iotechnol. )50:323-330),篮状 菌属葡糖淀粉酶，具体地源自埃默森篮状菌（WO99/28448)、Tala;romyces1巧cettanus(美 国专利登记号32，153)、化1曰'〇1117〇68(1啡〇11*1、^及嗜热篮状菌（美国专利号4,587,215)。 还考虑的是披露为W0 2006/060062中的SEQIDN0:4的里氏木霉葡糖淀粉酶，和与其具 有至少80%或至少90%-致性的葡糖淀粉酶，并且另外还有披露为US7, 262, 041-B2扣S 10/992, 187)(将其通过引用而结合在此）中的SEQIDN0:3的灰腐质霉的葡糖淀粉酶，或 与其具有至少80 %或至少90 % -致性的序列。
[0172] 在一个优选实施例中，葡糖淀粉酶源自曲霉属的菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉、或 米曲霉；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株、优选埃默森篮状菌。
[0173] 其他考虑的葡糖淀粉酶包括源自栓菌属的菌株，优选是披露于W0 2006/069289(将其通过引用而结合在此）中的瓣环栓菌的菌株的葡糖淀粉酶。根据本发明 还考虑了杂合葡糖淀粉酶。杂合葡糖淀粉酶实例披露于W0 2005/045018中。具体实例包 括披露于实例1的表1和4中的杂合葡糖淀粉酶（运些杂合体通过引用而特此结合）。
[0174] 考虑到的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭状芽抱杆菌属，特别是嗜热解淀粉梭 状芽抱杆菌（C.thermoamylol^icum)巧？ 135, 138)和嗜热硫化氨梭状芽抱杆菌 (C.thermohy化osulfuricum) (W0 86/01831)的葡糖淀粉酶。
[0Π5] 包含葡糖淀粉酶的可商购组合物包括AMG200L;AMG300L;SANSU阳R、SANEXTRA L、SPIRIZYMEPLUS、SPIRIZYMEFUEL、SPIRIZYMEULTRA、SPIRIZYMEEXCEL、SPIRIZYME B4U和AMGE(来自诺维信公司）；0PTIDEX300(来自杰能科国际公司）；AMIGASEs和 AMIGA沈PLUS(来自DSM公司）；G-ZYMEG900、G-ZYME〇:和G990ZR(来自杰能科公司）。
[0176] 在一个实施例中，可W按1-5, 000AGU/L发酵培养基、优选10-1，000AGU/L发酵培 养基的量添加葡糖淀粉酶。
[0177] 材料与方法
[017引 材料:
[0179]軍白酶P化S:在此的SEQIDNO: 2中示出的源自激烈热球菌的蛋白酶。
[0180]Mg蛋白酶3:来自在W0 2014/037438中的实例2中设及的大型亚灰树花菌的菌株 的丝氨酸肤酶家族S53蛋白酶。
[01引]蛋白酶巧S17 :Snapalysin的纯化样品（实例4)。
[01的]蛋白酶Z6Z6A:怎yERLA翔B迅（可获得自诺维信公司的蛋白酶）（实例4)
[0183] 化学止泡剂（实例1和2) :AD5520GA(来自乙締氧化物和丙締氧化物的缩合共聚 物），来自Alcolina公司，己西。
[0184]止泡剂 1:止泡剂ARTDISP904S和分散剂ARTDISP8000,AratropIndustrial 公司，己西（实例3)
[0185] 止泡剂2:止泡剂AD4415和分散剂AD5520GA，Alcolina公司，己西（实例3) 阳18引 酵母化RT):产,西发狗酿酒酵母荫株
[0187]酵母CAT-1:购买自LNF公司，己西(www.Inf,com,br)并且描述于己布拉扎德 度油rzadeh)等人，2012，"有效的工业燃料乙醇发酵酿酒酵母菌株CAT-1的全基因组测序 (Whole-genomesequencingoftheefficientindustrialfuel-ethanolfermentative SaccharomycescerevisiaestrainCAT-1)"，分子遗传学和基因组学（Mole州lar geneticsandgenomics):MGG287巧），485-494。
[018引底物：甘庶糖蜜(80°糖蜜含糖量），获得自SantaHelenamill公司（皮拉西卡 己，圣保罗州，己西）（实例1和2)。
[0189] 甘薦糖蜜样品来自Sao化S细lill公司，己西（实例3)
[0190] 立法
[0191] 一致性：两个氨基酸序列之间或两个核巧酸序列之间的相关性由参数"一致性"描 述。
[0192] 出于本发明的目的，可W通过程序"比对"确定两个氨基酸序列之间的一 致性程度W及两个核巧酸序列之间的一致性程度，所述程序是尼德尔曼-翁施比对 (化edleman-Wunschalignment)(即总体对比）。使用该程序进行多肤W及核巧酸序列的 比对。使用缺省评分矩阵化0SUM50进行多肤比对，使用缺省一致性矩阵进行核巧酸比对。 对多肤而言，缺口的第一个残基的罚分为-12,对核巧酸而言该罚分为-16。对多肤而言，缺 口更远残基的罚分为-2,对核巧酸而言该罚分为-4。
[0193]"比对"是FASTA包版本v20u6的一部分（参见皮尔逊（W.R.化arson)和利普曼 QlJ.Lipman) (1988)，用于生物序列分析的改进的工具("ImprovedToolsforBiological SequenceAnalysis")，PNAS85:2444-2448,和皮尔逊（1990)使用FASTP和FASTA进行的 快速且灵敏的序列比较（"RapidandSensitiveSequenceComparisonwithFASTPand FASTA")酶学方法（MethodsinEnzymology) 183:63-98)。FASTA蛋白比对使用史密斯-沃 特曼算法（Smith-Watermanalgorithm)进行，对缺口大小没有限制（参见史密斯-沃特 曼算法（"Smith-Watermanalgorithm"),史密斯化F.Smith)和沃特曼（M.S.Waterman) (1981)分子与生物学杂志（J.Mol.Biol. ) 147:195-197)。 阳194] α-淀粉酶活忡（KNU)
[0195] 可W使用马铃馨淀粉作为底物来确定淀粉分解活性。此方法是基于由酶分解改性 的马铃馨淀粉，并且该反应随后是将淀粉/酶溶液的样品与舰溶液混合。最初形成微黑蓝 色，但淀粉分解过程中蓝色变弱并且然后逐渐变为红褐色，将其与有色玻璃标准品比较。
[0196] 将一个KiloNovoα-淀粉酶单位（KNU)定义为在标准条件下（目Ρ，在 37°C+/-0. 05 ;0. 0003ΜCa2+;和抑5. 6下）糊精化5260mg淀粉干物质Merck可溶性淀粉 (MerckAmylumsolubile)的酶量。
[0197] 更详细描述运种分析方法的文件EB-SM-0009. 02/01可从丹素的诺维信公司索取 得到，通过引用将该文件结合在此。 阳19引酸忡淀粉分解活忡（FAU)的确定
[0199] 一真菌α-淀粉酶单位（1FAU)是指基于下列标准条件下，按照用于确定α-淀 粉酶的诺维信标准方法，每小时分解5. 26g淀粉（MerckAmylum的可溶性化g.Β. 6,批号 9947275)所需要的酶的量：
[0200] 底物 可溶性淀粉 温度 巧C pH 斗.7 反应时间 7-20分钟
[0201] 用于确定KNU和FAU的诺维信方法的详细描述可作为标准方法邸-SM-0009. 02/01 索取得到。 阳20引酸忡α-淀粉酶活忡的确定（AFAU)
[0203] WAFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位）测量酸性α-淀粉酶活性，相对于酶标准品 而确定AFAU。
[0204] 使用的标准是AMG300L(由诺维信公司销售的野生型黑曲霉GIAMG)。运种AMG中 的中性α-淀粉酶在储存于室溫3周后从约IFAU/mL下降至0. 05FAU/mLW下。
[020引根据AF9 1/3 (用于确定真菌α-淀粉酶的诺维信方法）来确定运种AMG标准中 的酸性α-淀粉酶活性。在运种方法中，将1AFAU定义为在标准条件下每小时降解5. 260mg 淀粉干物质的酶量。
[0206] 舰与淀粉一起形成蓝色复合物，但不与其降解产品形成蓝色复合物。因此颜色的 强度与淀粉的浓度成正比。使用反向比色法在指定分析条件下确定淀粉浓度的减少作为淀 粉酶活性。
[0207]
[020引蓝色/紫色 t= 23秒脱色 阳20引梳准条件/巧麻条件：（毎分钟）
[0210] 底物：淀粉，大约0. 17g/L
[0211] 缓冲液：巧樣酸盐，大约0. 03M
[0212]舰山）：0. 03g/L [0引引CaCl2:1.85mM
[0214] pH :2. 50+/-0.〇5
[0215] 解育溫度：40°C [0引引反应时间：23秒 [0217]波长：λ= 590nm [021 引 酶浓度：0. 025AFAU/mL
[0219] 酶工作范围：0. 01-0. 04AFAU/mL
[0220] 进一步细节可W发现于可从诺维信公司索取得到的标准方法文件 EB-SM-0259. 02/01中，通过引用将该文件结合在此。 阳2引]FAU(巧确定
[0222] 相对于具有声明强度的酶标准品测量FAU(巧真菌α-淀粉酶单位（芬加密尔 炬ungamyl))。
[0223]
[0224]
[0225] 更详细地描述运种标准方法的文件巧B-SM-0216. 02)可从丹麦的诺维信公司索 取得到，通过引用将该文件结合在此。 阳22引 葡糖淀粉酶活忡（AGU)
[0227] Novo葡糖淀粉酶单位（AGU)定义为在W下标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖 的酶量：37°C，pH4. 3,底物：麦芽糖23. 2mM，缓冲液：乙酸盐0. 1M，反应时间5分钟。
[022引可W使用自动分析仪系统。将变旋酶添加到葡萄糖脱氨酶试剂中，由此使存在的 任何a-D-葡萄糖变为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氨酶在W上提到的反应中与β-D-葡萄糖 特异性反应，形成NADH，在340nm下使用光度计确定该NADH作为原始葡萄糖浓度的量度。
[0229]
[0230]
[0231] 更详细描述运种分析方法的文件(邸-SM-0131.02/01)可从丹麦的诺维信公司索 取得到，通过引用将该文件结合在此。 阳23引 帝白酶测定法-AIKRH)
[0233] 可W用变性的血红蛋白作为底物确定蛋白水解活性。在用于确定蛋白水解活性的 安森-血红蛋白（Anson-Hemoglobin)方法中，变性血红蛋白被消化，并且用Ξ氯乙酸灯CA) 沉淀未消化的血红蛋白。用酪试剂确定TCA可溶产物的量，酪试剂可W与酪氨酸和色氨酸 一起给出蓝色。
[0234] 将一个安森（Anson)单位（AU-RH)定义为在标准条件（即，25°C，pH5. 5和lOmin 反应时间）下W初始速率消化血红蛋白，W使得每分钟释放的TCA可溶性产物的量与酪试 剂给出与一毫当量的酪氨酸相同的颜色的酶量。
[0235] AU(RH)法描述于EAkSM-0350中并且可从丹麦的诺维信公司索取得到。
[023引 帝白酶郷I定 阳237] AZ化-酪帝白测定
[023引边揽拌边将蓝色底物ΑΖα-酪蛋白的0. 2 %溶液悬浮于抑9的Borax/NaH2P04缓 冲液中。边揽拌边将该溶液分散在微量滴定板（每孔100微升）上，添加30微升酶样品并 且将运些板在艾本德热混器巧ppendo计Thermomixer)中在45°C和60化pm下解育30分 钟。使用变性的酶样品（l00°C煮沸20min)用作空白对照。解育之后通过将微量滴定板转 移到冰上来终止该反应并且通过在4°C下W3000rpm离屯、5分钟将着色的溶液与固体分离。 将60微升的上清液转移到微量滴定板并且使用伯乐酶标仪度ioRadMicroplateReader) 测量在595nm处的吸光度。 阳23引 pNA郷I定
[0240] 将50微升含蛋白酶样品添加到微量滴定板并且通过添加100微升ImMpNA底物 巧mg溶解于100微升DMS0中并进一步用抑9.0的Borax/NaH2P〇4缓冲液稀释至lOmL)开 始该测定。〇〇4。5在室溫下的增加被监测为蛋白酶活性的一个量度。
[0241] 本发明将在W下实例中进行更详细的描述，运些实例被提供用W说明本发明而决 不意图限制本发明要求的范围。在此引用的所有参考文献针对在本文中进行的描述通过引 用具体结合。
[0242] 实例
[0243] 实例 1 阳244] 在甘庶糖密发酵中，在化学ih.狗剂巧WuS.间，对狗沫梓制讲行比巧
[024引在32°C，在50血离屯、瓶灯PP)中进行发酵实验，模拟如在己西国内进行的工业乙 醇发酵工艺。使用了发泡己西酵母菌株。将含22°糖蜜含糖量的发酵底物（由稀糖蜜组 成）进料至酵母浆料（通过在水中再悬浮酸处理的酵母生物质制备）中。酵母浆料代表总 发酵体积的30%，类似于工业条件。在发酵约6小时后，通过离屯、（400化pm持续lOmin)收 集酵母细胞，称重，用发酵的糖蜜（酒）和水稀释（至35%w/v酵母湿重），并且用硫酸处 理（抑从2. 0至2. 5持续1小时），并且再用于随后的9个发酵循环中。在每一条件下，一 式Ξ份运行样品。在样品的离屯、（400化pm持续lOmin)后，通过重量分析法确定湿重酵母 生物质。通过记录管中的泡沫重量和/或通过代表性50mL管的拍照，在进料后，每小时登 记泡沫。条件是：
[0246] 对照-无酶。在酸洗期间不添加化学止泡剂。
[0247] 化学止泡剂添加。在酸洗期间添加化学止泡剂，在每一循环后具有不断增加的剂 量，直至控制了泡沫。
[024引蛋白酶P化S添加。在添加新的糖蜜后，添加蛋白酶P化S。在酸洗期间不添加化学 止泡剂。
[0249] 根据表1使用剂量。将止泡剂添加进酵母浆料中。在用新鲜糖蜜进料发酵池后， 添加蛋白酶P化S。
[0250] 表1 :用于控制发泡的止泡剂油和P化S的剂量
[0巧1]
[0巧2] 泡沫测量生成W下数据，示出更显著的结果，总结于表2中：
[0253] 表2 :来自每一处理的泡沫控制结果。由于泡沫形成，与培养基体积相比，数据呈 现为总体积增加。
[0巧4]
[0256] 在已经停止化学止泡剂和蛋白酶P化S添加后，在接下来的Ξ个随后的发酵循环 中，测量泡沫高度。在最后一次蛋白酶P化S添加后，其中已经添加蛋白酶P化S的管呈现对 两个随后批次的残余止泡效果。W总体积增加呈现的泡沫形成总结在表3中：
[0巧7] 表3 :在已经停止止泡剂油和蛋白酶P化S添加后，在两个批次（循环1和循环2) 中的泡沫形成。由于泡沫形成，与培养基体积相比，数据呈现为总体积增加。
[0巧引
[0259] *将单剂量的蛋白酶P化S(3. 7卵m)添加至此管，并且在单