素注 射器1的断口处进行禪合；烧灼另一个1-200U1枪头，用其溶解物对上述的0. 1-lOul枪头2 和膜岛素注射器1的禪合处进行加固密封；另取一根一次性使用的静脉输液针3,将其针头 剪去，一端连接上述已经烧灼禪合的0. 1-lOul枪头2,另一端连接一个5ml注射器4,最后 将膜岛素注射器1自带的针头5斜面朝上弯曲约60°。制作成的穿刺针结构如图1所示。
[0035] 步骤2:小鼠膜岛的分离：将已死亡的小鼠血液充分放尽（血液会影响胶原酶的消 化）。将小鼠喷洒75%的酒精消毒后行"V"型切口打开腹腔，将空回肠及结肠翻转至小鼠 身体右侧，充分暴露胆总管及十二指肠。在十二指肠处结扎胆总管，然后在靠近肝脏肝总管 和胆囊管汇合的"V"字型接口处进行穿刺，穿刺成功后用动脉夹夹闭穿刺针尾端胆总管避 免胶原酶反流。将5ml预冷的胶原酶V(浓度为Img/ml)徐徐灌入膜腺，使其充分膨胀。随 后迅速取下灌注好的膜腺，置于含有3ml胶原酶V(浓度为Img/ml)的离屯、管（15ml)中， 于38°C恒溫水浴箱中静止消化17min。消化结束后在多用途旋满混合器上幹旋3次，每次3 秒。随后，在离屯、管中加满预冷的Hanks平衡盐溶液终止消化。并于低速离屯、机上1000巧m 离屯、2min，冲洗2次。离屯、后弃上清，将沉淀组织用预冷的Hanks平衡盐溶液重悬后40目 无菌金属筛网过滤，收集过滤后的组织悬液。
[0036] 步骤3，小鼠膜岛的纯化将组织悬液再次离屯、后加入JLSM? (平均每只小鼠膜腺 加入7mlLSM? )并用滴管充分吹打混悬。将混悬好的组织悬液于2000rpm条件下离屯、 20min，离屯、结束后膜岛存在于上清当中。将上清转移至50ml离屯、管，加入预冷的Hanks平 衡盐溶液至50ml后于1300巧m条件下离屯、5min，离屯、结束后膜岛沉于管底。将膜岛加入 SmlHanks平衡盐溶液重悬后置于体式显微镜下进一步手工挑选法进行纯化。最后将纯化的 膜岛移入含有完全培养基（RMPI1640含15%质量含量的胎牛血清）中进行培养。
[0037] 步骤4,小鼠膜岛的鉴定：纯度鉴定：取100ml双硫腺粉末溶解于lOmlDMSO中， 0.22μm孔径滤器过滤，-20°c避光保存。临用时用Hanks液1:100稀释，并将培养的膜岛 换液后加入稀释好的DTZ染液于37°C下染色15min。从含有膜岛的悬液中重复取样3次， 每次200ul，滴于3. 5cm直径培养皿中，计数红染的细胞团数目。膜岛的纯度按照公式：膜 岛纯度=红染细胞团数/所有细胞团数X100%来进行计算。数据W均数+标准差的形式 表示。活力鉴定：准备好样品稀释液，将培养的膜岛（100个）换液后，使用1ml样品稀释液 重悬，随后将膜岛混合物转移至1. 5ml罔心官,200化pm罔心5min后弃上清，加入90y1样 品稀释液重悬，分别加入A0 (日丫晚澄，Acridine化ange)染液及PI(舰化丙晚，Propidium Iodide)染液各5μ1，室溫条件下避光染色15min。随后将膜岛滴加于载玻片上，在巧光显 微镜下分别在激发滤光片波长488nm和536nm的条件下观察。绿色标记的为活细胞，红色 标记的为死细胞。
[0038] 步骤5,小鼠膜岛功能的鉴定：将分离纯化的膜岛接种于24孔板，每孔20个 膜岛，每个糖浓度设置3个复孔。37°C培养箱培养过夜后，用无糖的KRBB? (119mmol/L 化Cl, 4. 74mmol/LKCl, 2. 54mmol/L化CI2, 1. 19mmol/LMgClz, 1. 19mmol/LKH2PO4, 25mmol/ LNaHC〇3，10mmol/L肥阳S，PH7. 4,含0. 5%BSA)缓冲液润洗后再用含5mmol糖的KRBB 缓冲液预解育0.化，再用无糖的KRBB缓冲液冲洗后分别在含有不同糖浓度的KRBB缓冲液 (0.5mL)中进行解育化，结束后收集上清，用酶联免疫吸附法测定上清中膜岛素的浓度（具 体实验步骤按照试剂盒的说明书进行操作，实际操作时将样品稀释40倍后进行检测）。
[0039] 步骤6,统计学分析：采用SPSS21. 0软件进行分析。实验所得数据W均数+标 准差的形式表示，组间比较采用独立样本t检验进行比较，p<0. 05则认为具有统计学差异。
[0040]结果：
[0041] (1)小鼠膜岛的产量与形态：
[0042]采用曠分离所得的膜岛形态大小不一，直径在50-300μm之间，大部分呈现 扁楠圆形，折光性好。与单纯手工挑选法（123. 67 + 9. 61个膜岛）相比，采用L&M?分离 每只老鼠可得95. 33 + 7. 50个膜岛，产量略低于手工挑选法，差异具有统计学意义（图2)。 在形态上采用LSM⑥分离所得膜岛包膜的完整性及平滑性略差于手工挑选法（图3)。 阳0创 似小鼠膜岛的纯度
[0044] 经分离纯化的膜岛经DTZ染色后，膜岛被染成猩红色，而非膜岛团块则未被染色 (图4)。与单纯手工挑选法（79. 25 + 5. 50% )相比，采用LSM?分离所得膜岛纯度平均 约92. 57 + 1. 34%，其纯度显著高于单纯手工挑选法，差异有统计学意义（P= 0. 015)。分离 纯化的膜岛经A0/PI染色后，膜岛内的活细胞被染上绿色，调亡或者死细胞被染成红色（图 5)，单纯手工挑选法与采用LSM⑥分离所得膜岛活力并没有明显差异。 柳45] 做小鼠膜岛的分泌能力
[0046] 采用LSM⑩分离所得膜岛在低糖（2.8mmol/L)和高糖（20mmol/L)刺激下膜岛 素分泌量分别为66. 05 + 13. 3化g/ml和256. 08 + 46. 1化g/ml，高糖下的膜岛素水平为低 糖下的3.88倍，差异具有统计学意义（P=0.002)。而采用单纯手工挑选法所得膜岛在 低糖（2.8mmol/L)和高糖（20mmol/L)刺激下膜岛素分泌量分别为119.43 + 24. 2化g/ml和226. 70 + 21. 6化g/ml，高糖下的膜岛素水平为低糖下的1. 90倍，差异具有统计学意义 (P= 0. 005)。与单纯手工挑选法相比，低糖浓度下LSM⑧分离所得膜岛的膜岛素分泌 能力显著低于手工挑选法（119. 43 + 24. 2化g/mlVS66. 05 + 13. 30ng/ml，P= 0. 029);然 而，在高糖浓度下两种分离方法下膜岛素的分泌水平却并无差别（226. 70 + 21. 6化g/mVS 256. 08 + 46.l：3ng/ml，p= 0. 374)，具体结果见图 5。
[0047] 采用上法总体耗时约80min，多只老鼠同时提取膜岛可W节省时间；此法每只老 鼠平均可得膜岛95.33+ 7. 50个，纯度92. 57 +1. 34%，活力与手工挑选法相比无差异；此 法获得的膜岛在低糖（2.8mmol/L)和高糖（20mmol/L)刺激下上清中膜岛素的水平分别为 66. 05 +13. 30ng/ml和 256. 08 + 46.l：3ng/ml(P= 0. 002)。
[0048] 采用此法在大规模的提取膜岛时可W很大程度的节省时间，提高穿刺成功率，减 少Ficoll400配制的时间及价格。同时，纯化所得膜岛产量、纯度、活力及膜岛功能都相对 良好，是一种简单快捷，廉价高效的小鼠膜岛分离方法。
[0049]W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，运些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种小鼠膜岛分离纯化方法，其特征在于：包括W下步骤： (1) 穿刺针的制备：将膜岛素注射器从1抓处剪开，剪刀修整断口处，取出一个枪头，在 酒精灯上烧灼该枪头与移液枪相接的一端，然后迅速将该枪头与膜岛素注射器的断口处进 行禪合；烧灼另一个枪头，用其溶解物对上述枪头和膜岛素注射器的禪合处进行加固密封； 另取一根静脉输液针，将其针头剪去，然后将静脉输液针的一端连接上述已经烧灼禪合的 枪头，另一端连接一个注射器，最后将膜岛素注射器自带的针头斜面朝上弯曲60° ; (2) 小鼠膜岛的分离：将已死亡的小鼠血液充分放尽，喷洒酒精消毒后，行"V"型切口 打开腹腔，将空回肠及结肠翻转至小鼠身体右侧，充分暴露胆总管及十二指肠；在十二指肠 处结扎胆总管，然后在靠近肝脏肝总管和胆囊管汇合的"V"字型接口处用步骤（1)制得的 穿刺针进行穿刺，穿刺成功后用动脉夹夹闭穿刺针尾端胆总管避免胶原酶反流；将预冷的 胶原酶V灌入膜腺，使其充分膨胀；随后迅速取下灌注好的膜腺，置于含有胶原酶V的离屯、 管中，于38°C恒溫水浴箱中静止消化17min;消化结束后在多用途旋满混合器上幹旋3次， 每次3秒；随后，在离屯、管中加满预冷的Hanks平衡盐溶液终止消化；并于低速离屯、机上 100化pm离屯、2min，冲洗2次；离屯、后弃上清，将沉淀组织用预冷的Hanks平衡盐溶液重悬 后40目无菌金属筛网过滤，收集过滤后的组织悬液； (3) 小鼠膜岛的纯化：将组织悬液再次离屯、后加入LSM⑩并用滴管充分吹打混悬；将 混悬好的组织悬液于2000rpm条件下离屯、20min，离屯、结束后膜岛存在于上清当中；将上清 转移至离屯、管，加入预冷的Hanks平衡盐溶液后于1300巧m条件下离屯、5min，离屯、结束后膜 岛沉于管底；将膜岛加入Hanks平衡盐溶液重悬后置于体式显微镜下进一步手工挑选法进 行纯化；最后将纯化的膜岛移入含有完全培养基中进行培养。2. 如权利要求1所述的小鼠膜岛分离纯化方法，其特征在于：步骤（2)中，将5ml浓度 为Img/ml预冷的胶原酶V灌入膜腺。3. 如权利要求1所述的小鼠膜岛分离纯化方法，其特征在于：步骤（2)中，灌注好的膜 腺置于含有3ml浓度为Img/ml的胶原酶V的离屯、管。4. 如权利要求1所述的小鼠膜岛分离纯化方法，其特征在于：步骤（3)中，平均每只小 鼠膜腺加入7ml的UM饭。5. 如权利要求1或4所述的小鼠膜岛分离纯化方法，其特征在于：步骤（3)中，所述 LSM?为配制好并经过过滤的淋己细胞分离液，100mL的LSM?中含有9. 4g的泛影葡 胺及6. 2g的Ficoll,其在20°C下的密度介于1. 077-1. 080之间。6. 如权利要求1所述的小鼠膜岛分离纯化方法，其特征在于：步骤（3)中，所述完全培 养基为含15%胎牛血清的RMPI1640。
【专利摘要】本发明公开了一种小鼠胰岛分离纯化方法，采用自制的穿刺针由胆总管逆行穿刺并灌注胶原酶Ⅴ消化胰腺，使用一种密度梯度介质离心结合手工挑选的方法分离纯化胰岛。双硫腙染色鉴定胰岛纯度，AO/PI染色鉴定胰岛活力。葡萄糖刺激的胰岛素释放实验检测胰岛功能。采用此法在大规模的提取胰岛时可以很大程度的节省时间，提高穿刺成功率，减少Ficoll400配制的时间及价格。同时，纯化所得胰岛产量、纯度、活力及胰岛功能都相对良好，是一种简单快捷，廉价高效的小鼠胰岛分离方法。
【IPC分类】C12N5/071
【公开号】CN105368771
【申请号】CN201510886141
【发明人】李伟, 孙子林, 徐伟, 陈娟, 王晓航
【申请人】东南大学
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年12月4日