一种联合新型tlr7激动剂gd制备人cik细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞免疫学、肿瘤免疫治疗领域，设及一种联合新型化R7激动剂GD制 备人CIK细胞的方法和抗肿瘤过继免疫治疗应用。
【背景技术】
[0002] 近年来随着生活方式的改变W及自然环境的恶化，加上医疗技术的提高，肿瘤检 出人数呈上升趋势，肿瘤已成为严重威胁人类健康的重要疾病之一。由于肿瘤具有较高的 损害性和较高的病死率，对抗肿瘤的治疗手段的研究和应用一直是人们关注的焦点，肿瘤 免疫治疗是临床用于肿瘤治疗的第四大疗法，其中免疫细胞疗法在中国得到广泛的应用， 目前国内开展最多的就是免疫细胞过继性回输疗法。
[0003] CIK细胞即细胞因子诱导杀伤细胞，是将人外周血单个核细胞在体外与多种细胞 因子共同培养一段时间后获得的非主要组织相容性复合体(MHC)限制性的细胞毒性T淋己 细胞，对肿瘤细胞具有高效的溶解毒性，DC与CIK细胞共培养后，可W有效提高了CIK的增 殖能力和杀伤活性，更有利于提高CIK的抗肿瘤免疫疗效，也是目前国内应用最为广泛的 免疫治疗技术。
[0004] Toll样受体（TLRs)是存在于不同类型细胞上的模式识别受体（pattern reco即itionrec巧tors，PRRs)，将运些PRRs可W识别的特定分子模式归为一类，称作病原 体相关分子模式（pathogen-associatedmolecularpatte;rns，PAMPs)。PAMPs是病原体保 守结构分子，和宿主的其他分子模式有很大区别，当病原体侵袭宿主时，机体启动针对病原 体相应免疫程序，从而抵抗外来病原体侵袭而不影响宿主。运种模式识别机制是机体抵抗 病原菌的第一道屏障，而Toll样受体在运个过程中发挥重要作用。
[0005] 在化Rs家族中，TLR7是首先被发现可W由小分子化合物激活的Toll样受体。TLR7 的配体有单链RNA(ssRNA)、非病毒来源物巧日多聚dT等)和化学合成的小分子化合物咪挫 哇嘟类W及鸟巧类似物等。化R7配体能特异激活化R7,有很强的佐剂作用，因此运些化R7 配体中的大多数都可W作为免疫佐剂使用，如可W通过诱导前细胞因子产生抗病毒和抗肿 瘤作用。化R7的天然配体是单链RNA(ssRNA)，虽然其也有很好的激动作用，但是由于其容 易酶解，产生一系类生物毒性W及其制备成本高等特点，使其研究和应用受到限制。虽然已 有研究对合成的ssRNA进行结构修饰，即提高RNA的稳定性，也提高了免疫效应。但是本发 明所用的合成小分子化R7配体具有稳定结构、低毒性W及低成本等优点，本发明是将自主 研发的TLR7 激动剂GD[Gaoetal.ChemMedChem, 2015，10 化）：977-980]作为免疫刺激 因子在肿瘤免疫治疗中使用，从而制备出更有效的CIK细胞，称之为GD-CIK。经过化R7激 动剂GD刺激CIK细胞活化，刺激更多的细胞刺激因子分泌，产生共协同刺激作用，具有更好 的杀瘤活性。
[0006] 治疗肿瘤中，联合疗法逐渐得到重视，TLR7激动剂联合化疗、其他免疫疗法的报道 也日渐增多，但都属于简单的叠加范畴，基于共刺激，联合治疗理念的CIK细胞未见报道。 本发明通过化R7激动剂，小分子化合物GD联合常规细胞因子，共刺激，诱导CIK细胞，旨在 联合天然免疫，增强肿瘤杀伤作用。在体外实现联合疗法理念，降低体内联合疗法风险。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是为了克服现有技术的不足，通过化R7小分子激动剂GD优化的CIK 细胞的基础上，提供了一种联合治疗理念的人CIK细胞的制备方法及其应用，即GD-CIK，解 决了现有技术CIK细胞培养后，异质性细胞群体细胞毒活性提高不显著等问题；得到可W 用于临床的杀伤效率更高的抗肿瘤过继免疫活性细胞。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为： 一种联合新型化R7激动剂GD制备人CIK细胞的方法，其特征集中于所述包括步骤： 1) 外周静脉血采集，分离，获得单个核细胞； 2)DayO,在常规CIK细胞培养体系中加入新型化R7激动剂GD，后续仿照常规，进行CIK 细胞的诱导培养； 3)GD-CIK细胞增殖培养。
[0009] 作为优选，所述步骤1):抽取人的静脉外周血于含有肝素钢的离屯、管中，离屯、获得 血清和全血细胞，将全血细胞经密度梯度离屯、获得单个核细胞。
[0010] 进一步地，所述步骤1):具体为采用聚薦糖-泛影葡糖胺密度梯度离屯、法分离收 集，并用生理盐水洗涂2次，低速离屯、后获得PBMCs。
[0011] 所述步骤2):具体为将获取的PBMCs重悬于GT-T551?培养基中，加入各种细胞因 子，然后于37°C，5%C02和饱和湿度的培养箱内按照CIK细胞培养常规方案进行。DayO， 将GD加入至前述CIK细胞混合培养13-15天，收获GD-CIK细胞。
[0012] 细胞组成：CD3阳性表达率在90%W上，CD3+CD4+细胞约在10-30%，CD3+CD8+细胞 在 50-70%，CD3+CD56+ 细胞约在 5-10%，CD3CD56+ 细胞约在 5-15〇/〇。
[0013] 本发明所提供的人GD-CIK细胞，是指WCD3+CD8+和CD3 +CD56+T淋己细胞为主效 应细胞，与K562细胞共培养18小时对肿瘤细胞杀伤活性可达98 %左右(效祀比，20:1)。
[0014] 本文中的"CD3+CD4乂IK细胞"表示CD3和CD4均为阳性的CIK细胞。"CD3+CD8乂IK 细胞"表示CD3和CD8均为阳性的CIK细胞。"CD3+CD56乂IK细胞"表示CD3和CD56均为阳 性的CIK细胞。"CD3CD56+细胞"表示CD3阴性和CD8阳性的细胞。
[0015] 上述方法培养的GD-CIK与常规培养制备的CIK相比，杀瘤活性明显增加，体外 实验时杀瘤活性达到98%W上，明显高于常规方法培养的CIK细胞。同时也具有制备成本 低廉、工序简单、条件易控、对设备的要求较低、易于规模化生产等优势。通过本发明所制备 的GD-CIK细胞应用主要是癌症病人的治疗或者癌症高危人群的预防。
【附图说明】
[0016] 图1:成熟CIK细胞团形态。培养第15天，成熟CIK在倒置显微镜下的形态，放大 倍率为40X; 图2 :培养第15天流式细胞术进行GD-CIK成熟度检测。
[0017] 图3:不同培养方式培养的外周血来源PBMCs生长曲线（n=3);外周血来源的 PBMCs通过不同方式培养，在第0、3、5、7、9、11、13、15天分别用细胞计数板和细胞计数仪进 行计数，将当前细胞总数除W开始培养时(第0天）的细胞总数，所得数值即为细胞增殖倍 数。CIK组：指采用斯坦福大学应用的培养法培养的CIK细胞；GD-CIK组：指本发明所采 用的培养方式； 图4 :采用流式细胞仪进行免疫表型检测（n=3)。外周血来源的PBMCs，通过不同方式培 养，在第14天取细胞进行流式巧光抗体：抗CD3-門TC、CD4-PE、CD8-阳CY5、CD56-APC进行 表面染色并检测。CIK组：指采用斯坦福大学应用的培养法培养的CIK细胞；GD-CIK组：指 本发明所采用的培养方式。
[0018] 图5 :采用CCK-8细胞毒活性检测试剂盒，对不同培养方式培养的外周血来源 PBMCs进行细胞毒性检测（n=3)。通过不同方式培养，在第14天取细胞通过CCK-8试剂盒进 行细胞毒活性检测。CIK组：指采用斯坦福大学应用的培养法培养的CIK细胞；GD-CIK组： 指本发明所采用的培养方式。横坐标：表示效祀细胞比值，E:Τ=20 : 1表示效应细胞与祀 细胞的比值为20 : 1，Ε:Τ=10 : 1表示效应细胞与祀细胞的比值为10 : 1，Ε