阶梯式离心提取血小板的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域中阶梯式离屯、提取血小板的方法。
【背景技术】
[0002] 血小板化loodplatelet,化T)是血液中的有形成份之一，在人体的出血凝血生理 病理过程中发挥重要作用W。血小板是巨核细胞成熟后脱颗粒释放到血液中的血细胞，形 状多样不规则，正常血小板直径2~4μm，无细胞核。血小板具有特定的形态结构和生化组 成，在正常血液中具有较恒定的数量，在止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成及器官移植排 斥等生理和病理过程中有重要作用^ 2'3^。血小板内含有多种生长因子，富血小板血浆的修复 等功能在临床中运用的日益增多，而血小板在血液中是与其他细胞混合存在的，分离纯净 的血小板对血小板功能的研究非常必要。
[0003] 血小板提取纯化的方法主要有磁珠吸附法、流式细胞仪分离法、分离胶分离法和 富血小板血浆简易离屯、分离法（PRP法）W。前两种方法提取存在着过程繁琐、试剂成本高 等缺点；后两种方法则分离纯度低，污染率高。传统的富血小板血浆简易离屯、分离法所用 时间短、步骤少，纯度较高W，但制出的血小板数量少，文献报道中得率最高的约51. 30%左 右，红细胞和白细胞含量高，血小板完整性会被破坏。
[0004] 白细胞特有基因-人血蛋白基因化emoglobin，HGB)w在白细胞内稳定表达，而血 小板内不含有该基因。外周全血和单纯血小板都含有线粒体NDI基因是线粒体基因中 最保守的，其表达产物为NADH脱氨酶（复合体I)亚单位1?。因此对提取后血小板的运两 个基因定量检测可用于血小板纯度的评价。 阳00引 参考文献：
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【发明内容】
[0014] 本发明所要解决的技术问题是如何提取血小板，并得到纯净的血小板。
[0015] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了阶梯式离屯、提取血小板方法。
[0016] 本发明所提供的阶梯式离屯、提取血小板方法，包括1)和2):
[0017] 1)将离体的动物血液在巧0-110)Xg下进行第一次离屯、，使血小板进入上清液 中，分别收集下层液体和上清液，该上清液称为上清液A1，所述上清液A1即为血小板粗提 液；
[0018] 2)将所述血小板粗提液在（200-220)Xg下进行第二次离屯、，使血小板进入上清 液中，收集上清液，该上清液称为上清液B1，所述上清液B1即为含有血小板的血小板提取 液。
[0019] 上述方法中，所述第一次离屯、的离屯、力可为lOOXg;所述第二次离屯、的离屯、力可 为 210Xg。
[0020] 上述方法中，所述第一次离屯、的时间可为13-18分钟；所述第二次离屯、的时间可 为2-5分钟。
[0021] 上述方法中，所述第一次离屯、的时间可为15分钟；所述第二次离屯、的时间可为3 分钟。
[0022] 上述方法中，步骤1)还可包括：将所述下层液体在（160-180)Xg下进行离屯、，该 离屯、命名为下层液体离屯、，使所述下层液体中残留的血小板进入上清液中，将该上清液称 为上清液A2;将所述上清液A2与所述上清液A1混合即得到血小板粗提液。
[0023] 上述方法中，所述下层液体离屯、的离屯、力可为170Xg;所述下层液体离屯、的时间 为8-12分钟（如10分钟）。
[0024] 上述方法中，步骤2)还可包括：将所述上清液B1按照所述第二次离屯、的离屯、力进 行离屯、，该离屯、命名为重复离屯、，使血小板进入上清液中，收集上清液，该上清液称为上清 液B2,所述上清液B2即为含有血小板的血小板提取液。所述重复离屯、的时间可为2-5分 钟，如3分钟。 阳0巧]上述方法中，所述动物血液可用邸TA抗凝。
[00%] 上述方法中，所述动物可为哺乳动物。
[0027] 上述方法中，所述动物可为人。
[0028] 上述方法中，将动物血液进行第一次离屯、前还可包括将所述动物血液混匀。
[0029] 实验证明，利用本发明的阶梯式离屯、提取血小板法可W得到大量的血小板，并 且瑞氏染色结果未显示混杂有其他细胞。本发明的阶梯式离屯、提取血小板法得到的含 有血小板的血小板提取液中的白细胞低于富血小板血浆简易离屯、分离得到的血小板 提取液中的白细胞，差异有统计学意义（P< 0.05)，阶梯式离屯、提取血小板法得到的 血小板得率巧8. 286 + 10.660% )高于富血小板血浆简易离屯、分离得到的血小板得率 (51.297 + 13. 262%)，差异有统计学意义（P< 0.05)。表明，利用本发明的阶梯式离屯、提 取血小板法可W得到更为纯净的血小板，并且血小板的得率高。
[0030] 通过扩增血小板和白细胞共有的线粒体NDI基因和白细胞特异的HGB基因进 行血小板的纯度鉴定发现：阶梯式离屯、提取血小板法得到的产物的NDI基因扩增显示 扩增曲线平滑完好，溶解曲线具有单一的峰，表明该方法的产物中含有线粒体NDI基因， HGB基因扩增曲线杂乱，在32个循环后出现曲线，表明阶梯式离屯、提取血小板法得到 的血小板的白细胞基因含量极低。阶梯式离屯、提取血小板法得到的产物HGB基因含量 ((0. 398 + 0. 291)X103copies/ml)明显低于富血小板血浆简易离屯、分离产物HGB基因含量 ((1.583 +1.532)X103copies/ml)，差异有统计学意义（P< 0.05)。阶梯式离屯、提取血小 板法得到的产物的NDI基因含量（化.077 + 4. 148)X106copies/ml)高于富血小板血浆简 易离屯、分离组得到的产物的NDI基因含量（化.036 + 3. 128)X106copies/ml)。表明，利用 本发明的阶梯式离屯、提取血小板法血小板的得率高。
[0031] 本发明的方法可有效的去除红细胞和白细胞及白细胞碎片，得到的血小板中白细 胞绝对浓度极低、血小板浓度高和得率较高，并且保证了血小板的完整性。本发明的方法使 用材料主要为EP阳ND0RF管和普通移液器吸头，主要仪器设备为离屯、机和移液器，所用材 料简便易得。
【附图说明】
[0032] 图1为瑞氏染色涂片显微镜结果。其中，A为富血小板血浆简易离屯、组（PR巧组； B为含阶梯式离屯、提取血小板法（巧组。 阳03引图2为实时巧光定量PCR扩增曲线。其中a为HGB基因的扩增曲线，b为NDI基 因的扩增曲线。
[0034] 图3为溶解曲线。其中a为HGB基因的溶解曲线，b为NDI基因的溶解曲线。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0036] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0037] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0038] 下述实施例中用到的仪器和试剂为：美国ABISteponeplus巧光PCR扩增仪、德 国巧pendorf可调定量加液器、美国Beckman水平式电动离屯、机、日本SysmexXE-5000血液 分析仪、日本OlympusBX-43生物显微镜。DNA提取试剂为北京天恩泽基因公司天净沙系列 柱式血液DNA提取试剂，巧光PCR反应试剂为大连宝生物公司RR820A巧光PCR反应试剂， 血细胞计数试剂为日本Sysmex公司产品，瑞氏染色液为珠海贝索生物公司产品。
[0039] 实施