一种小鼠胰岛分离纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，特别设及一种小鼠膜岛的分离纯化方法。
【背景技术】
[0002] 随着经济的发展，人民的物质水平的提高，糖尿病（Di油etesMelli化s，DM)的患 病率也日益增长。截止到2010年，中国成人DM的患病率已达到11.6%。然而目前针对糖 尿病尚缺乏完全治愈的方法，对DM的研究也是世界上很多科学家的共同面对的挑战。针 对2型糖尿病灯ype2Di油etesMelli化s，T2DM)的基础研究或者1型糖尿病灯ype1 DiabetesMellitus，T1DM)的膜岛移植很大程度上依赖于动物膜岛的研究，故而成功的膜 岛分离、纯化则成为上述研究的前提。
[0003] 早在1911年就有学者从豚鼠膜腺中提取出膜岛，随后不断有学者对该法进行改 进，依次出现了酶消化法、胆总管灌注法、Ficoll400密度梯度离屯、法等分离及纯化的方法。 然而，局限于各个实验室的操作体系、小鼠的品系、分离及纯化方法的不同，各个实验室膜 岛的得率、纯度、活力及膜岛功能也不一致。
[0004] 获得数量足够和功能良好的膜岛是2型糖尿病基础研究及1型糖尿病膜岛移植获 得成功的关键。现已证实，膜岛占整个膜腺体积的1% -2%，一只小鼠平均约有2000个膜 岛，规范的膜岛提取步骤可W提取约200个膜岛。
[0005] 而小鼠膜岛的产量及功能与诸多方面密切相关。首先与小鼠的品系、体重及膜腺 体积等因素有关。Bock等人比较了 7种品系不同体重小鼠的膜岛含量，发现小鼠的品系对 膜岛数量的差异性贡献最大。此外，张梅等人发现高体重的小鼠（正常小鼠）膜岛数量显 著高于低体重小鼠。
[0006] 其次，小鼠膜岛的产量及功能还与分离方法有关。早在1911年，Bensley等人就 从豚鼠中采用手工挑选法获得了膜岛并对其染色，然而其获得的膜岛无论从数量还是功能 上来讲都不能让人满意。在运一研究的基础上，1965年Moskalewski对其进行了改进，采 用了剪碎加酶消化的方法进行膜岛的分离，然而该法下胶原酶并不能充分到达整个膜腺， 所得膜岛的纯度仍旧较差。两年后La巧andKostianovsky进一步改进该法，采用胆总管 灌注Hanks的方法充盈膜腺，并将充盈的膜腺剪碎后置于胶原酶中揽动消化。运是首次在 膜岛的提取中利用了动物本身的解剖路径来充盈膜腺。随后，在此法的基础上Gotoh等人 研究出了胆总管灌注胶原酶、Ficoll密度梯度离屯、的方法来提取膜岛。该法获得的膜岛产 量、功能较W前几种方法有了很大的提高，而且该法耗时少，故而该法一直沿用至今。然而， 该法仍有两点值得我们注意。一是胆总管穿刺难度较大，对于手术操作者的要求很高，新手 操作十分容易失败。Gotoh等人的方法还有一点值得我们注意的是Ficoll密度梯度离屯、 法，该法需要配制4种不同浓度的Ficoll离屯、液（25%，23%，20. 5%，11% )，Ficoll的配 制步骤繁琐复杂，而且Ficoll的价格相对比较高。该法获得的膜岛主要在1. 069-1. 096运 两层密度介质之间。而且Ficoll的渗透压略高于细胞渗透压，对膜岛内的细胞具有一定程 度的有害影响。
[0007] 除了上述的小鼠本身及分离方法对膜岛产量及纯度的影响外。胶原酶的种 类、纯度、浓度、消化时间也对膜岛的获得至关重要。刘定志等人比较了Liberase化、 CollagenaseP和CollagenaseVS种不同类型胶原酶对膜岛产量的影响，发现使用 Liberase化消化获得的膜岛数量最多。Yesil等人发现膜岛的产量与胶原酶的纯度呈现 正相关。除此之外使用适当浓度的胶原酶辅W合适的消化时间也是保证膜岛产量和纯度的 重要因素。钟嘉明等人采用不同浓度的胶原酶P消化不同时间来观察膜岛的产量，发现在 Img/ml，37°C下消化25min获得膜岛的状态最佳。
【发明内容】
[0008] 本研究拟通过自制的穿刺针及仅仅一种密度介质对小鼠的膜岛进行分离纯化，得 出一种简便快捷、廉价高效的膜岛获得方法。
[0009] 为实现上述目的，本发明采用W下技术方案：
[0010] 一种小鼠膜岛分离纯化方法，包括W下步骤： W11] (1)穿刺针的制备：将膜岛素注射器从1抓处剪开，剪刀修整断口处，取出一个枪 头，在酒精灯上烧灼该枪头与移液枪相接的一端，然后迅速将该枪头与膜岛素注射器的断 口处进行禪合；烧灼另一个枪头，用其溶解物对上述枪头和膜岛素注射器的禪合处进行加 固密封；另取一根静脉输液针，将其针头剪去，然后将静脉输液针的一端连接上述已经烧灼 禪合的枪头，另一端连接一个注射器，最后将膜岛素注射器自带的针头斜面朝上弯曲60° ; 阳01引 似小鼠膜岛的分离：将已死亡的小鼠血液充分放尽，喷洒75%的酒精消毒后，行 "V"型切口打开腹腔，将空回肠及结肠翻转至小鼠身体右侧，充分暴露胆总管及十二指肠； 在十二指肠处结扎胆总管，然后在靠近肝脏肝总管和胆囊管汇合的"V"字型接口处用步骤 (1)制得的穿刺针进行穿刺，穿刺成功后用动脉夹夹闭穿刺针尾端胆总管避免胶原酶反流； 将预冷的胶原酶V灌入膜腺，使其充分膨胀；随后迅速取下灌注好的膜腺，置于含有胶原酶 V的离屯、管中，于38°C恒溫水浴箱中静止消化17min;消化结束后在多用途旋满混合器上 幹旋3次，每次3秒；随后，在离屯、管中加满预冷的Hanks平衡盐溶液终止消化；并于低速离 屯、机上1000巧m离屯、2min，冲洗2次；离屯、后弃上清，将沉淀组织用预冷的Hanks平衡盐溶 液重悬后40目无菌金属筛网过滤，收集过滤后的组织悬液；
[0013] (3)小鼠膜岛的纯化：将组织悬液再次离屯、后加入碌并用滴管充分吹打混 悬；将混悬好的组织悬液于2000巧m条件下离屯、20min，离屯、结束后膜岛存在于上清当中； 将上清转移至离屯、管，加入预冷的Hanks平衡盐溶液后于1300巧m条件下离屯、5min，离屯、结 束后膜岛沉于管底；将膜岛加入Hanks平衡盐溶液重悬后置于体式显微镜下进一步手工挑 选法进行纯化；最后将纯化的膜岛移入含有完全培养基中进行培养。
[0014] 步骤似中，将5ml浓度为Img/ml预冷的胶原酶V灌入膜腺。
[0015] 步骤（2)中，灌注好的膜腺置于含有3ml浓度为Img/ml的胶原酶V的离屯、管。
[0016] 步骤（3)中，平均每只小鼠膜腺加入7ml的LSM?。
[0017] 步骤（3)中，所述LSM⑥为配制好并经过过滤的淋己细胞分离液，100ml的 UM煩中含有9. 4g的泛影葡胺及6. 2g的Ficoll，其在2(TC下的密度介于1. 077-1. 080 之间。 阳ο化]步骤（3)中，所述完全培养基为含15%胎牛血清的RMPI1640。
[0019] 本发明的有益效果是：
[0020] 采用本发明的方法在大规模的提取膜岛时可W很大程度的节省时间，提高穿刺成 功率，减少Ficoll400配制的时间及价格。同时，纯化所得膜岛产量、纯度、活力及膜岛功能 都相对良好，是一种简单快捷，廉价高效的小鼠膜岛分离方法。具体表现为：
[0021] 本发明的方法设计了 一种穿刺针，该针便于操作者握持，且其针头大小为 29GX1/2"化33mmX12. 7mm)，其直径略小于小鼠胆总管的直径，穿刺时易于穿入胆总管并 且在胆总管中移行时不会轻易穿破胆总管。此外，使用此穿刺针的另一好处在于穿刺失败 后，采用此针进行局部灌注的效果很好。纯化的步骤中采用的LSM?实际上为配制好并经 过过滤的淋己细胞分离液，100ml的IJM⑥中含有9. 4g的泛影葡胺及6. 2g的Ficoll，其 在20°C下的密度介于1. 077-1. 080之间，与膜岛密度相似。且LSM⑩的渗透压与膜岛细 胞的渗透压相近，故而能在一定程度上保护膜岛功能。本发明中采用LgM⑧分离结合手 工挑选法所得膜岛纯度显著高于单纯手工挑选法，其主要是因为LSM⑥本身就是膜岛的 一种纯化方法，在该法的基础上进一步进行手工挑选后，膜岛的纯度会明显提高。本发明中 LSM?分离后所得膜岛的膜岛素分泌能力在高糖和低糖情况下存在着显著的差异，提示 其膜岛的分泌功能保存完好。
【附图说明】
[0022] 图1为胆总管穿刺针的结构示意图；
[0023] 图2:不同纯化方法对膜岛产量的影响，CON代表单纯手工挑选法纯化膜岛组， LSM⑩代表采用LSM?密度介质离屯、分离结合手工挑选法纯化膜岛组；与对照组相比， P= 0. 016 ;
[0024] 图3:不同纯化方法对膜岛形态的影响，CON代表单纯手工挑选法纯化膜岛组， L沒1础@代表采用LSM?密度介质离屯、分离结合手工挑选法纯化膜岛组；
[00巧]图4 :分离纯化膜岛的DTZ染色，CON代表单纯手工挑选法纯化膜岛组，L沒M?代 表采用DgM;愈密度介质离屯、分离结合手工挑选法纯化膜岛组。其中被染成猩红色的为膜 岛细胞团，呈黄色的为非膜岛细胞团； 阳0%] 图5 :分离纯化膜岛的A0/PI染色，CON代表单纯手工挑选法纯化膜岛组，LSM? 代表采用LSM?密度介质离屯、分离结合手工挑选法纯化膜岛组。其中绿色巧光的为膜岛 内的活细胞，红色巧光为膜岛内调亡或者死细胞；
[0027]图6:不同纯化方法对膜岛分泌膜岛素能力的影响。在对照组中，高糖下的膜岛素 浓度与低糖下的膜岛素浓度相比^ = 0. 005 ;在LSM⑧分离组，高糖下的膜岛素浓度与低 糖下的膜岛素浓度相比邮=0. 002 ;在低糖情况下，采用LSM?分离所得膜岛的分泌能力 低于对照组（P= 0. 029)。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。
[0029] 实施例
[0030] 材料：实验动物为已死亡的6-8周龄雄性ICR小鼠，体重25-40g，购自扬州大学比 较医学中屯、，喂养于东南大学实验动物中屯、。
[0031] 试剂：RMPI1640培养基（gibco公司），胎牛血清（gibco公司），胶原酶V(Sigma 公司），双硫腺（国药集团化学试剂有限公司），细胞调亡叮晚澄染色检测试剂盒（凯 基生物），细胞调亡PI染色试剂盒（凯基生物），青、链霉素曲clone公司），LSM⑩ (LymphotcyteS巧arationMedium,美国MP公司），小鼠膜岛素定量分析酶联免疫检测试剂 盒（上海巧伊生物科技有限公司）。
[0032] 实验仪器：培养箱（ThermoScientific公司），超净工作台（Airtech公司），恒溫 水浴锅（化ystal公司），相差显微镜（CarlZeissJena公司），低速离屯、机（科大创新股份 有限公司中佳分公司），体式显微镜（上海蔡康光学仪器有限公司），巧光显微镜（OLYMPUS， BX53)多用途旋满混合器（ScientificIndustries公司）。
[0033] 小鼠膜岛分离纯化方法为：
[0034] 步骤1，穿刺针的制备：将膜岛素注射器1 (本实施例中采用舒锐牌一次性使用无 菌膜岛素注射器）从1抓处剪开，剪刀修整断口处；取出一个0. 1-lOul枪头2,在酒精灯上 烧灼该0. 1-lOul枪头2与移液枪相接的一端，然后迅速将该0. 1-lOul枪头2与膜岛