4PA112PA126VD14化
[0125] 在一个优选实施例中，蛋白酶是在此的SEQIDNO: 1中示出的澄色嗜热子囊菌蛋 白酶的变体，具有选自下组的突变，该组由W下各项组成：
[0126] -A27K+D7 化巧 82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D14 化；
[0127] -D7 化巧 82F+S87G+A112P+D14 化；
[0128] -Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D14 化；
[0129] -Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D14 化。
[0130] 在一个另外的实施例中，蛋白酶可W是丝状真菌蛋白酶，例如源自根毛霉属，例如 米黑根毛霉的菌株，例如是在此的SEQIDN0:3中示出的蛋白酶，或与其具有至少60%、至 少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序 列一致性的蛋白酶。
[0131] 在一个优选实施例中，蛋白酶是真菌丝氨酸蛋白酶，例如丝氨酸肤酶家族S53蛋 白酶（"S53蛋白酶"），例如源自亚灰树花菌属的菌株，优选是大型亚灰树花菌的菌株的家 族S53蛋白酶。在一个实施例中，家族S53蛋白酶是W0 2014/037438中的实例2中设及的 并且示出为在此的SEQIDN0:7的来自大型亚灰树花菌蛋白酶3的成熟序列。在一个实施 例中，蛋白酶是示出为在此的SEQIDN0:6的、来自大型亚灰树花菌蛋白酶3的成熟序列。 [013引在一个实施例中，S53蛋白酶是与在此的SEQIDN0:7具有至少60%、例如至少 70 %、例如至少80 %、例如至少85 %、例如至少90 %、例如至少95 %、例如至少96 %、例如至 少97%、例如至少98%、例如至少99%-致性的蛋白酶。
[013引在一个实施例中，S53蛋白酶是与在此的SEQIDN0:6具有至少60%、例如至少 70 %、例如至少80 %、例如至少85 %、例如至少90 %、例如至少95 %、例如至少96 %、例如至 少97%、例如至少98%、例如至少99%-致性的蛋白酶。 阳134] 细荫軍白酶
[0135] 在一个实施例中，蛋白酶是细菌来源的。
[0136] 在一个优选实施例中，蛋白酶是源自火球菌属的菌株，优选是强烈火球菌的菌株。
[0137] 在一个优选实施例中，蛋白酶是US6, 258, 726中的SEQIDNO: 1或在此的SEQID N0:2中示出的蛋白酶。
[013引在一个实施例中，蛋白酶与US6, 258, 726中的SEQIDNO: 1具有至少60%、例如 至少70%、例如至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95%、例如至少96%、 例如至少97%、例如至少98%、例如至少99%的序列一致性。
[0139] 在一个实施例中，蛋白酶与在此的SEQIDN0:2具有至少60%、例如至少70%、 例如至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95%、例如至少96%、例如至少 97%、例如至少98%、例如至少99%的序列一致性。
[0140]根据本发明的一个实施例，可W按从0. 2至25mg酶蛋白巧巧/L发酵培养基的剂 量添加蛋白酶。在一个实施例中，可W按范围从O.Ol-lOOppmEP(酶蛋白）蛋白酶，例如 0.l-50ppm，例如l-25ppm的剂量添加蛋白酶。 阳1川 α-淀粉酶
[0142]根据本发明，可W与蛋白酶一起添加α-淀粉酶，或在发酵期间存在和/或添加 α-淀粉酶。α-淀粉酶可W是例如细菌来源或真菌来源的。 阳14引细荫α-淀粉酶
[0144] 合适的细菌α-淀粉酶的实例包括W下提到的。优选的细菌α-淀粉酶可W源 自芽胞杆菌属（有时称为±芽抱杆菌属）的菌株，包括地衣芽抱杆菌、解淀粉芽抱杆菌、 嗜热脂肪芽抱杆菌、或枯草芽抱杆菌的菌株。其他细菌α-淀粉酶包括源自芽抱杆菌属 NCIB12289、NCIB12512、NCIB12513或DSM9375的菌株的α-淀粉酶，所有的运些在W0 95/26397中进行了详细描述；W及由冢本（Tsukamoto)等人，生物化学和生物物理研究通 讯度iochemicalandBiophysicalResearchCommunications)，151 (1988),pp. 25-31 (通 过引用结合在此）中描述的a-淀粉酶。
[0145] 芽抱杆菌α-淀粉酶还可W是一种变体和/或杂合体，尤其是在任何W下各项中 所述的一种变体和 / 或杂合体：W0 96/23873、W0 96/23874、W0 97/41213、W0 99/19467、W0 00/60059、W及WO02/10355(所有文件都通过引用结合在此）。确切考虑的α-淀粉酶变 体被披露在美国专利号6, 093, 562、美国专利号6, 297, 038或美国专利号6, 187, 576 (通过 引用结合在此）中，并且包括具有W下的嗜热脂肪芽抱杆菌α-淀粉酶度SGα-淀粉酶）变 体：在位置R179至G182中具有一个或两个氨基酸的缺失、优选披露在W0 1996/023873 (参 见，例如，第20页，第1至10行）（通过引用结合在此）中的一种双缺失（优选与W0 99/19467披露的SEQIDΝ0:3中阐述的野生型BSGa-淀粉酶氨基酸序列相比对应于 δ(181-182)的双缺失）、或者使用W0 99/19467(该参考文献通过引用结合在此）的SEQ IDNO: 3进行编号的氨基酸R179和G180的缺失。甚至更优选的是芽抱杆菌α-淀粉酶，尤 其是嗜热脂肪芽抱杆菌α-淀粉酶，它与披露于W0 99/19467中的SEQIDNO: 3阐述的野 生型BSGa-淀粉酶氨基酸序列相比具有对应于δ(181-182)的一种双缺失并且进一步包 括N193F取代（也被表示为I181*+G182*+N193F)。
[0146] 在一个实施例中，嗜热脂肪芽抱杆菌α-淀粉酶是在W0 2011/082425中披露的蛋 白酶或在此的SEQIDΝ0:5,例如选自下组的蛋白酶：
[0147] -I181*+G182*+N193F巧 129V+K17 化+R17 犯；
[014引-
[0149]I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q25 4S；
[0150] -
[015。1181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K17化+R17犯+Q254S+M284V;和
[0152] -
[0153]I181*+G182*+N193F巧 129V+K17化+R17犯+K220P+N22化+S242Q+Q254S(使用在此 的SEQIDN0:5进行编号）。
[0154] 在一个实施例中，嗜热脂肪芽抱杆菌α-淀粉酶具有W下突变：181*+G182*+N193 F+V59A+Q89R+E129V+K17化+R17犯+Q254S+M284V(SEQIDN0:5)。
[0155] 典型地将截短的嗜热脂肪芽抱杆菌α-淀粉酶自然地截短为约从485-495个氨基 酸长，例如491个氨基酸。在一个优选实施例中，截短是在C末端。确切考虑的杂合α-淀 粉酶包含地衣芽抱杆菌α-淀粉酶（在W0 99/19467的SEQIDNO:4中示出）的445C末 端氨基酸残基和源自解淀粉芽抱杆菌的α-淀粉酶（在W0 99/19467的SEQIDNO: 5中示 出）的37N末端氨基酸残基，具有W下取代：G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+ 八209￥+92645(使用胖0 99/19467中的569 10^:4进行编号）。尤其优选的是具有一种或 多种W下突变的变体：H154Y、A181T、N190F、A209V和Q264S和/或在位置176和179之间 缺失两种残基，优选缺失E178和G179 (使用W0 99/19467的SEQIDNO: 5进行编号）。
[0156] 可商购细菌α-淀粉酶产品和含α-淀粉酶产品包括TERMAMYLSC、LI卵0ZYME SC、BAN(诺维信公司，丹麦）DEX-LO 、SPEZYMEXTRA、SPEZYMEAA、SPEZYMEFRED-L、 SPEZYMEALPHA、GC358、SPEZYMERSLSPEZYMEΗΡΑ和SPEZYME呢LTAAA(来自杜邦 值uPont)公司，美国）、FUELZYME(范恩尼姆（Verenium)公司，美国）。
[0157] 可W按本领域熟知的浓度添加细菌α-淀粉酶。当WKNU单位测量（描述于W下 "材料与方法"部分中）时，α-淀粉酶活性优选地W范围从0. 5-50KNU/L发酵培养基，例如 1-25KNU/L发酵培养基，或更优选W2-10KNU/L发酵培养基的量存在。 阳15引 真荫α-淀粉酶
[0159] 真菌α-淀粉酶巧C3. 2. 1. 1)优选具有丝状真菌来源。真菌α-淀粉酶可W是 真菌酸性α-淀粉酶。
[0160] 真菌酸性α-淀粉酶包括源自曲霉属的菌株的酸性α-淀粉酶，例如米曲霉和黑 曲霉α-淀粉酶。
[OW] 优选真菌α-淀粉酶是真菌淀粉样（Fungamy^like)α-淀粉酶，该α-淀粉酶 优选源自米曲霉的菌株。在本披露中，术语"真菌淀粉样α-淀粉酶"指与W0 96/23874中SEQIDNO: 10中示出的氨基酸序列的成熟部分呈现高一致性的α-淀粉酶，即多于70%、 多于75%、多于80%、多于85%、多于90%、多于95%、多于96%、多于97%、多于98%、多 于99 %或甚至100 %的一致性。
[0162] 另一种优选的酸性α-淀粉酶是来源于黑曲霉菌株。在一个优选实施例中，酸 性真菌α-淀粉酶是来自在Swiss-prot/TeEMM^数据库中在主入藏号Ρ56271下披露为 "AMYA_ASPNG"并且在W0 89/01969(实例3)中进行更详细描述的黑曲霉的α-淀粉酶。酸 性黑曲霉酸性α-淀粉酶还在W0 2004/080923(诺维信）中示出为SEQIDΝ0:1，将其通过 引用结合在此。还考虑了与W0 2004/080923中的SEQIDNO: 1具有至少70%-致性、例 如至少80 %或甚至至少90 % -致性、例如至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、或至 少99 %-致性的所述酸性真菌淀粉酶的多种变体。合适的可商购的源自黑曲霉的酸性真菌 α-淀粉酶是SP288 (可获得自诺维信公司，丹麦）。
[0163] 真菌酸性α-淀粉酶还可W是野生型酶，其包含碳水化合物结合模块（CBM)和 α-淀粉酶催化结构域（即，非杂合），或其变体。在一个实施例中，野生型酸性真菌α-淀 粉酶是源自白曲霉的菌株。
[0164] 可商购的包含真菌α-淀粉酶的组合物包括FUNGAMYLce和在商品名SP288 下销售的酸性真菌α-淀粉酶（可获得自诺维信公司，丹麦）。
[0165] 在一个实施例中，该真菌酸性α-淀粉酶是一种杂合α-淀粉酶。真菌杂合 α-淀粉酶的优选实例包括通过引用结合在此的W0 2005/003311或美国专利公开号 2005/0054071(诺维信公司）或美国专利申请号60/638,614(诺维信公司）中披露的α-淀 粉酶。杂合α-淀粉酶可W包含α-淀粉酶催化结构域（CD)和糖结合域/模块（CBM)，例 如淀粉结合域和任选的接头。
[0166] 考虑的杂合α-淀粉酶的具体实例包括披露于共同未决的美国专利申请号 60/638,614中实例的表1至5中的那些，包括具有催化结构域JA118和罗耳阿太菌 (Atheliarolfsii)S抓的真菌淀粉变体（在此的沈QIDΝ0:2和US60/638,614中的沈QID NO: 100)、具有罗耳阿太菌AMG接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶（在此的SEQIDNO: 3 和US60/638, 614中的SEQIDNO: 101)、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉 α-淀粉酶（将其在美国申请号11/316,535的表5中披露为氨基酸序列SEQIDNO: 20、 沈QIDNO: 72和沈QIDNO: 96的组合并且进一步披露为在此的沈QIDNO: 13)、W及具有 罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和S抓的大型亚灰树花菌α-淀粉酶（在此的SEQIDNO:4和 US60/638, 614中的SEQIDNO: 102)。其他确切考虑的杂合α-淀粉酶是列于美国申请号 11/316, 535或（W0 2006/069290)(将其通过引用而结合在此）的实例4的表3、4、5和6 中的任何α-淀粉酶。考虑的杂合α-淀粉酶的其他具体实例包括披露于美国专利申请号 2005/0054071中的那些，包括披露于15页表3中的那些，例如具有白曲霉接头和淀粉结合 域的黑曲霉α-淀粉酶。
[0167] 可W按0. 1至250FAU(巧/L发酵培养基、优选1至100FAU(巧/L发酵培养基的量 添加酸性α-淀粉酶。 阳16引葡糖淀粉酶
[0169] 根据本发明，可W与蛋白酶一起添加α-淀粉酶，或在发酵期间存在和/或添加 α-淀粉酶。α-淀粉酶可W是例如细菌来源或真菌来源的。
[0170] 考虑的葡糖淀粉酶包括选自下组的那些，该组由W下各项组成：曲霉属葡糖淀粉 酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶（博埃尔度oel)等人，1984,欧洲分子生物学学会 杂志（EMB0J. )3(5): 1097-1102)，或其变体，例如披露于W0 92/00381、W0 00/04136 和W0 01/04273中的那些（来自诺维信，丹麦）；披露于W0 84/02921中的泡盛曲霉葡糖淀粉酶， 米曲霉葡糖淀粉酶（农业、生物学与化学（Agric.Biol.Chem.) (1991)，55(4)，P. 941-949)， 或其变体或片段。其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A 和G139A(陈（Chen)等人，（1996)，蛋白质工程（Prot.化g. )9:499-505) ;D257E和 02936/9(陈等人，（1995)，蛋白质工程8:575-582);化82(陈等人，（1994)，生物化学杂志 度iochem.J. )301:275-281);二硫键，A246C(费艾洛伯（Fierobe)等人，（1996)，生物化学 35:8698-8704 及在位置A435和S436中引入Pro残基（李化i)等人，（1997)，蛋白质工 程（Proteinling. ) 10:1199-1204)。
[0171] 其他考虑的葡糖淀粉酶包括源自阿太菌属的菌株，优选是源自罗耳阿太菌（W前 命名为罗尔伏革菌）的菌株的葡糖淀粉酶（参见美国专利号4, 727, 026和长坂（化gasaka) 等人，（1998)，"来自罗尔伏革菌的生淀粉降解葡糖淀粉酶的纯化和特性"（"化rification andpropertiesoftheraw-starch-degradingglucoamylasesfromCorticium rolfsii")应用微生物学与生物技术（A卵 1.Microbiol.B