级联激活的免疫细胞、制备方法以及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种级联激活的免疫细胞、制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]CD3体外活化T细胞在特定细胞因子环境下会引起其他细胞，特别是抗原呈递细胞(APC)的激活。抗原呈递细胞，也被称为信息细胞，在血液中循环，并提呈外源蛋白，肿瘤蛋白作为变异的非自体抗原也可被其提呈。在APC中，树突状细胞(DC)是抗原提呈效力最高的一种细胞，DC可通过特定细胞因子(如IL-4、GMCSF)活化外周血中的单细胞(monocytes)获得，肿瘤抗原加DC现正作为肿瘤疫苗在肿瘤治疗方面进行实验。如果未经活化的T细胞被加入到活化的呈递肿瘤抗原的APC中，T细胞的活化和启动可通过特异性I细胞受体完成，从而获得特异性识别和杀伤肿瘤的能力。这种利用抗原呈递细胞结合抗CD3单克隆抗体及特定细胞因子的两步法链式反应激活的细胞被称为CAPRI细胞。CAPRI细胞疗法的效应细胞(具有杀伤肿瘤细胞能力的细胞)有两种:以CD4+和CD8+为主的T辅助细胞和T杀伤细胞(细胞毒细胞)，约占80 %，以⑶3+和⑶56+为主的NKT细胞、以及NK细胞和树突状细胞(DC)，这部分效应细胞约占20%。
【发明内容】
[0003]本发明的目的之一在于提供一种新的激活的免疫细胞的制备方法。
[0004]实现上述目的的技术方案如下:
[0005]一种激活的免疫细胞的制备方法，包括以下步骤:
[0006]分离得到外周血单核细胞；
[0007]分离后的单核细胞与⑶3抗体共培养2?4小时后，加入干扰素γ共培养20?24小时，初级刺激单核细胞，进入初级刺激孵育期；
[0008]加入11-2(白细胞介素-2)、11^-4(白细胞介素-4)、11^-1(白细胞介素-1)和巨噬细胞集落刺激因子，进一步活化培养70?72小时，从而进入连续刺激效应细胞表达，得到级联激活的免疫细胞。
[0009]在其中一个实施例中，进行培养时单核细胞的接种密度为I?2xl09/L，0.5ml/孔，所述⑶3的加入量为I?2ug，干扰素γ的加入量为1000?2000IU。
[0010]每孔中加入的所述IL-2、IL-4、IL-1和巨噬细胞集落刺激因子的量分别为:1000 ?2000IU、100 ?200ng、40 ?60ng 和 300 ?500ng。
[0011]本发明的另一个目的是提供一种级联激活的免疫细胞。
[0012]具体技术方案如下。
[0013]一种级联激活的免疫细胞，其通过上述制备方法得到。
[0014]本发明的另一目的是提供所述级联激活的免疫细胞的应用。
[0015]具体技术方案如下。
[0016]上述级联激活的免疫细胞，在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
[0017]本发明的另一目的是提供一种治疗乳腺癌的药物。
[0018]具体技术方案如下。
[0019]一种治疗乳腺癌的药物，其活性成分包括有上述级联激活的免疫细胞。
[0020]本发明的另一目的是提供一种治疗恶性黑色素瘤的药物。
[0021]具体技术方案如下。
[0022]上述活化后的级联激活的免疫细胞，在制备治疗恶性黑色素瘤的药物中的应用。
[0023]具体技术方案如下。
[0024]一种治疗恶性黑色素瘤的药物，其活性成分包括有上述级联激活的免疫细胞。
[0025]本发明的发明人通过长期的实验，发现初级刺激外周血单核细胞过程中，CD3抗体和干扰素γ的加入顺序和浓度的不同会对结果有较大影响，本发明的方案会对免疫细胞的增殖速率会有显著的提升；且本发明提供方案所得到的免疫细胞(CAPRI)的效应细胞CD3+CD56+的比值也有显著提升。链式激活的免疫细胞对乳腺癌细胞能有较好的裂解，且对恶性黑色素瘤细胞的增殖也有较好的抑制作用。CAPRI细胞用于临床上，整个治疗过程是安全的，没有负面效果。在一周内即可获得大量具有癌症特异性CAPRI细胞，可用以对不同类型的癌症进行有效的过继性细胞治疗。
【附图说明】
[0026]图1为实施例1中级联激活的免疫细胞的制备步骤示意图；
[0027]图2为实施例2中CAPRI细胞培养过程中细胞状态示意图；
[0028]图3为实施例2中细胞流式检测示意图；
[0029]图4为实施例3中细胞增殖和流式检测结果比对图；
[0030]图5为实施例4中级联激活的CAPRI细胞对乳腺癌细胞的裂解测试结果示意图；
[0031]图6为实施例5中级联激活的CAPRI细胞对恶性黑色素瘤细胞增殖的MTT抑制实验检测示意图。
【具体实施方式】
[0032]实施例1
[0033]本实施例所述的级联激活的免疫细胞通过以下方法得到。
[0034]1.单核细胞的获得(见附图1)
[0035]1.1新鲜乳腺癌患者外周血(山东省某医学院附属医院患者提供)(肝素抗凝20u/ml)取样(供后续检测备用)，将剩余外周血与生理盐水照按1:1稀释；
[0036]1.2在50ml离心管中预先加入淋巴细胞分离液15ml，再加入稀释好的外周血25ml ；
[0037]1.3小心的将稀释后的血液加到分离液的上面；
[0038]1.4 离心:转速:1500r/min，温度 20。。?28。。，时间:20min ；
[0039]1.5离心管内顺次为血浆一一单个核细胞层一一分离液一一红细胞；
[0040]1.6用移液管吸出单个核细胞层，重悬于2?5倍体积的生理盐水中；
[0041]1.7 离心:转速:2000 ?2300r/min，时间:10min，温度:4°C ；
[0042]1.8离心后，弃上清液，细胞沉淀重悬于Iml完全培养基中(含10 % FCS的RPM-1640 培养液)。
[0043]2.CD3抗体和干扰素γ，初级刺激单核细胞(见附图1)
[0044]2.1调整细胞密度为I?2x109/L，放入48孔培养板，0.5ml/孔，⑶3的加入量为lug，置于37°C，5% C02的恒温二氧化碳培养箱中培养4小时；
[0045]2.2每孔加入1500IU干扰素γ再次活化效应细胞；
[0046]2.3将初次激活的细胞置于37°C，5% C02的恒温二氧化碳培养箱中培养20小时。
[0047]3.单核细胞的第二步激活(见附图1)
[0048]3.1将2.3中培养20小时后培养物收集到50ml离心管中，750G离心8分钟，去上清，用50ml RPMI1640重悬细胞，计数，离心。
[0049]3.2用完全培养基将所有细胞重悬，调整细胞密度为I?2xl09/L，放入48孔培养板，0.5ml/孔，加入IL-2、IL_4、IL-1和巨噬细胞集落刺激因子，每孔加入量分别为:1500IU、1500ng、50ng和 400ng。
[0050]3.3将培养板放置于37°C，5% C02的恒温二氧化碳培养箱中培养72小时。
[0051]4.级联激活的免疫细胞的扩增培养和收获(见附图1)
[0052]4.1将经72小时培养的培养物(CAPRI细胞)收集到50ml离心管中，750G离心8分钟，去上清，用生理盐水重悬细胞，计数，离心。
[0053]4.2再次离心后可得有活性的级联激活的免疫细胞(CAPRI细胞)，用盐水重悬后备用O
[0054]实施例2
[0055]1.按上述实施例1中方法获得级联激活的免疫细胞(CAPRI细胞)，期间进行细胞状态观察(