P化S的平均酵母细胞生存力[%]之间的比较。 [002引图5示出了用不同蛋白酶处理，来自发泡酵母度RT)的和非发泡酵母（CAT-1)的 发酵上清液（酒）的蛋白片段的SDS-PAGE分析。标记示出为Kda，并且用箭头指示了一些 蛋白片段。泳道如下：
[0030]
[0031]
[00础发明详述
[0033] 本发明的目标是当从可易于发酵的糖材料，尤其例如是甘薦糖蜜生产希望的 发酵产物，尤其例如是乙醇时，减少在发酵期间由发酵有机体，尤其是发泡酵母，例如是 酵母属的酵母，具体地是酿酒酵母产生的发泡。在一个优选实施例中，本发明设及己西 型乙醇发酵工艺，例如，如由己索度asso)等人，在（2011)年，在"己西乙醇生产：工业 工艺及其对酵母发酵、生物燃料生产近期发展和前景的影响巧thanolPro化ctionin Brazil:TheIndustrialProcessandItsImpactonYeastFermentation,Biofuel Production-RecentDevelopmentsandProspects),马尔科奥雷利奥多斯桑托斯柏纳德斯 博±(MarcoAurelioDosSantosBernardes)(编辑），ISBN:978-953-3〇7_478-8,印天科 技（InTech)"中。总体上己西乙醇工艺包括再循环发酵有机体，尤其是发泡发酵酵母，例如 酿酒酵母，并且是作为一个分批工艺或分批进料工艺进行的。然而，一些工厂进行半连续的 或连续的发酵工艺。
[0034] 诸位发明人已经发现根据本发明，添加蛋白酶的多个令人惊讶的优点。
[0035] 通过添加来自强烈火球菌的丝氨酸蛋白酶，减少了当从甘薦糖蜜生产乙醇时，发 酵期间由某一发泡酵母（即发泡酿酒酵母）产生的泡沫的量。（蛋白酶P化巧。运描述于 实例1和2中。
[0036] 诸位发明人还发现，与使用商业化学消泡剂相比，当根据本发明使用蛋白酶作为 消泡剂时，增加了乙醇产量。实例3和图3比较了经5个循环的发酵，对照（既无止泡剂添 加也无酶添加）、两种工业止泡剂（止泡剂1和止泡剂2)、W及蛋白酶P化S的平均乙醇生 产量。当与两种商业止泡剂产品相比较时，对于在本发明的工艺中再循环的酿酒酵母而言， 乙醇产量更高。
[0037] 图4比较了经5个循环的发酵，对照（既无止泡剂添加也无酶添加）、两种工业止 泡剂（止泡剂1和止泡剂2)、W及蛋白酶P化S的平均酵母细胞生存力。当与两种商业止泡 剂产品相比较时，对于在本发明的工艺中再循环的酿酒酵母而言，酵母的生存力更高。当与 对照和根据本发明用蛋白酶处理相比较时，用工业止泡剂处理的样品示出生存力方面的增 加的下降。诸位发明人还发现，当在甘薦糖蜜发酵中添加蛋白酶MuS和Mg蛋白酶3时，没 有产生泡沫。实例4示出由发酵培养基中的酵母细胞释放的某些蛋白（像甘露糖蛋白）降 解。当在合成甘薦糖蜜中添加Snapalysin蛋白酶和EVE民LAS正还蛋白酶时，产生了发酵 泡沫，并且同一蛋白（像甘露糖蛋白）并不水解。更确切地，本发明设及使用发酵有机体， 在包含发酵培养基的发酵池中，从可易于发酵的糖材料，尤其是甘薦糖蜜生产发酵产物的 工艺，该工艺包括：
[0038] i)将该可易于发酵的糖材料进料至包含发酵有机体的浆料的该发酵池中；
[0039] ii)将可易于发酵的糖材料发酵为希望的发酵产物，
[0040] 其中在W下时刻添加蛋白酶
[00川 a)在步骤U中的进料之前、期间和/或之后，和/或
[004引b)在步骤ω中的发酵期间。
[0043] 使用发泡发酵有机体，例如发泡酵母，例如酵母属的发泡菌株，例如酿酒酵母的发 泡菌株，来进行发酵。在一个实施例中，将可易于发酵的糖材料作为进料流而进料至发酵池 中。可W将蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶，尤其是强烈火球菌蛋白酶或家族S53蛋白酶，尤其 是大型亚灰树花菌蛋白酶3,与可易于发酵的糖材料的进料流混合。在一个优选实施例中， 在进料步骤i)之前，将蛋白酶与进料流混合。
[0044] 根据本发明，术语"可易于发酵的糖材料"是指待转化/发酵为希望的发酵产物， 尤其例如是乙醇的含糖起始材料，该含糖起始材料是属于包含可w容易地被发酵有机体， 尤其例如是源自酿酒酵母的酵母菌株发酵的单糖，例如薦糖、葡萄糖和果糖的一类。
[0045] 根据本发明，术语"发酵池"是指并且包括其中进行发酵的任何类型的发酵池、发 酵容器、发酵罐、或发酵器皿、或类似物。
[0046] 根据本发明，可W同时或相继地进行步骤i)和ii)。可W在从25°C至40°C、例如 从28°C至35°C、例如从30°C至34°C、优选地约32°C的一个溫度下进行发酵。在一个实施例 中，发酵进行2至120小时，具体地4至96小时。在一个实施例中，发酵可W进行小于24 小时、例如小于12小时、例如在6和12小时之间。
[0047] 与含淀粉原料，例如玉米、小麦、黑麦、蜀泰、高梁等，和纤维素原料，例如玉米忍、 玉米賴杆、甘薦渣、麦賴、木头等相反，不需要发酵前的预处理和/或（预先）水解。在一个 优选实施例中，可易于发酵的糖材料选自下组，该组由W下各项组成：甘薦汁、甘薦糖蜜、甜 高梁、甜菜、及其混合物。然而，根据本发明，发酵培养基还可W进一步包括甘薦的其他副产 物，具体地是来自甘薦渣的水解产物。在一个实施例中，发酵培养基可W包括分开的流，运 些流包含例如巧汁、等。根据本发明，可易于发酵的糖材料（底物）并不包括多糖，例如淀 粉和/或纤维素/半纤维素的实质内容物。
[0048] 在一个优选实施例中，用于本发明的工艺的发酵有机体可W是发泡发酵有机体， 该发泡发酵有机体能够将可易于发酵的材料发酵为希望的发酵产物，尤其例如是乙醇。现 今商业上使用（例如在己西）的很多商业酵母菌株，尤其包括酿酒酵母的菌株，例如用于从 甘薦糖蜜生产乙醇，在发酵期间产生泡沫。在一个实施例中，该发酵有机体是酵母，例如来 自酵母属的菌株，例如酿酒酵母的菌株。因此，在一个优选实施例中，发酵有机体是发泡发 酵有机体，例如酵母属的发泡菌株，尤其例如是在发酵期间产生泡沫的酿酒酵母的菌株。根 据本发明，发酵培养基中的酵母的密度是高的，例如是从8%-17%w/v(发酵培养基的湿量 基准）。在一个实施例中，在非无菌条件下发生发酵，例如，还可W将具有发泡表型的野生酵 母菌株引入发酵池，并且并入酵母群体。
[0049] 在本发明的一个优选实施例中，在步骤ii)中的发酵之后，将发酵有机体再循环。 根据本发明，将从50 % -100 %、例如70 % -95 %、例如约90 %的发酵有机体再循环。在步骤 ii)中的发酵之后，收集发酵有机体，例如酵母，酸洗，并且再循环至发酵池。然后用硫酸来 酸洗发酵有机体，例如，在抑1. 5-3. 0,如2. 0-2. 5下，酸洗例如1-2小时。可W作为一个分 批发酵或分批进